酵母双杂交技术筛选与Fbxl16相互作用的蛋白质-药学论文-论文联盟
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酵母双杂交技术筛选与Fbxl16相互作用的蛋白质
作者：成祖伟 罗卓荆
【摘要】& 目的: 寻找体内能够与Fbxl16相互作用的蛋白质,用以揭示该蛋白的功能及其在脊髓损伤修复过程中的作用. 方法 : 通过RT?PCR技术克隆scirr1基因编码区序列,将其克隆入pSos载体以构建质粒pSos?scirr1. 把该重组质粒表达的融合蛋白hSos?Fbxl16作为诱饵蛋白,用改良的酵母双杂交技术筛选大鼠脑cDNA文库中能与Fbxl16相互作用的蛋白质,最后用酵母双杂交回转实验对获得的相互作用的可靠性加以验证. 结果: 成功构建了融合蛋白表达质粒pSos?scirr1之后,筛选出了14个与Fbxl16阳性相互作用的蛋白质；通过回转实验验证,确定其中两个蛋白能与Fbxl16相互作用,分别是cAMP依赖蛋白激酶α型催化亚基（protn kinase, cAMP?dependent, catalytic, alpha, Prkaca)和衣被蛋白复合物ζ亚基（coatomer protn complex, subunit zeta 1, Copz1). 结论: Fbxl16和Prkaca的相互作用为解释cAMP通路与脊髓损伤的关系提供了新思路，提示Fbxl16与细胞内物质转运有关.
【关键词】& 脊髓损伤 Fbxl16 蛋白质相互作用 Prkaca Copz1
&&& Fbxl16,又称Scirr1,是一个新发现的蛋白质, 计算 生物学 研究 结果表明它具有“F?box+LRR”结构域,在脊髓损伤后表达明显增加［1］. 为了研究该蛋白的功能以及在脊髓损伤修复中的作用,我们通过RT?PCR技术克隆出scirr1基因编码区序列,将其克隆入pSos载体以构建质粒pSos?scirr1. 把该重组质粒表达的融合蛋白hSos?Fbxl16作为诱饵蛋白,用改良的酵母双杂交技术筛选大鼠脑cDNA文库中能与Fbxl16相互作用的蛋白质,最后用酵母双杂交回转实验对获得的相互作用的可靠性加以验证,以期找到能与Fbxl16相互作用的蛋白质.
&&& 1材料和方法
&&& 1.1材料成年雄性Wistar大鼠1只,体质量220~250 g,由军事 科学 院提供. PCR引物由上海生工合成. 质粒提取和PCR产物回收试剂盒购自Stratagene公司. Taq DNA聚合酶、DNA连接酶、NcoI和SalI内切酶购自Qiagen公司. 酵母双杂交试剂盒CytoTrap? XR Premade Libraries kit购自Stratagene公司.
&&& 1.2方法
&&& 1.2.1RT?PCR克隆scirr1基因编码区序列用Trizol方法提取大鼠脊髓总RNA；上、下游分别引入NcoI和SalI酶切位点设计scirr1引物,上游：5?GAG CCA TGG TGA TGT CGA GCC CTG GTA TC?3,下游： 5?GAC GTC GAC CTA TTC AAT GAC GAG GCA GC?3, RT?PCR扩增scirr1基因编码区. 用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物,按标准程序纯化回收以及酶切目的条带中的DNA产物,送上海生工测序.
&&& 1.2.2构建融合表达质粒扩大培养pSos质粒的保存菌种,采用DNA抽提试剂盒提取pSos质粒,用NcoI/SalI双酶切并纯化回收质粒. 将线性化质粒和酶切后的scirr1编码区DNA行10 g/L琼脂糖凝胶电泳,成像拍照后,采用TotalLab进行定量. 将线性化质粒和酶切后的scirr1编码区DNA按照1∶7的摩尔比进行重组连接,将重组载体转化感受态BL21型大肠杆菌,酶切鉴定后送上海测序鉴定.
&&& 1.2.3酵母双杂交文库筛选使用诱饵质粒pSos?scirr1,温度敏感型cdc25H酵母突变株和5个对照质粒(pSos, pMyr?Lamin C, pSos?MAFB, pMyr?MAFB和pMyr?SB) 进行酵母双杂交预实验,用以排除Fbxl16的毒性和自激活. 之后按照酵母双杂交手册以pSos?scirr1为诱饵质粒筛选大鼠脑cDNA文库pMyr?cDNA. 筛选与Fbxl16阳性相互作用的cDNA融合质粒,这些质粒将用于下一步的回转验证.
&&& 1.2.4回转验证阳性相互作用将筛选出的每个cDNA融合质粒分别与pSos?scirr1共转化入酵母突变株进行回转验证. 在葡萄糖和半乳糖培养基上都不生长的克隆是假阳性相互作用克隆；在葡萄糖缺陷培养基上不生长而在半乳糖缺陷培养基上生长的克隆是真阳性相互作用克隆. 之后从验证为真阳性的克隆中提取cDNA融合质粒，扩大培养后纯化、测序, 从NCBI数据库中查出该cDNA对应的蛋白质. 该蛋白就是能够与Fbxl16相互作用的蛋白质.
&&& 2.1融合蛋白表达质粒的构建引入NcoI和SalI酶切位点,将RT?PCR得到的scirr1基因编码区片段克隆入pSos空载体,构建出融合蛋白表达质粒pSos?scirr1（图1）.
&&& M1: DNA marker DL15 000; M2: DNA marker DL2000; 1: NcoI和SalI双酶切重组质粒pSos?scirr1.转贴于论文联盟
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酵母进化帮助人们理解癌症机制
酶联免疫试剂盒-齐一生物理解酵母适应的动力学可以帮助人们理解其他系统，如癌症中的基因突变动力学的了解。基因指导身细胞，优化它们在身体内的功能。基因的微小变化（即突变）可能产生重大后果。类似于计算机编码中的故障，基因编码中的故障可能导致细胞系统的混乱。但不是所有的突变都是坏的，适应性进化过程会选择型保留那些在酵母菌种群和癌症中促进细胞快速、甚至不加控制的生长的突变。随着癌细胞一代代地复制，许多突变被传递给后代。其中一些只是&搭便车& 的，基本无害，其他是&驱动型&突变，要为癌症的生长负责。这种驱动型突变可能是癌症最大的优势，但也可能是其致命弱点：通过对驱动癌症生长的突变进行靶向治疗可以抑制癌症的生长。精密医学就提出使用基因组测序来鉴定负责驱动患者癌细胞的突变，然后抑制其表达。但是为了实现这一点，必须能够鉴别导致癌症突变，但这个过程困难得近乎大海捞针。一个可能的解决方案是：去找更小的海。利哈伊大学生物科学助理教授 Gregory Lang 及其团队正在探索基因组如何使用酵母实验室进行数千年的发展，酵母的基因组数量是人类的千分之一。他们的就是烘焙和酿造啤酒中使用的那种酵母。酵母可迅速生长和复制，已经成为研究无性种群适应性进化的良好的模式系统。&酵母每 90 分钟就可以繁殖一代，24 小时内可以繁殖十几代，& Lang 说。 &与人类癌细胞不同，我们可以在实验室中培养数百个相同的酵母菌种群，然后将其培育数千代。Lang 和他的同事们最近采用了这样一个大规模的方法来量化来自 11 个实验进化的酵母菌群的 116 个突变的增长的影响。他们发现成功的突变只有 20%是驱动型的; 其余的都是搭便车的。他们的结果已经在《美国国家科学院院刊》（PNAS）上发表，他称：&搭便车和上位点引起队伍动态适应人群&，由 Sean W. Buskirk 和 Ryan Emily Peave 共同撰写。&如果你想得到一个促进生长的重要的突变谱图，那就需要对个体突变进行全面的研究。要再人类基因上进行非常困难。&Lang 说。 &在我们用酵母的实验中，我们能够&洗牌&来隔离数千个孢子，所有这些孢子都来自同一个祖先，每个孢子都有随机组合的进化突变，这种大规模的方法使我们能够测量每种突变带来的适合度改变，我们可以量化某些突变或突变的组合对生长的重要程度。&用&洗牌&了解基因突变一旦 Lang 和同事对酵母基因进行了洗牌，他们就用全基因组测序来推断哪些突变或突变的组合推动了生长。&搭便车的那些基因突变的频率不会增加，驱动者则会以适合度增加的成正比的速度增加。&Lang 的方法可以测量所有突变的影响，从而能够识别更加微妙的动态变化。通过直接测量 1,000 代单株酵母菌株中所有突变的适应性影响，研究人员能够明确地鉴定和定量出影响适合度的驱动型突变。&我们的结果与以前基于重复出现的方法进行了比较，我们发现此前遗漏了一些&弱&或小的效应，以及那些罕见突变，&Lang 说。尽管酵母基因已经被广泛研究过，但此前人们没有研究过基因间的相互作用。该小组找到一个突变组，其中突变组合带来的适合度增加大于全体基因突变的效应的总和。 换句话说，传递下来的两个突变的交互作用对生长产生了积极的影响，而当突变单独出现，则没有显著的效果。Lang 认为和他们在酵母中发现一模一样的突变不太可能出现在癌症中。然而理解酵母适应的动力学可以帮助人们对其他系统，如癌症中的基因突变动力学的了解。
(来源：齐一生物科技（上海）有限公司)
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【原创】实验日志：酵母双杂交&[精华]
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谢谢大家的关注，对照试验，自激活试验，毒性试验已经结束，做个小结：1，对照试验。正如King所说的，阳性对照真的是非常强，mating后在双缺板上长的很漂亮，DDO/X 板上蓝色， DDO/X/A 也是蓝色。重新划线以后，长的也不错，已经保菌。遇到的问题是：阴性对照居然在DDO/X/A上也有生长，只是克隆为白色或者粉红色。打电话问技术支持，回复说可能是背景生长，只要不显蓝色就没关系。感觉这个解释不够有力，那那个金担子素的作用是什么嘞？没有感觉明显的量上的差别。最奇怪的事情是，偶然发现阴性对照在放到4°后一段时间，居然也开始显蓝色了。解决办法：将分别单转了 T
lam的菌铺相应的单缺板，并且加入X/A 看看结果怎么样？并且重复一次对照试验
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2， 毒性试验这个在转化的时候顺带就做了，空载体pGBKT7 跟 诱饵质粒，无论从克隆数量，还是大小上都没有明显的差异。
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3，自激活实验和阴性对照的情形相同，SD/X板上没有变蓝色，但是在SD/X/A上也有生长，仍然为白色或者粉红色。
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小结完毕请教两个问题：1，大家保菌的时候是怎么操作的？我挑转化后的单克隆到3ml 相应的选择培养基中（先在1ml 离心管内充分振荡打碎细胞团块，再转入试管中），30° 250rpm震荡过夜培养后，加入终浓度为25%甘油，-70°保存。 发现过夜培养后，SD/-TRP当中的菌都有点泛粉红色，有没有影响呢？DDO
SD/-LEU都很正常。2，分别构建 pGBKT7-A
pGADT7-B 质粒，并转化相应的酵母菌，mating后，验证蛋白相互作用。A B是两个已经明确报道有相互作用的蛋白。结果跟阴性对照的结果很相似，king同学的意见时相互作用比较弱，现在已经观察了一个星期了，还是没有变蓝。测序结果反应两个蛋白序列都没有问题，还可能会是什么原因呢。不是说Y2H是一种很敏感的检测方法吗，优势就在于能够发现那些弱的，瞬时的蛋白间相互作用。谢谢大家
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1、变粉色是因为你在YPD里面没有加上Adenine的原因吧，我的AH109酵母系在YPDA或SD/-Trp液体培养基里面摇出来是白色的，之前我尝试只用YPD培养AH109酵母系，也出现粉色的情况。2、如果相互作用很弱，放至半个月才变蓝都是有可能的。其实还有个方法看是不是有激活作用，就是用ONPG法直接测β-Gal酶活，有些蛋白互作比较弱，放置时间过短没变蓝，但是这个时候你测量测酶活后就可以看出和阴性对照之间的差异了，毕竟T7-T和T7-53之间的互作是非常强的，实际做实验的时候很多有相互作用的蛋白比它们弱很多，我就遇到过这种情况，测量β-Gal酶活后就可以看出明显的差异了。
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havocking 1、变粉色是因为你在YPD里面没有加上Adenine的原因吧，我的AH109酵母系在YPDA或SD/-Trp液体培养基里面摇出来是白色的，之前我尝试只用YPD培养AH109酵母系，也出现粉色的情况。2、如果相互作用很弱，放至半个月才变蓝都是有可能的。其实还有个方法看是不是有激活作用，就是用ONPG法直接测β-Gal酶活，有些蛋白互作比较弱，放置时间过短没变蓝，但是这个时候你测量测酶活后就可以看出和阴性对照之间的差异了，毕竟T7-T和T7-53之间的互作是非常强的，实际做实验的时候很多有相互作用的蛋白比它们弱很多，我就遇到过这种情况，测量β-Gal酶活后就可以看出明显的差异了。1，我用相应的选择培养基保菌，比如用SD/-TRP/-LEU Broth 摇DDO上的克隆，用SD/-TRP 摇转化了诱饵质粒的克隆，结果呈现粉红色。难道你都是用YPDA broth来保菌的吗，据说有一点选择压力，可以防止质粒的丢失。2，你说的这个方法我查了下，操作的步骤如下。β-半乳糖苷酶（ONPG）的测定本试验应用于肠肝菌科的鉴定。测定步骤：（1） 将测定菌接种于TSI斜面上，培养于37℃18h（或其他最适温度）（2） 挑取1大环菌苔入约0.25mL的生理盐水中制成菌悬液，每管加1滴甲苯，摇匀（有助于酶的释放），于37℃放置5分钟。（3） 在菌悬液中加入0.25mL的0.75mol/L ONPG，测定管置于37℃水浴培养。经30分、1、2、3、……24h进行观察，如有黄色者则为阳性。是针对细菌的，针对酵母的细胞壁也适用吗？可否提供你的PROTOCAL，谢谢KING：）另外，为什么要测B-gal的活性，报告基因不是X-gal吗？
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小满 编辑于
提供一个简便的菌落PCR步骤，是从丁香园看到略加改进了下：1，挑4-6个健康克隆，涂抹在1.5 ml 离心管内壁，用接种环上剩下的菌在相应选择平板上划线，如果4个克隆的话，正好把一块板4等分，记得对应好编号。2，离心管，放入微波炉内中火，1min ----&-20°
5min ---------&中火1min------&-20° 5min-------& 中火 1min
3，加入20微升无菌水重悬，取2微升作为模板，进行PCR反应。我已经验证过了，挑了4个克隆，都P出了目的条带。
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小满 编辑于
小满 1，我用相应的选择培养基保菌，比如用SD/-TRP/-LEU Broth 摇DDO上的克隆，用SD/-TRP 摇转化了诱饵质粒的克隆，结果呈现粉红色。难道你都是用YPDA broth来保菌的吗，据说有一点选择压力，可以防止质粒的丢失。2，你说的这个方法我查了下，操作的步骤如下。β-半乳糖苷酶（ONPG）的测定本试验应用于肠肝菌科的鉴定。测定步骤：（1） 将测定菌接种于TSI斜面上，培养于37℃18h（或其他最适温度）（2） 挑取1大环菌苔入约0.25mL的生理盐水中制成菌悬液，每管加1滴甲苯，摇匀（有助于酶的释放），于37℃放置5分钟。（3） 在菌悬液中加入0.25mL的0.75mol/L ONPG，测定管置于37℃水浴培养。经30分、1、2、3、……24h进行观察，如有黄色者则为阳性。是针对细菌的，针对酵母的细胞壁也适用吗？可否提供你的PROTOCAL，谢谢KING：）另外，为什么要测B-gal的活性，报告基因不是X-gal吗？1、在SD/-Trp的液体培养基里面我没有观察到AH109会变粉色的情况，保存转入质粒的酵母系时，最好加入点选择性压力比较好点。2、见clonetech出的Yeast Protocol Handbook，page27-28就是教你如何使用ONPG法定量测定β-Gal活性。你说的这种检测和它原理差不多，但是只是定性而没有定量，你可以参照手册上的这个方法直接对β-Gal活性定量，这样比通过肉眼观察来得更有说服力。如果有互作，这种互作可以激活α-Gal和β-Gal，其中α-Gal可以分泌到胞外分解X-α-Gal使之显蓝色，就是我们直观看到的；而β-Gal是不能分泌到胞外的，所以只能裂解酵母细胞后通过ONPG来使之显色，最后测量OD420的值，通过公式换算出实际的酶活单位。这两者都可以用来检测是否有互作，前者直观观察属于定性，后者通过酶活多少来衡量，属于定量。一般在提交有互作证据的时候，最好两个结果都给出吧。
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小满 提供一个简便的菌落PCR步骤，是从丁香园看到略加改进了下：1，挑4-6个健康克隆，涂抹在1.5 ml 离心管内壁，用接种环上剩下的菌在相应选择平板上划线，如果4个克隆的话，正好把一块板4等分，记得对应好编号。2，离心管，放入微波炉内中火，1min ----&-20°
5min ---------&中火1min------&-20° 5min-------& 中火 1min
3，加入20微升无菌水重悬，取2微升作为模板，进行PCR反应。我已经验证过了，挑了4个克隆，都P出了目的条带。可以简化下，如果是转入的大肠杆菌，直接挑单克隆菌落于300微升加入抗生素的培养基中，37°高速培养2-3hr，取0.5-1微升菌液直接用来做PCR，预变性的温度4min，之后和普通PCR一样，大肠杆菌是很好破壁的。如果是酵母细胞，以上方法也行，不过为求保险，可以尝试用液氮冷冻30sec，37°处理30sec，反复2-3次，加速酵母细胞的破壁，完后取1微升PCR，效果也同样很好。不过如果你转入的质粒是低拷贝的，可以适当延长下培养的时间。
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筛完库了，总结一下，继续跟大家交流。步骤操作手册上都有，就不多说了。筛库前，做了文库滴定，滴度超级高，mating efficiency也很高，按照说明，一共涂了57个150mm的板子，硕大的工程呀！对了，涂板子的时候发现一个问题：按照操作步骤每板涂200 UL 菌的浓度还是太高，涂的成片成片的，有些地方单克隆根本分不开，但是如果稀释浓度增加的话，意味着板子数目也得增加，这……这……这……简直是非人的工作。涂板3天以后，DDO/X/A板子上阳性克隆就长出来了，虽然因为涂板的原因损失不小，但还是挑了1000左右各蓝色克隆到四缺板QDO/X/A上，又三天，剩下不到500个克隆了，目前正在进行菌落PCR鉴定。提到菌落PCR，我定了一个clontech的mix据说对于酵母菌落PCR效果尤其好，验证了一下，果然比普通MIX p出来的条带亮，看下面的图，左边是用advantage 2 mix P出来的，右边是用普通MIX p出来的。接下来的工作怎么展开呢，有点迷茫，PCR基本快摇结束了，感觉大部分都是一条很亮的条带，大小在BP之间，再大一点的地方有一条比较弱的条带，应该算含2个还是1个呢？总不能统统送去测序吧？（图照的不是很清楚，其实在多数比较亮的条带上面还有条比较浅的条带，照片上看不出来）希望高手给支个招啊。先谢谢啦。感谢深入讨论~~~加分鼓励！欢迎继续！
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SmallDonkey 编辑于
貌似一张帖子只能贴一张图哦。下面晒晒我的四缺板。把二缺板上的阳性克隆挑到四缺板上的方法跟大家分享下，本人觉得还是比较方便的。首先在一张白纸上，把100的板子等分成若干1cm X 1cm的小格子，大约能分成50多个。然后把白纸上的圆形剪下来，正好装进平皿的盖子里，这样每次挑克隆的时候拿个新鲜的四缺板放在垫了白纸的盖子里，就不容易移动了。挑克隆的时候，用小枪头蘸一点点菌（显蓝色的单克隆）稀释在5 微升无菌水里，然后把5 微升的无菌水打在一个小方格里，就OK啦。浩大的工程啊！！贴个图吧，最上面一排是阳性对照，最下面一排是阴性对照，中间是样品，1000个呀，转的我眼都快瞎了！！！呵呵……
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x-α－gal筛选的容易出现假阳性，我曾经看到过一些资料上说，如果多个菌落连在一起的话，即使是阴性的，在菌落交界处也容易出现蓝色。所以，我觉得，最好能划线得到蓝色的单菌落，这才是完美的结果，呵呵。下面是我的图片，我用的是老版本的试剂盒，用的是QDO＋x-α－gal板子筛选，没有那个传说中的抗生素，^_^
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有没有人用Invitrogen的ProQuest系统啊，呵呵
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看来筛库还真的很麻烦的说，小满师姐，你进度还是蛮快的勒，呵呵，希望可以整理下，再上些好图，指导我们这些新手，呵呵我试验刚刚开始就遇到了困难，我把GOLD菌取了50微升摇，30度，250转，16小时结果什么都没摇出来，清亮无比，额滴神，额滴菌，在室温下放置大半天，居然混了，而且还有酒味，不知道为什么？（YPD的配置没问题，高压也没问题，我进行了2次，一次是分开压，一次是一起压，觉得关系不大，可以一起高压，只是一定要115度，15-20分钟比较好！）后来，试着用原始菌先划板YPD，30度倒置培养，2天长出了蛮大的菌，第三天的时候，足足长到了3-4mm，又大，又圆，但有点带红色（培养基里面没加腺嘌呤），随后分别挑了单克隆和三克隆，分别转至3ml的YPD培养基，30度，摇床260转，培养过夜，16小时，摇出了菌，单克隆的那瓶没有三个克隆的那瓶混，（不知道可以挑三个克隆不？？？？）然后由于测OD600的机器坏了，所以就估计了下OD600（取了10ul菌涂片，在显微镜下观察的，一个视野一半以上的菌，估计的，呵呵，不知道可以不！！！！）,大概达到了0.6左右，然后将菌液4000rpm，4度离心机离心5min，弃掉上清，然后用高压的双蒸水洗涤，再离心，条件同上，进行2次，最后在沉淀里面加入500ul 高压灭菌过的25％的甘油保种。师兄师姐，不知道做法对不对？ 呵呵，希望指教。DH5α已经做了20管的感受态细胞，准备把clontech里面的质粒进行转化扩增然后就可以做对照试验，自激活跟毒性试验了。万里长征的第一步，哎，没做过，还需要师兄师姐的指导帮助，要感谢，小满师姐，感谢havocking师兄对我的无私帮助，嘿嘿以后还要继续麻烦你们了，哈哈。
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panpanxp 看来筛库还真的很麻烦的说，小满师姐，你进度还是蛮快的勒，呵呵，希望可以整理下，再上些好图，指导我们这些新手，呵呵我试验刚刚开始就遇到了困难，我把GOLD菌取了50微升摇，30度，250转，16小时结果什么都没摇出来，清亮无比，额滴神，额滴菌，在室温下放置大半天，居然混了，而且还有酒味，不知道为什么？（YPD的配置没问题，高压也没问题，我进行了2次，一次是分开压，一次是一起压，觉得关系不大，可以一起高压，只是一定要115度，15-20分钟比较好！）后来，试着用原始菌先划板YPD，30度倒置培养，2天长出了蛮大的菌，第三天的时候，足足长到了3-4mm，又大，又圆，但有点带红色（培养基里面没加腺嘌呤），随后分别挑了单克隆和三克隆，分别转至3ml的YPD培养基，30度，摇床260转，培养过夜，16小时，摇出了菌，单克隆的那瓶没有三个克隆的那瓶混，（不知道可以挑三个克隆不？？？？）然后由于测OD600的机器坏了，所以就估计了下OD600（取了10ul菌涂片，在显微镜下观察的，一个视野一半以上的菌，估计的，呵呵，不知道可以不！！！！）,大概达到了0.6左右，然后将菌液4000rpm，4度离心机离心5min，弃掉上清，然后用高压的双蒸水洗涤，再离心，条件同上，进行2次，最后在沉淀里面加入500ul 高压灭菌过的25％的甘油保种。师兄师姐，不知道做法对不对？ 呵呵，希望指教。DH5α已经做了20管的感受态细胞，准备把clontech里面的质粒进行转化扩增然后就可以做对照试验，自激活跟毒性试验了。万里长征的第一步，哎，没做过，还需要师兄师姐的指导帮助，要感谢，小满师姐，感谢havocking师兄对我的无私帮助，嘿嘿以后还要继续麻烦你们了，哈哈。酵母菌在固体培养基上的生长速度远大于液体中的，所以在做原始菌的复苏的时候，最好在YPDA或者YPD的平板上划线。方法么，把原始菌从-80拿出来以后，不等融化，就用无菌的接种环挑一环菌在平板上划线，等3天后，挑单克隆保菌.多保几管，以后在用菌就从第一次保种的这里复苏，毕竟原始菌还是很珍贵的。保菌的时候，我是高压的75%的甘油，包种前跟相应的液体培养基按照2：1的比例（液体：甘油）混合，这样甘油终浓度就是25%，之后挑一个单克隆进去，震荡混匀就可以了。至于OD600么，我的经验是，单克隆，直径3MM,3ML 的 YPDA 30° 250转，培养8个小时就能达到1.5以上了，经常都1.8
1.9的样子,你的克隆那么大，摇一晚上应该不止0.6才对。而且用肉眼就很容易看出浑浊，酒香味是很正常的，如果闻到臭味才说明可能是被污染了。预祝实验顺利
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感谢小满的专题帖，使大家得以深入的讨论，欢迎大家继续参与~~~
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小满 筛完库了，总结一下，继续跟大家交流。步骤操作手册上都有，就不多说了。筛库前，做了文库滴定，滴度超级高，mating efficiency也很高，按照说明，一共涂了57个150mm的板子，硕大的工程呀！对了，涂板子的时候发现一个问题：按照操作步骤每板涂200 UL 菌的浓度还是太高，涂的成片成片的，有些地方单克隆根本分不开，但是如果稀释浓度增加的话，意味着板子数目也得增加，这……这……这……简直是非人的工作。涂板3天以后，DDO/X/A板子上阳性克隆就长出来了，虽然因为涂板的原因损失不小，但还是挑了1000左右各蓝色克隆到四缺板QDO/X/A上，又三天，剩下不到500个克隆了，目前正在进行菌落PCR鉴定。提到菌落PCR，我定了一个clontech的mix据说对于酵母菌落PCR效果尤其好，验证了一下，果然比普通MIX p出来的条带亮，看下面的图，左边是用advantage 2 mix P出来的，右边是用普通MIX p出来的。接下来的工作怎么展开呢，有点迷茫，PCR基本快摇结束了，感觉大部分都是一条很亮的条带，大小在BP之间，再大一点的地方有一条比较弱的条带，应该算含2个还是1个呢？总不能统统送去测序吧？（图照的不是很清楚，其实在多数比较亮的条带上面还有条比较浅的条带，照片上看不出来）希望高手给支个招啊。先谢谢啦。感谢深入讨论~~~加分鼓励！欢迎继续！实验做到这一步才是刚刚开始，不过你已经有了很不错的开始了。你得到将近500个克隆，肯定需要全部送出去测序滴，不测序你就无法知道和你基因互作的是些什么基因，它们在插入AD的时候有没有发生移框等等，这些都是需要通过测序才能得到明确结果的，测序后就是大规模的生物信息学的分析和归类，最终可能只能挑到极少数的基因往下做，验证单基因的功能。你可以先将PCR验证只有单个插入片段的菌落送出测序。500个克隆哦，测序都需要花上个1w，呵呵！不过如果你能在后续的测序中找到几个有用的基因，那就能对症下药了。
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做mating的时候是GOLD跟187都得用么？就是分别转进去再融合？可以都转到GOLD里面 然后直接2个GOLD融合不？ 谢谢 嘿嘿
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大家好，我也在学习做酵母双杂交技术，遇到有几个问题想请教一下大家，谢谢！一：构建诱饵的时候，针对跨膜蛋白有什么特别要求或技巧吗？比如前面大家提到的去掉蛋白N端前信号肽就可以确保目的蛋白进核及正常表达吗？我前后构建过两次，一次含跨膜区及胞内区，第二次只有胞内区的TK区，可是都表达非常弱，让我在后期的工作中信心不足！另外，看文献说构建时应加上核定位信号，这样就可以了吗？二：在确定技术的情况下，用该诱饵前后两次都没有调到东西，可是DDO显示Mating是没有问题的，这是什么原因了？是膜蛋白本身结合的就少吗？还是与我诱饵的构建有关了？三：还有大家提到的移框，不太懂！在我用另一个诱饵筛选到的一个蛋白经序列比对发现仅为某基因CDS区前的部分cDNA序列，是这种情况吗？或者，我这个筛选到的东西有意思吗？请大家多多指教，万分感谢！
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我要做一对一回复性杂交了，关于培养基的配置想请教一下大家。实验室买回来的是YPD MEDIUM 粉末，如果我要配置YPDA粉末，那么要加入腺嘌呤，腺嘌呤是该直接加到YPD中溶解后再高压灭菌，还是先配YPD培养基，然后加处理过（不知道怎么处理）的腺嘌呤呢？
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panpanxp 做mating的时候是GOLD跟187都得用么？就是分别转进去再融合？可以都转到GOLD里面 然后直接2个GOLD融合不？ 谢谢 嘿嘿不行，pGBK转Gold，pGAD转Y187，必须这样，然后做mating。两个质粒载体上分别含有TRP和LEU的编码序列，使用不同的单缺培养基筛选。
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duanduan6851 大家好，我也在学习做酵母双杂交技术，遇到有几个问题想请教一下大家，谢谢！一：构建诱饵的时候，针对跨膜蛋白有什么特别要求或技巧吗？比如前面大家提到的去掉蛋白N端前信号肽就可以确保目的蛋白进核及正常表达吗？我前后构建过两次，一次含跨膜区及胞内区，第二次只有胞内区的TK区，可是都表达非常弱，让我在后期的工作中信心不足！另外，看文献说构建时应加上核定位信号，这样就可以了吗？二：在确定技术的情况下，用该诱饵前后两次都没有调到东西，可是DDO显示Mating是没有问题的，这是什么原因了？是膜蛋白本身结合的就少吗？还是与我诱饵的构建有关了？三：还有大家提到的移框，不太懂！在我用另一个诱饵筛选到的一个蛋白经序列比对发现仅为某基因CDS区前的部分cDNA序列，是这种情况吗？或者，我这个筛选到的东西有意思吗？请大家多多指教，万分感谢！1、如果你的膜定位区域功能特别强，建议截去该段区域后连入BK载体，普通的BK载体上一般都有一段核定位的序列可以保证你的重组蛋白定位核内，实在不行那就换专门针对膜蛋白的酵母双杂交系统。2、可能原因太多了，不过mating没问题转4缺没结果，可能是文库滴度的问题吧，或者该蛋白本来就没有与之互作的对象吧，呵呵！3、建库的时候连入的外源片段是随机插入的吧，谁也不能保证这种插入是同框，这样就会产生移框的现象。如果你筛选到得cds是一部分，只要测序结果显示这部分插入序列没发生移框，那就有意义。
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稻草人逛丁香园 我要做一对一回复性杂交了，关于培养基的配置想请教一下大家。实验室买回来的是YPD MEDIUM 粉末，如果我要配置YPDA粉末，那么要加入腺嘌呤，腺嘌呤是该直接加到YPD中溶解后再高压灭菌，还是先配YPD培养基，然后加处理过（不知道怎么处理）的腺嘌呤呢？这个是havenomoney战友提供的配制方法先称好Yeast Extract 和Tryptone ，各10g/L 和20g/L ， 加水885ml/L另外称取葡萄糖20g/L，放入另一个容器内，（如果量不多，也可以用50ml离心管）加水定容至100ml。以上两个瓶子同时灭菌：121摄氏度，15min 。灭菌完后，再混合。最后加入已经过滤除菌的0.2％的ADE储液，15ml/L 。你可以稍加改进，直接配制0.2％的ADE储液，过滤除菌，然后YPD高压灭菌后，加入就可以了不过为什么不直接买YPDA，我当时比较过，clontech二者的价格好像是一样的。
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的确如此啊，送了70个测序，找到16个没有框移的蛋白，五花八门乱七八糟，看起来有点奇怪。所幸，在其中的3个蛋白中发现了一个相同的保守domain，尽管蛋白看起来怪怪的反倒是有一个重复性很高的蛋白（10个左右不同克隆的测序结果一致），居然齐刷刷地发生了1个碱基的前移剩下的都懒地测了，不知道后续的验证试验结果如何？真是前途未卜…………苍天啊！！
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havocking 不行，pGBK转Gold，pGAD转Y187，必须这样，然后做mating。两个质粒载体上分别含有TRP和LEU的编码序列，使用不同的单缺培养基筛选。恩，其实这个我知道，就是不知道2个质粒可以都转GOLD不，呵呵，本来想2样都试一下，比较一下的，哈哈，看来，我还是应该听师兄的，分别转，再mating的，呵呵。
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稻草人逛丁香园 我要做一对一回复性杂交了，关于培养基的配置想请教一下大家。实验室买回来的是YPD MEDIUM 粉末，如果我要配置YPDA粉末，那么要加入腺嘌呤，腺嘌呤是该直接加到YPD中溶解后再高压灭菌，还是先配YPD培养基，然后加处理过（不知道怎么处理）的腺嘌呤呢？恩，按照道理是腺嘌呤过滤就可以了，不用高压，然后再混合，师兄跟小满师姐也是这样推荐的我每次都没加腺嘌呤的，呵呵 ，划出来的菌有点红罢了，没什么影响的。呵呵，
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panpanxp 恩，其实这个我知道，就是不知道2个质粒可以都转GOLD不，呵呵，本来想2样都试一下，比较一下的，哈哈，看来，我还是应该听师兄的，分别转，再mating的，呵呵。共转当然没有问题，只是转化率超级低所以才有人发明了MATING的方法，利用两种不同性别，即Y187 GOLD ，且分别携带某一种质粒的酵母，之间发生性融合，成为双倍体，2种质粒自然就碰面了，从而验证二者之间的互作。MATING的成功率可就高多了，明白否？
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小满 共转当然没有问题，只是转化率超级低所以才有人发明了MATING的方法，利用两种不同性别，即Y187 GOLD ，且分别携带某一种质粒的酵母，之间发生性融合，成为双倍体，2种质粒自然就碰面了，从而验证二者之间的互作。MATING的成功率可就高多了，明白否？恩，知道了，这样分别转化后再mating效率要高些是吧。小满师姐对了 ，师姐，还有X-α-gal你是订的clontech的吧，国产的可以么？（可以推荐下吗？）还有AbA也比较贵的说吧？马上要订了，
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小满 这个是havenomoney战友提供的配制方法先称好Yeast Extract 和Tryptone ，各10g/L 和20g/L ， 加水885ml/L另外称取葡萄糖20g/L，放入另一个容器内，（如果量不多，也可以用50ml离心管）加水定容至100ml。以上两个瓶子同时灭菌：121摄氏度，15min 。灭菌完后，再混合。最后加入已经过滤除菌的0.2％的ADE储液，15ml/L 。你可以稍加改进，直接配制0.2％的ADE储液，过滤除菌，然后YPD高压灭菌后，加入就可以了不过为什么不直接买YPDA，我当时比较过，clontech二者的价格好像是一样的。我是师姐以前买好准备做，但由于种种原因没做，所以直接用她以前买的。呵呵
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感谢小满的发帖！我也是学习酵母双杂交的一个新手，这里有一些问题想请教一下大家，感谢！一：我的诱饵是一个膜蛋白，前后构建过两次，一次包含跨膜区与胞内区，一次只有胞内TK区，但检测蛋白表达都不好（确定WB技术没有问题，有阳性对照）！为什么了？二：怎样才能确定我的蛋白能进核表达了？我用只含胞内TK区的诱饵（有很弱的表达，但杂带也较多）筛选文库，Mating效率不高，且重复两次都没有筛选到任何蛋白，（Mating及文库都没有问题，有做对照），这与我的诱饵蛋白有关吗？三：关于大家提到的移框现象不太明白！我用另一个基因筛选的时候，调到一个克隆经测序验证为某基因CDS区前的一段cDNA片段，是指这样的情况吗？感谢大家的指点！
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感谢小满的发帖！我也是学习酵母双杂交的一个新手，这里有一些问题想请教一下大家，感谢！一：我的诱饵是一个膜蛋白，前后构建过两次，一次包含跨膜区与胞内区，一次只有胞内TK区，但检测蛋白表达都不好（确定WB技术没有问题，有阳性对照）！为什么了？二：怎样才能确定我的蛋白能进核表达了？我用只含胞内TK区的诱饵（有很弱的表达，但杂带也较多）筛选文库，Mating效率不高，且重复两次都没有筛选到任何蛋白，（Mating及文库都没有问题，有做对照），这与我诱饵蛋白核内表达有关吗？还是像大家说得必需去掉N端得信号肽才能确保进核了？另外还有文献说要构建载体时需加上核定为信号，是这样的吗？三：关于大家提到的移框现象不太明白！我用另一个基因筛选的时候，调到一个克隆经测序验证为某基因CDS区前的一段cDNA片段，是指这样的情况吗？感谢大家的指点！
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duanduan6851 感谢小满的发帖！我也是学习酵母双杂交的一个新手，这里有一些问题想请教一下大家，感谢！一：我的诱饵是一个膜蛋白，前后构建过两次，一次包含跨膜区与胞内区，一次只有胞内TK区，但检测蛋白表达都不好（确定WB技术没有问题，有阳性对照）！为什么了？二：怎样才能确定我的蛋白能进核表达了？我用只含胞内TK区的诱饵（有很弱的表达，但杂带也较多）筛选文库，Mating效率不高，且重复两次都没有筛选到任何蛋白，（Mating及文库都没有问题，有做对照），这与我诱饵蛋白核内表达有关吗？还是像大家说得必需去掉N端得信号肽才能确保进核了？另外还有文献说要构建载体时需加上核定为信号，是这样的吗？三：关于大家提到的移框现象不太明白！我用另一个基因筛选的时候，调到一个克隆经测序验证为某基因CDS区前的一段cDNA片段，是指这样的情况吗？感谢大家的指点！我没有检测蛋白表达，只在构建好诱饵质粒以后测序正确就直接开始筛库了，当然你检测一下是更保险的。至于不表达的问题，首先跨膜区，信号肽，GPI锚都是必须要去除的，除非你用的是针对膜蛋白的系统，不然蛋白可能会整合到细胞膜上。核定位信号，我觉得没有必要加了，因为载体上就带着呢。最后，因为文库里的cDNA片段是随机插入的，必定存在框移的现象。要根据文库载体的读码框去判断，简单说，就是从起始密码子到吻合的CDS序列之间的碱基数目是否为3的倍数。我是用的VECTRO NTI软件结合NCBI blast判断的，或者也可以用软件把测序后的片段翻译成蛋白再去NCBI中进行比对，后者还有助于发现一些比较重要的DOMAIN。
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-20度冻存了的菌，可以直接加到YPDA培养基中摇菌么？
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稻草人逛丁香园 -20度冻存了的菌，可以直接加到YPDA培养基中摇菌么？还是划板吧冻存的菌活性很低，液体培养及怕摇不起来另外，长期保存，-80也留一管吧
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havocking 1、如果你的膜定位区域功能特别强，建议截去该段区域后连入BK载体，普通的BK载体上一般都有一段核定位的序列可以保证你的重组蛋白定位核内，实在不行那就换专门针对膜蛋白的酵母双杂交系统。2、可能原因太多了，不过mating没问题转4缺没结果，可能是文库滴度的问题吧，或者该蛋白本来就没有与之互作的对象吧，呵呵！3、建库的时候连入的外源片段是随机插入的吧，谁也不能保证这种插入是同框，这样就会产生移框的现象。如果你筛选到得cds是一部分，只要测序结果显示这部分插入序列没发生移框，那就有意义。谢谢指点，你是说pGBKT7上也有核定位信号的序列吗？我查找了一下，没有特别说明，所以再问问!另外就是大家说得专门针对膜蛋白的酵母双杂交系统能帮我介绍一个不？谢谢！
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