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Calpain及抑制剂对小鼠RAW264.7细胞RANKL-RANK通路诱导破骨细胞形成机制及研究.pdf 68页
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临床医学专业学生毕业论文(八年制)原创性、真实性
及知识产权声明
本课题属于北京市自然科学基金项目：骨癌痛治疗新靶点Calpaill的机制研究， 编号：7092083。 m～NK．凡悄KL通路诱导的破骨细胞形成的机制研究》，是本人在导师指导下，在 北京协和医学院临床学院一北京协和医院麻醉科进行临床医学专业八年制科研训练 期间进行研究工作所取得的成果。据本人所知，论文中除已注明及致谢的部分外不 包含他人已发表或撰写过的研究成果；对本文的研究工作做出重要贡献的个人和集 体，均已在文中作了明确说明或致谢。本人对论文中所有实验数据和结果的真实性 负责。
本论文的研究成果(包括申请的专利)归北京协和医学院所有，本论文的研究 内容不得以其它单位的名义发表。本人完全了解北京协和医学院关于保存、使用学 位论文的规定，同意学校保留并向有关部门送交论文的复印件和电子版本，允许论 文被查阅和借阅。本人授权北京协和医学院，可以采用影印、缩印或其它复制手段 保存论文。论文的全部或部分内容将根据论文所承担国家或地方级课题的要求，与 导师商定后，予以公布。论文相关的所有实验材料归课题组所有，未经课题组长和 导师同意，不得提供给他人。
目录………………………………………………………………………………………………………………．3 英文缩略词表…………………………………………………………………………．4
中文摘要………………………………………………………………………………5 Abstract…………………………………………………………………………………………………………6 前言………………………………………………………………………………………………………………．7甘lIii；．．．．…．………．……．……．．…．…．…．………．…．…．…．………．……………．．．…．…………………．……7 研究路线设计…………………………………………………………………………．．9 材料和方法…………………………………………………………………………．1O
第一部分实验材料……………………………………………………………lO
第二部分实验方法………………………………………………………………14 实验结果……………………………………………………………………………．．26
第一部分破骨细胞诱导分化模型建立………………………………………26
第二部分Calpain活性与黜谢l江诱导的破骨细胞活化关系………………32 讨论……………………………………………………………………………………………………………。42 结论……………………………………………………………………………………………………………一51 参考文献………………………………………………………………………………52 综述……………………………………………………………………………………………………………．．55 致谢……………………………………………………………………………………………………………。69 个人简历………………………………………………………………………………70 英文缩略词表
CaIpain及抑制剂对小鼠RAW264．7细胞
RANKL．RANK通路诱导的破骨细胞形成机制的研究
(中文摘要)
Calpain是一种与破骨细胞活化相关的蛋白水解酶，可能是抑制破骨细胞活 导的破骨细胞分化的作用机制，以及抑制Calpaill对RANKL诱导的破骨细胞活 化的作用。 方法
在小鼠洲264．7细胞中，分为以下6组：RAM(I，O
n∥llll，20n∥IIll，50n∥nll， 70
n咖l，loo 进行T&廿染色和阳性细胞计数、破骨细胞骨凹陷分析，验证破骨细胞是否分化 Westem 前后两种蛋白表达量的变化。 结果 RANKI，诱导相比，可以使T凡&阳性细胞数和骨凹陷面积显著降低。此外，随 着RANKI，诱导时间的延长，NFKB和c-Fos的蛋白表达水平均呈递增趋势。而 达量显著降低。 结论 胞活化程度呈正相关。抑制calpain可以有效抑制小鼠凡≮、Ⅳ264．7细胞在RANKI， 蛋白表达
正在加载中，请稍后...干湿实验结合预测及鉴定转录因子DNA结合靶点和靶基因
东南大学 硕士学位论文干湿实验结合预测及鉴定－转录因子ＤＮＡ结合靶点和靶基因”■■■■，本论文受国家自然科学基金项目（Ｎｏ．６０８７１０１４）资助。ｊ／ＪｌｌＩＪＩｌｌｌｌＦ／ｌｌｌｆ ｌ Ｊｌ ｌ ｌ ｆｌ ｌ ｒｌＪＵｌ Ｊ ｌ ｌ ｌｒＵｌＹ１ ７６ １ ９３９ＰＲＥＤＩＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦＤＮＡ．Ｂ ＩＮＤＩＮＧ ＳＩＴＥ Ｓ ＡＮＤ ＴＡＲＧＥＴ ＧＥＮＥ Ｓ ＯＦ ＴＲＡＮＳ ＣＲＩＰＴＩＯＮ王０～ＣＴＯＲＳ ＢＹ Ａ ＰＩＰＥＬＩＮＥ ＯＦ ＤＲＹ ＡＮＤＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ ＯＦＷＥＴ ＥＸＰＥＲＩＥＭＮＴＳｔｏＡ Ｔｈｅｓｉｓ ＳｕｂｍｉＲｅｄＳｏｕｔｈｅａｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓＭａｓｔｅｒ ｏｆＢＹ ＺＨＡＮＧ Ｃｈｅｎ．ｇｕａｎｇ一 一Ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ ｂｙⅥ硷ＮＧ Ｊｉｎ．ｋｅＳｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄＭｅｄｉｃａｌ ＥｎｇｉｎｅｅｅｒｉｎｇＳｏｕｔｈｅａｓｔ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＪｕｎｅ ２０１０东南大学学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽 我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研 究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：量筮就ＥＩ菇Ｊ－型里生至旦ｃ７东南大学学位论文使用授权声明１３东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的复印件 和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文 的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布（包括以电子 信息形式刊登）论文的全部内容或中、英文摘要等部分内容。论文的公布（包括以电子信息形 式刊登）授权东南大学研究生院办理。研究生签名：耋瞄师签名递生仞Ａ结合靶点和靶基因研究的核心问题之一。构建基冈表达 调控网络最重要的首先是鉴定基因组编码的所有转录因子蛋白以及它们在基因组中全部的 ＤＮＡ结合靶点（ＴＦＢＳ）及靶基因。目前已经在人的基因组鉴定出近３０００种转录因子，而其中 能够和ＤＮＡ直接结合的转录因子约７００多个。在这些ＤＮＡ结合转录因子中，几乎没有一个转 录冈子在人基因组中的全部功能性ＤＮＡ结合靶点（也称为结合谱）及其靶基因得到彻底明确 地描述。因此，成为构建基冈表达调控网络面临的最大障碍。 为了解决这一问题，近年来已经发展了多种高通量预测及鉴定ＴＦＢＳ的新技术，如双链 ＤＮＡ微阵列芯片（ｄｓＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）（也称为蛋白结合微阵列，ＰＢＭ）、染色体免疫沉淀．芯片 （ＣＨＩＰ－ｃｈｉｐ）、染色体免疫沉淀．测序（ＣＨＩＰ．ｓｅｑ）。另外，还出现了大量生物信息学预测技术。 目前把基于生物学实验的技术统称为湿实验（ｗｅｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ），把基于生物信息学的技术 统称为干实验（ｄｒｙ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ｉｎ 的研究。 本研究希望建立一种“湿实验一千实验＿湿实验”紧密结合的研究思路，快速高效鉴定一 个转录因子蛋白的ＴＦＢＳ及靶基因，进而构建一个转录因子控制的基因表达调控网络。本研究 希望通过具体的实验研究证实这一思路是可行的，是有效的。 本论文首先设计出“湿实验．＋干实验＿湿实验”的基本思想，即首先以湿实验手段获得一 个转录因子与大量人工设计ＤＮＡ结合序列的结合特异性及亲合性数据，筛选出所有能够与转录 因子结合的ＤＮＡ序列；然后以干实验手段扫描人全基因组，定位这些序列在基因组中的分布， 将它们推定为转录因子在基因组中的假定结合位点（ｐｕｔａｔｉｖｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ，ＰＢＳｓ），并依据这些 位点提取附近的基因，将这些基因推定为转录因子在基因组中的假定靶基因（ｐｕｔａｔｉｖｅｔａｒｇｅｔｓｉｌｉｃｏｅｘｐ嘶ｍｅｒｉｔ）。大量新颖的研究表明，要在全基因组范围鉴定转录因子的ＴＦＢＳ及靶基因，必须将干湿实验技术有机结合。为此，本论文展开了这一方面ｇｅｎｅｓ，ＰＴＧｓ）；最后，以此为蓝图，再以湿实验手段快速验证这些假定结合位点及假定靶基因 是否是转录因子的功能性（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）结合位点及靶基因。其中第一次湿实验手段是ｄｓＤＮＡ微 阵列芯片，第二次湿实验手段主要是染色质免疫沉淀（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ＰＣＲ等。 其次以著名的转录因子ＮＦ－ｒ，Ｂ为研究对象，用单碱基突变ｄｓＤＮＡ微阵列芯片研究了ＮＦ．ｒ，Ｂ 对所有单碱基突变ＤＮＡ序列的结合，筛选出具有较高亲合性的１０个序列（ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ、ＧＧＧＡＣＴＴＣＣＣ、 ＧＧＧＡｒｎｒＴＣＣ、 ＧＧＧＧＣｌＴＴＣＣ、 ｉｍｍｕｎｏ．ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ，ＣＨＩＰ）、ＧＧＧＴＣｌＴ，ｒＣＣ、ＧＧＧＡＣＴＴＴＡＣ、ＧＧＧＡＣＴＧＴＣＣ、ＧＧＧＡＣ唧Ｃ）；在本论文的干实验部分，对人基因组进行了这１０个序列的全基因组扫描，定位了这些序列的分布，发现这些序列在基因 组中确有分布，并且大量位于已知基因附近（上游、下游、内部），因此将这些位点预测为ＮＦ－ｒ，Ｂ 的假定结合位点，将与之联系的基因预测为ＮＦ－ｒ，Ｂ的假定靶基因；扫描共得到４２０１７个靶点，其ＧＧＧＡＡｒ】ｒｒＣＣ、ＧＧＧＡＧＴＴＴＣＣ、中２２１７０个靶点１０ｋｂ内有基因，被预测为ＰＢＳｓ，相应的预澌Ｕ９８６９个ＰＴＧｓ；通过文献检索，发现在ＰＴＧｓ中有１３５个经实验研究鉴定的ＮＦ．ｒ，Ｂ靶基因。对ＰＢＳｓ在基因组中的分布进行统计分析， 发现有１１％的位点在基因５’端１０ｋｂ内（其中０．１ｋｂ内１％，１－５ｋｂｌ勾５％，５．１０ｋｂ内５％），２７％的位 点在基因内部（其中第一内含子内１０％，其他内含子内２４％，外显子内３％），１０％的位点在基因的３ ７端１０ｋｂ内，４２％的位点在基因１０ｋｂＳｂ；这些分布特征与ＣｈＩＰ．ｃｈｉｐ等实验研究取得的结果相似。对ＰＢＳｓ和ＰＴＧｓ的染色体分布分析发现，两者都有成簇分布的现象。对ＰＴＧｓ进行功能聚 类分析，并与文献报道的确证靶基因的ＧＯ聚类分析结果进行比较，发现ＰＴＧｓ的３３个聚类条目 中，有８个条目与确证靶基因组的聚类条目重叠。干实验部分的研究为进一步大规模实验鉴定ＮＦ－心的ＤＮＡ结合靶点和靶基因提供了行动蓝图。在湿实验部分，我们挑选了具有代表性的７个靶基因（ＴＮＩＰｌ、ＩＬ－６、ＨＦＥ、ＭＩＡ、ＲＡＲＧ、ＳＴＡＴｌ、ＬＴＢＰｌ），对其相应ＤＮＡ靶点进行了湿实验分析，采用染色质免疫沉淀技术配合ＰＣＲ技术验证了７个典型基因附近预测的ＤＮＡ结合靶 点，１２个新预测ＤＮＡ靶点中９个靶点与ＮＦ．ｒ，Ｂ结合，湿实验部分的研究不仅发现了新的ＮＦ．ｒ，Ｂ ＤＮＡ结合靶点，同时也印证了干实验预测的可靠性。 通过这些研究，论证了本论文提出的干湿实验结合预测及鉴定转录因子ＤＮＡ结合靶点和靶 基因研究思路的可行性，为转录因子ＤＮＡ结合靶点和靶基因的研究提供了一种新的思路。关键词：转录因子、ＤＮＡ结合靶点、靶基因、干湿实验结合Ⅱ东南大学硕士学位论文Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ―ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｂｙ ａ ｐｉｐｅｌｉｎｅ ｏｆ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒｙ ａｎｄ ｗｅｔ ｅｘｐｅｒｉｅｍｎｔｓＡｂｓｔｒａｃｔＴｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｎｅｔｗｏｒｋ（ＧＲＮ）ｉｓｏｎｅｏｆｃｏｒｅｐｒｏｂｌｅｍ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍ ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｗｏｒｋ ｆｏｒ ＧＲＮ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｉｓ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ａｌｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ＤＮＡ?ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ（ＴＦＢＳ）ａｎｄ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓ．Ａｔ ｐｒｅｓｅｎｔ，ａｂｏｕｔ３０００ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ，ａｍｏｎｇ ｗｈｉｃｈ ａｂｏｕｔ ７００ ａｒｅ ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓ ｏｆｎｏｎｅｏｆ ｔｈｅｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ，ｔｈｉｓ ｈａｍｐｅｒｓ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＧＲＮ．Ｔｏ ａｄｄｒｅｓｓ ｔｈｅ ｐｒｏｂｌｅｍ，ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｎｅｗ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ＴＦＢＳ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｉｎ ｒｅｖｅｎｔ ｙｅａｒｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｄｓＤＮＡａｎｄ ｔａｒｇｅｔｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（ａｌｓｏｃａｌｌｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ，ＰＢＭ），ｃｈｏｒｏｍｏｔｉｎ ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（ＣｈｉＰ－ｃｈｉｐ），ｃｈｏｒｏｍｏｔｉｎ ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＣＨＩＰ－ｓｅｑ）．Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｍａｎｙｏｎｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃａｌ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ａｌｓｏｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｏｒ ｔｈｉｓ ｐｕｒｐｏｓｅ．Ａｔｐｒｅｓｅｎｔ，ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｂａｓｅｄｂｉｏ－ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ａｒｅ ｃａｌｌｅｄａｒｅｗｅｔｏｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ｉｎｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｆｉｎｉｓｈｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｍｐｕｔｅｒｃａｌｌｅｄ ｄｒｙ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｅｘｐｅｄｍｅｎｔ．Ｍｏｓｔｎｏｖｅｌ ｒｅｓｅａｒｃｈｅｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｉｔ ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｔｏ ｃｏｍｂｉｎｅ ｔｈｅ ｗｅｔａｎｄ ｄｒｙ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｆｏｒｇｌｏｂａｌ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｍ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｆｏｒｏｕｒｔｈｉｓ ｐｕｒｐｏｓｅ，ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ ｄｉｄ ｔｈｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ｔｈｉｓ ｆｉｅｌｄ ｉｎ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｅｘｐｅｃｔ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈａ ｒｅｓｅａｒｃｈｌａｂ．ｒｏｕｔｅ ｗｈｉｃｈ ｃｏｍｂｉｎｅｓ ｗｅｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｃｌｏｓｅｌｙ ｗｉｔｈ ｄｒｙｅｘｐｅｒｉｅｎｍｔ ｆｏｒ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓ．Ｔｈｉｓｐａｐｅｒ ａｉｍｓ ｔｏｖｅｒｉｆｙ ｔｈｅｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｉｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｉｐｅｌｉｎｅ ｂｙ 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ａｌｌ东南大学硕士学位论文目录摘要………………………………………………………………………………．…．．ｊ………………………………………………．．ＩＡｂｓｔｒａｃｔ………………………………………………………………………………………………………………………………．．ＩＩＩ第１章综述…………………………………………………………………………………………．１１．１背ｊ豪…………………………………………………………………………………………………………………………１１．２转录因子ＤＮＡ结合位点及靶基因研究现状及重要技术…………………………………．２１．２．１转录因子ＤＮＡ结合靶点和靶基因研究的湿实验方法……………………………２１．２．２转录因子ＤＮＡ结合靶点和靶基因研究的干实验方法……………………………８１．３ＮＦ－ｒ，Ｂ的研究现状……………………………………………………………………………９１．３．１ １．３．２ １．３．３ １．３．４ＮＦ．ｒ，Ｂ的生物学特性………………………………………………………………。９ ＮＦ．ｒ，Ｂ复合物的组成………………………………………………………………．９ ＮＦ．ｒ，Ｂ的激活………………………………………………………………………。９ ＮＦ．ｒ，Ｂ的靶基因……………………………………………………………………１０１．４本论文研究背景……………………………………………………………………………１５ 第２章转录因子ＮＦ－ｒ，Ｂ ＤＮＡ结合位点全基因组扫描及靶基因预测…………………………．１７ ２．１实验方法……………………………………………………………………………………．１７２．１．１ ２．１．２ ２．１．３ ２．１．４１０个位点的人类全基因组扫描及周围基因提取…………………………………１７ ＤＮＡ靶点与基因位置关系的确定…………………………………………………１７ ＮＦ．ｒ，Ｂ靶基因的文献检索…………………………………………………………１７ ＤＮＡ靶点及靶基因在染色体上分布作图………………………………………。１８２．１．５功能聚类……………………………………………………………………………．１８ ２．２实验结果……………………………………………………………………………………．．１８２．２．１１０个序列的基因组定位信息及其相关的基因信息………………………………１８２。２．２不同范围推测靶点及推测靶基因数目统计………………………………………２０ ２．２．３文献确证靶基因的统计……………………………………………………………２ｌ ２．２．４预测ＤＮＡ靶点及靶基因可视化…………………………………………………．２３ ２．２．５基因的功能分类……………………………………………………………………２４２．３讨论………………………………………………………………………………………………………………………．３０本章小结…………………………………………………………………………………………３３ 第３章典型靶基因预测ＤＮＡ靶点的ＣｈＩＰ．ＰＣＲ实验验证……………………………………．．３５ ３．１实验材料……………………………………………………………………………………。３５ ３．２实验方法……………………………………………………………………………………．３７ ３．２．１细胞培养和ＮＦ－ｒ。Ｂ的诱导………………………………………………………。３７ ３．２．２染色质免疫沉淀（ＣｈＩＰ）……………………………………………………………．３７３．２．３ ３．２．４ ＣｈＩＰＤＮＡ的ＰＣＲ检测引物及反应体系…………………………………………３９ＰＣＲ产物电泳检测…………………………………………………………………４０３．３实验结果…………………………………………………………．．．………………………．４ｌ ３．３．１超声效果检测………………………………………………………………………４ｌ ３．３．２每个ＣｈＩＰ中使用的染色质的量的计算（３次不同实验）…………．．．………………４ｌ３．３．３ ＣｈＩＰＤＮＡ的ＰＣＲ产物检测………………………………………………………４１３．４讨论………………………………………………………………………………………………………………………．４５ 本章小结…………………………………………………………………………………………．４７ 全文总结………………………………………………………………………………………………４８Ｖ…………………………．４９…………………………．５９…………………………．６７ …………………………．６８ＶＩｏｍｅｐｒｏｊｅｃｔ，ＨＧＰ）的完成，生命）上，基因表达调控分析是基因功 能研究最重要的组成部分。从人类基因组全序列中探索基因的表达调控规律，进而揭示生命的 奥秘，将成为生命科学的研究热点，同时成为新学科的生长点【１．１０】。在基因组序列中对各种 调控元件进行准确的预测是进行表达调控研究的前提和基础。 对转录过程的调控是表达调控的重要形式。而转录过程的激活、抑制和调节则主要通过转录因子（Ｔｒａｎｃｒｉｐｔｏｎ ｆａｃｔｏｒ，ＴＦ）与其在序列中对应的结合位点之间的交互作用来实现。作为一种重要的转录调控元件，转录因子结合位点（ｔｒａａｓｅｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅ，ＴＦＢＳ）的计算预测可作为传统实验识别方法的辅助手段，从而加速推动表达调控机理的研究和转录调控网络的构 建。转录因子结合位点通常是一段８．１２ｂｐ的ＤＮＡ序列，不同的基因表达需要特定的转录因子结 合到这段ＤＮＡ序列上，对于某种转录因子，其结合的ＤＮＡ序列比较相似，但又不完全一样，这 是由于对不同的基因需要不同的结合亲和力。通常，转录因子结合在基因上游启动子区域的结 合位点上称为近程作用。还有一些转录因子结合在距离基因很远的上游区域称之为远程作用。 另外也有一些结合在基因的下游。基因转录水平上的调控如图１．１【１１】。ＧＦＩＭＦ呐ａｘｉｍａｌＴ田Ｓ图ｌ－１基因转录水平调控示意图【ｌｌ】 经过对人类基因组系统分析发现，蛋白质编码基因的数量只有３万左右（３２０００ 个，３００００．４００００，２００００―２５０００，２６５８８）［３，１２－１４］，而在这些蛋白编码基因中，调节基因表达的反式 因子占据了相当大的比例，估计约１８５０１７］至Ｕ ３０００［１２］。近几十年转录因子及其ＤＮＡ结合位点ｌ第１章综述得到了广泛的研究，结果大都收录在ＴＲＡＮＳＦＡＣ［１５］和ＪＡＳＰＡＲ［１６］数据库中。２００６年推出的 ＴＲＡＮＳＦＡＣ专业版Ｒｅｌ．７．０中包含了６１３３个真核生物转录因子和７９１５个特异ＤＮＡ结合位点， 其中人（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）有１０４０个转录因子【１５】。 众多反式因子与大量顺式元件的相互作用控制着基因表达调控的一个重要环节一基因转录 调控，形成了精确而复杂的基因转录调控网络。因此，要解析基因转录调控网络，就首先要在 全基因组中鉴定所有的反式因子及其作用的所有顺式元件。 由于种类的繁多和功能的多样性，大多数转录因子以及结合位点的相关知识都还比较有限。 传统分子生物学技术只是零打碎敲地取得了非常有限的信息，为了解决这一问题，包括生物信 息技术大规模预测调控元件、染色体免疫沉淀（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ，ＣＨＩＰ）等技术手段 应运而生，对于大规模挖掘这类顺式调控信息取得了显著的效果。但截止目前还没有任何一个 转录因子的全基因完整ＤＮＡ靶点及靶基因名单（１ｉｓｔ）得到阐明。１．２转录因子ＤＮＡ结合位点及靶基因研究现状及重要技术转录因子（，ｒＦ）对真核生物的转录调控有着举足轻重的作用，转录因子的相互作用，对生物 的生长发育是至关重要的，因为几乎所有的基因在表达时都要受到转录因子的调控，要解析基 因转录调控网络，就首先要在全基因组中鉴定所有的反式因子及其作用的所有顺式元件；目前 只有一部分转录因子蛋白得到鉴定，而其余的转录因子的鉴定成为功能基因组和蛋白质组研究 的重要内容之一；然而对于已知转录因子蛋白作用的顺式元件及其靶基因的鉴定仍然不完整。 近年来随着生物学实验技术和生物信息学技术的发展，出现了大量高通量转录因子ＤＮＡ靶点 和靶基因的生物学实验鉴定技术和生物信息学预测技术【１７】。 目前把基于生物学实验的技术统称为湿实验（ｗｅｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ），把基于生物信息学的技术 统称为干实验（ｄｒｙｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）。１．２．１转录因子ＤＮＡ结合靶点和靶基因研究的湿实验方法１…２１ １ｄｓＤＮＡ微阵列芯片（ＰＢＭ）ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ，ｄｓＤＮＡ双链ＤＮＡ微阵列芯片（ｄｏｕｂｌｅ．ｓｔｒａｎｄｅｄｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）（也称为蛋白结合微阵列，ｐｒｏｔｅｉｎ．ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｉｃｍａｒｒａｙ，ＰＢＭ）是一种新型ＤＮＡ微阵列芯片，最早报道于１９９９年，当时美［］Ｈａｒｖａｒｄ大学Ｂｕｌｙｋｒ研究小组在Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ公司原位合成单链ＤＮＡ微阵列芯片的基础上， 采用引物退火再进行在片ＤＮＡ聚合酶延伸的办法制备双分子双链ＤＮＡ微阵列芯片［１８】（图１．２）， 用于研究序列特异性ＤＮＡ结合蛋白与ＤＮＡ靶点的作用特征，通过研究限制性内切酶和锌指转录 因子蛋白与ｄｓＤＮＡ微阵列芯片上ｄｓＤＮＡ探针分子的相互作用，论证了ｄｓＤＮＡ微阵列芯片用于体 外研究序列特异性ＤＮＡ结合蛋白与其ＤＮＡ靶点相互作用的可行性。 Ｂｕｌｙｋ研究小组通过改变对应于一个锌指结构的三连核苷酸，研究了锌指转录因子蛋白与所 有可能三连核苷酸组合ＤＮＡ靶点的相互作用，以此评价不同位置上核苷酸对转录因子蛋白结合 的重要性及其转录因子蛋白与ＤＮＡ靶点相互作用时，氨基酸与碱基的对应关系，以期借此高通 量筛选发现一个转录因子蛋白在全基因组范围内的结合位点，并研究这些位点的核苷酸组成特 征，进而建立生物信息学模型，以便在全基因组范围内预测一个转录因子蛋白的靶位点【１９】。 这一研究证实了ｄｓＤＮＡ微阵列芯片在ＤＮＡ结合质研究中的应用前景。 Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ等（２００４）用此法分离酵母转录因子Ａｂｆｌ、Ｒａｐｌ、Ｍｉｇｌ的靶基因时，筛选到的靶 基因不仅包括用其他方法已经证实的靶基因，而且又筛选出Ａｂｆｌ转录因子１０７个新的靶基因， Ｒａｐｌ转录因子有９０个新的靶基因，Ｍｉｇｌ转录因子有７５个新的靶基因。许多靶基因是一些不典型 的开放阅读框的上游序列［２０】。Ｂｅｒｇｅｒ和Ｂｕｌｙｋ（２００６）在Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｑｂ介绍了这种高通量的方法【２ｌ】。目前，Ｂｕｌｙｋ实验室已经完成大规模地鉴定酵母转录因子的靶位点的工作， 并认为可以将此方法与其他方法整合后用于高等真核生物转录因子及顺式作用元件的鉴定２东南大学硕士学位论文【２２】。 Ｂｕｌｙｋ研究小组的研究表明ＰＢＭ技术可高通量鉴定转录因子蛋白的顺式调控元件和转录调 控网络；通过ＰＢＭ技术与ＣｈｉＰ－ｏｎ－ｃｈｉｐ技术的比较，发现ＰＢＭ获得的ｉｎ ｖｉｔｒｏ结合位点信息能够精确地反映ＣｈｉＰ－ｏｎ－ｃｈｉｐ获得的ｉｎ ｖｉｖｏ结合位点信息，而且ＰＢＭ还发现了大量ＣｈｉＰ－ｏｎ－ｃｈｉｐ不能够显示的结合位点信息【２０】。ｄｓＤＮＡ微阵列芯片还用于测定细胞核中转录因子蛋白的表达和活化 水平等【２３】。图１－２Ｂｕｌｙｋ等的双链ＤＮＡ芯片的制备原理图［１８】鉴于双链ＤＮＡ微阵列芯片在研究ＤＮＡ／蛋白质的相互作用方面极大的应用潜力。我们实验 室从２０００年就开始了双链ＤＮＡ微阵列芯片的研究工作［２４．２６］。针对当时国际上已经出现的双分 子（ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ）ｄｓＤＮＡ微阵列芯片的不足之处，我们提出了单分子ｄｓＤＮＡ微阵列芯片 （ｕｎｉ．ｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｓＤＮＡｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）概念（图１．３），并发展了几种单分子ｄｓＤＮＡ微阵列芯片制备 技术［２４．２６】（图１．４）。同时制备了针对重要转录因子ＮＦ．ｒＢ的全单核苷酸突变ｄｓＤＮＡ微阵列芯 片，用该芯片研究了ＮＦ．ｒ，Ｂ对大量单核苷酸突变ＤＮＡ位点的结合特异性和亲合性［２４．２６】（图 １．５）。我们的研究表明，单分子ｄｓＤＮＡ微阵列芯片为ＤＮＡ／蛋白质相互作用的研究提供了一种 新的高通量实验技术。图１－４单分子ｄｓＤＮＡ微阵列芯片制备原理图１?５针对ＮＦ―ｒ，Ｂ的单核苷酸突变单分子ｄｓＤＮＡ微阵列芯片与ＮＦ．ｒ，Ｂ蛋白的结合反应Ｗｉｌｄ―ｔｙｐｅ Ｉｇ－ＫＢ：５＇－ＧＩＧ２Ｇ３Ａ４Ｃ５Ｔ６ＴＴＴ８Ｃ９Ｃ！ｏ－３’；Ｎｎ：ｎ位置上突变的碱基。运用ｄｓＤＮＡ微阵列芯片可以非常有效在体外实验环境中研究两个重要的问题，一是评价顺 式元件中每个位置核苷酸对反式作用因子结合特异性及亲合性的所发挥的作用，揭示反式作用 因子对顺式元件每个位置核苷酸的偏好性；这些信息对设计具有转录治疗作用的转录因子诱骗 子、ｓｉＲＮＡ及反义寡核苷酸非常重要。二是高通量鉴定基因组中反式作用因子的顺式元件，绘 制转录调控网络：这对解析真核生物高度复杂而精确的基因表达调控过程非常重要。 １．２．１．２染色质免疫沉淀分析技术（ＣＨＩＰ）１．２…１ ２ １原理和方法ＣｈＩＰ技术由Ｏｒｌａｎｄｏ［２７］等－于１９９７年创立。该技术综合利用了甲醛交联及免疫沉淀方法的优 点，即用甲醛交联固定处于结合状态的蛋白质．ＤＮＡ复合物，再用免疫沉淀分离ＤＮＡ．蛋白质交 联复合物，最后分析复合物＠ＤＮＡ。其基本原理是：在活细胞状态下，用１％的甲醛溶液处理使４东南大学硕士学位论文ＤＮＡ／蛋白质发生共价交联，固定ＤＮＡ／蛋白质复合物，然后将细胞裂解，提取ＤＮＡ／蛋白质复合 物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，通过免疫沉淀法特异性地富集目的蛋 白结合的ＤＮＡ片段，除去蛋白质，与ＤＮＡ结合蛋白特异性结合的ＤＮＡ片段经ＰＣＲ扩增后进行电 泳检测，从而得出蛋白质结合位点信息（图ｌ＿６）【２Ｓｌ。上＋’％～～⑧ＣｅＩＩ Ｌｙｓａｔｅ ｗｉｔｈ Ｃｍｓｓ，４ｉｎｌｏＫＩ Ｐｒｏｔｅｉｎ－ＤＮＡＣｏｍｐｌｅｘｅｓ圪ｏｆＣｄｌｏＤｅｂ懦磅气竺…吖～ｉ孓Ｑ＼。Ｉ删№饼Ｐ删ｎ鹏～ｎ杂ｋ＼１Ｉｒ一０：～鹏◆ＤＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎ＆ＡｎａｌｙｓｉｓＳｏｕｔｈｅｒｎ Ｓｌｏｔ Ｂｌｏｔｏｒｂｙ ＰＣＲ图ｌ－６染色质免疫沉淀分析的原理示意图【２８】 ＣｈＩＰ技术其操作步骤可大致分为固定、沉淀和检测三步。第一步为固定，即在活细胞状态 下，通过甲醛交联作用固定ＤＮＡ／蛋白质复合物，然后用化学微球菌酶或者机械超声波的手段５第１章综述将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段。第二步为免疫沉淀，即利用目的蛋白质的特 异抗体通过抗原抗体反应形成ＤＮＡ．蛋白质．抗体复合体，然后沉淀此复合体（常用蛋白Ａ修饰 的磁珠），特异性地富集目的蛋白结合的ＤＮＡ片段。第三步为目的ＤＮＡ片段的纯化与检测， 即经过解偶联，纯化ＤＮＡ片段，再用聚合酶链式反应ＰＣＲ或Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹等方法分析ＤＮＡ（图１．６）。１．２…１２ ２注意事项（改进优化）在上述ＣｈＩＰ过程中，甲醛能够进入细胞并使蛋白质与ＤＮＡ或蛋白质与蛋白质之间通过希 弗（Ｓｃｉｈｆ０键交联，形成稳定结合的复合物。如果交联效果不太好，可以先用交联剂ＤＭＡ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ａｄｉｐｉｍｉｄａｔｅ）［２９］或ＤＳＧ（Ｄｉｓｕｃｃｎｉｍｉｄｙｌ ｇｌｕｔａｒａｔｅ）［３０］处理细胞，以加强后续甲醛交联的效果。破碎ＤＮＡ可采用超声物理破碎或特定酶切消化，以获得所需长度的ＤＮＡ片段。 由于ＤＮＡ片段长度将影响抗体免疫沉淀效率，因此破碎ＤＮＡ是ＣＭＰ实验成功与否的重要因 素。超声效果与细胞裂解是否充分、细胞浓度及裂解液成分等因素有关。超声处理后的液体应 从浑浊状态变为透明状态【３１】。 选择专一性及亲和力较高的抗体是ＣｈＩＰ成功的关键。非特异性抗体将增加大量的非目标靶 点ＤＮＡ片段信息，从而掩盖了真实的蛋白质结合位点信息；而亲和力较差的抗体，则无法获得 高信噪比靶点ＤＮＡ片段［３２１。１．２…１ ２ ３染色质免疫沉淀的ＤＮＡ的分析方法染色质免疫沉淀的ＤＮＡ的分析方法有许多种。如果目的蛋白的靶序列是已知的或者怀疑 某个序列是目的蛋白的靶序列，可以采用狭缝杂交和ＰＣＲ分析［３３．３４】；如果目的蛋白的靶序列 未知或者高通量的（ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）研究目的蛋白在基因组上的分布情况，找出反式作用因子 的结合位点，可以采用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交［２７，３５１、ＣｈＩＰ克隆（ＣＨＩＰ．ｃｌｏｎｉｎｇ）［３６］、ＤＮＡ芯片方法 （ＣＨＩＰ。ｃｈｉｐ）（染色质免疫沉淀后的ＤＮＡ片段的基因芯片分析）【３７．４４］、高通量测序法（ＣｈＩＰ．ｓｅｑ） 【３１，４３，４５－５３】（图ｌ?７）。 近年来，染色质免疫沉淀（ＣＨＩＰ）技术与ＤＮＡ微阵列芯片（ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｃｈｉｐ）相结合产生 的“ＣｈＩＰ．ｃｈｉｐ”技术，极大促进了在全基因组水平上高通量鉴定ＤＮＡ结合蛋白质（ＤＮＡ．ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）的ＤＮＡ结合靶点（ＤＮＡ．ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ）的研究１３７－４３，５４】。ＣｈＩＰ．ｃｈｉｐ技术中，染色质免 疫沉淀富集的微量ＤＮＡ（通常只有几个ｎｇ），用ＬＭ．ＰＣＲ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ ＰＣＲ）扩增并荧光标 记，再与各种ＤＮＡ微阵列芯片【基因表达芯片、ＣｐＣ岛ＤＮＡ微阵列芯片、启动子ＤＮＡ微阵 列芯片、叠连（ｔｉｌｉｎｇ）ＤＮＡ微阵列芯片】杂交，就可以确定ＣｈＩＰ ＤＮＡ的序列、丰度及在基因 组中的位置，依此识别出ＤＮＡ结合蛋白质在全基因组ＤＮＡ中ＤＮＡ结合靶点，进而确定附近 基因信息（靶基因）。 与ＣｈｉＰ．ｃｈｉｐ比较而言，ＣｈＩＰ．ｓｅｑ避免了ＣｈＩＰ．ｃｈｉｐ依赖于ＤＮＡ微阵列芯片而造成的偏向 性（ｂｉａｓ），即ＤＮＡ微阵列芯片上探针数量的有限和对全基因组ＤＮＡ覆盖度的不完全，造成部 分ＣｈＩＰ ＤＮＡ信息的丢失，而ＣｈＩＰ．ｓｅｑ只需要将ＣｈＩＰ ＤＮＡ进行高通量测序，在将所测序列在 参考基因组（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｏｍｅ）定位（ｍａｐｐｉｎｇ）即可获得转录因子蛋白在全基因中结合位点的 分布，因此ＣｈＩＰ．ｓｅｑ是一种对ＣｈＩＰ ＤＮＡ的无偏检测技术（ｕｎｂｉａｓ），能够完整地显示ＣｈＩＰ ＤＮＡ 包含的信息［４３，５５．５６】。随着ＤＮＡ高通量测序技术的快速发展，测序成本快速降低，使得 ＣｈＩＰ．ｓｅｑ能够被普通科研人员承受，变成常规实验技术，因此，ＣＭＰ．ｓｅｑ代表了转录因子全基 因结合靶点定位的最新前沿技术。１．２…１ ２ ４发展及应用ＣｈｉＰ技术已得到广泛应用，并在此技术基础上发展出了一系列实验技术平台［５７１。如早期 基Ｔ－ＰＣＲ技术的ＣｈＩＰ技术与ＤＮＡ微阵列芯片技术结合后产生的“ＣｈｉＰ－ｏｎ－ｃｈｉｐ”技术，取得了６东南大学硕士学位论文关（的 卑 定分笙！皇箜堕ＣｈＩＰ技术显著的优点在于它是一种在体内（ｉｎ ＶＯＶＯ）研究ＤＮＡ与蛋白质相互作用的理想 的方法［６６．７０］，但这也是它的不足之处，原因是ＣｈＩＰ实验获得的只是一个转录因子在一种人工 培养的特定细胞的一个瞬间与其结合的顺式元件信息，而实际情况是培养细胞不同于活体组织 细胞，也很难反映不同组织细胞在不同发育阶段或不同生理、病理状态下一个转录因子所作用 的全部顺式元件。另外，ＣＭＰ实验需要很好的抗体，但是否能找到好的抗体仍然是一个不小的 挑战。此外，目前分析ＣｈＩＰ技术捕获的ＤＮＡ序列信息所使用技术主要是各类高密度ＤＮＡ微 阵列（如ｐｒｏｍｏｔｅｒｍｉｃｒｏａｒｒａｙ，ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｔｉｌｉｎｇ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ，ＣｐＧ ｉｓｌａｎｄｓ ｍｉｅｒｏａｒｒａｙ，ｇｃｎｏｍｉｃ ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）和基于芯片的ＤＮＡ高通量测序技术（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｓｏｌｅｘａ），这些技术都是专利技术，其使用成本非常高昂，其设备和经费不是一般的科研工作者所能够企及的。而且值得注意的是， 单纯用ＣｈＩＰ方法尚不能够判断目的蛋白是以直接还是以间接的方式来与ＤＮＡ作用的。１．２．２转录因子ＤＮＡ结合靶点和靶基因研究的干实验方法生物信息学分析是研究特定基因表达调控机制的重要手段。近年来，随着人类基因组测序 的完成，以计算机为工具，用数理及信息科学的理论和方法研究生命现象，对生物信息进行储存、 检索和分析的方法获得了越来越多的应用。目前。许多综合转录因子结合位点的数据库已经形 成。最常用的是ＴＲＡＮＳＦＡＣ数据库【７１】，这个数据库可将真核生物的转录因子和它们已知的结 合位点进行分类，提供位点加权矩阵（ｐｏｓｉｔｉｏｎｗｅｉｇｈｔ ｍａｔｒｉｘ，ＰＷＭ）。类似的数据库还有很多，如ＭａｔＩｎｄ ａｎｄ Ｍａｔｌｎｓｐｅｃｔｏｒ［７２］、ＭＡＴＲＩＸ ＳＥＡＲＣＨ［７３］、ＳＩＧＮＡＬ ＳＣＡＮ【７４１、ｒＶＩＳＴＡ【７５］、ＪＡＳＰＡＲ［７６］、ＴＥＳＳ［７７］、ＴＦＳＥＡＲＣＨ［７８］、ＴＲＲＤ［７９１、ＤＢＴＢＳ［８０］。有关基因转录因子结合位 点的识别和预测的方法和软件也有很多，如ＶＯＭＢＡＴ［８１Ｉ、ＧＡＭＥ［Ｓ２］、Ｓｔｕｂｂ［８３】、ＰＯＸＯ［８４］、 ｊＰＲＥｄｉｃｔｏｒ［８５］、ＣＥＡＳ［８６］、ｏＰＯＳＳＵＭ［Ｓ７］和＂Ｉ Ｆ Ｔａｒｇｅｔ Ｍａｐｐｅｒ［８８］。 对于数据库中数据进行更深一步的研究和分析是富有挑战性的工作之一。它在计算机和国 际互联网的发展使对大规模数据的存贮、处理和传输成为可能的基础上得以实现。大量ＤＮＡ结 合蛋白质等生物大分子数据的存在和生物信息学技术发展的结合，使ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ生物学研究成为生 物医学发展的一个重要方向，通过综合已有的信息和预测技术，发现新的ＤＮＡ结合蛋白质或 ＤＮＡ上的特异蛋白结合位点，有助于进行ＤＮＡ结合蛋白质的相关研究。 但生物信息学的方法仍然存在一定的局限性，其中生物信息学预测所能依赖的可靠的实验 数据并不多，基于这些非常有限的实验数据建立起来的预测模型其可靠性、精确性还有待大量 的实验研究去证实；这类生物信息学研究最初所依赖的实验数据还主要是传统分子生物学技术 所获得的零零碎碎的知识，如建立一个转录因子蛋白共有基序所使用的最典型的加权矩阵法， 依靠的就是传统分子生物学实验获得的数个调控元件的碱基信息；虽然目前生物信息学研究也 使用了来自基因组测序、比较基因组、ＤＮＡ微阵列芯片等方面的大量信息，但真正来自实验 的数据资料还是不多［８９―９８］。 其次，现有的生物信息学软件存在局限性。由于用传统的实验方法鉴定功能元件是极其费 力的，生物学家开发了一系列的生物信息学软件去预测调控序列中的功能元件。这些软件的原 理都是用已知的功能元件的数据库去扫描待研究的调控序列中可能的功能元件。但是由于功能 元件的核苷酸长度较短，可能仅仅由于随机性产生了与功能元件相同的核苷酸序列，所以软件 预测出的功能元件往往是不具备生物学活性的。基于功能元件在进化中是比较保守的性质，补 救的措施是选取近缘物种的相应调控序列进行比对，如果这几条序列中都共同存在一些生物信 息学预测出的潜在的功能元件，那么就可以比较肯定它在转录调控中发挥一定的作用。这项方 法也确实成功鉴定了～些以前未知的功能元件。但是，它也有其自身的局限性：（１）核苷酸序列 的保守可能仅仅是由于随机性；（２）真正的功能元件的序列可能会发生改变，而其功能不变；（３） 一些功能元件是具有种属特异性的。这些局限性会造成假阳性和假阴性结果［９９１。所以尽管近８东南大学硕士学位论文年来预测软件日趋复杂和成熟，这些预测结果大都只能被当作后续实验鉴定的靶点，而不能当作可靠的功能元件。但生物信息学具有快速、经济的优点，仍然会在基因表达调控研究方面发挥重要作用。它的 形成为分子生物学家提供了一条寻找和研究转录调控靶点的新思路，用网络资源进行分析，发现 新线索和新规律，指导实验工作的设计，可避免实验的盲目性和不必要的重复。 １．３ＮＦ．ＫＢ的研究现状ＮＦ．ＫＢ的生物学特性ｋａｐｐａ Ｂ，ＮＦ－ｒ，Ｂ），又叫Ｒｅｌ／ＮＦ．ｒ．Ｂ，是一类多功能核转录因子，Ｓｅｎ１．３．１核因子ｒ，Ｂ（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ和Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ于１９８６年首次在Ｂ淋巴细胞中发现，因能与免疫球蛋白轻链基因增强子ｒ，Ｂ序列 特异结合而得名【１００】。大量研究表明ＮＦ．ＫＢ是一类广泛存在于真核细胞的核转录因子，能识别 并结合靶基因上游特定的１ｃＢ调控序列，从而促进靶基因的转录［１０１］。 ＮＦ．ｒ．Ｂ已经是一个典型的调控性转录因子，在众多细胞中表达并发挥作用，具有广泛的生 物学作用。ＮＦ．ＫＢ参与调控众多基因的表达，是机体免疫应答和炎症反应的主要调节因子［１０２１， 同时也参与胚胎发育［１０３］、细胞凋亡［１０４］、细胞周期［１０５］的调控。ＮＦ．ｒＢ的异常活化与多种疾 病的发病机制相关［１０６】，包括炎症、血管疾病、肿瘤、病毒感染、脑血管疾病、阿尔茨海默病、 帕金森氏病、过敏性脑炎、感染性休克、风湿性关节炎、支气管哮喘、动脉粥样硬化等病理过 程。ＮＦ－ｒ，Ｂ是目前进行转录治疗药物开发的一个重要靶点。１．３．２ＮＦ．ＫＢ复合物的组成ＮＦ－ｒ，Ｂ是由Ｒｅｉ／ＮＦ．ｒ，Ｂ家族的多肽成员组成的一组转录因子，哺乳动物细胞中发现的ＮＦ．ｒ，Ｂ／Ｒｅｌ 家族包括ＮＦ―ｒ，Ｂ１（ｐ５０及其前体ｐ１０５）、ＮＦ－ｒＢ２（ｐ５２及其前体ｐ１００）、ＲｅｌＡ（ｐ６５）、ＲｅｌＢ、Ｒｅｉ（ｃ－Ｒｅｌ） ５位成员［１０７】。这些蛋白质都有一个大约由３００个氨基酸组成的Ｎ末端，称为Ｒｅｌ同源区（Ｒｅｌｈｏｍｏｌｏｇｙｄｏｍａｉｎ，ＲＨＤ），其中包括ＤＮＡ结合部位、二聚体化部位及核定位信号（ｎｕｃｌｅａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ，ＮＬＳ）。Ｒｅｌ／ＮＦ．ｒ．Ｂ家族成员借助疏水性相互作用介导的二聚化作用，形成二聚体结构。Ｒｅｌ／ＮＦ．ｒＢ 家族的成员之间几乎可以形成所有理论上可能组合形式的同源和异源二聚体（其中， ＲｅｌＢ／ＲｅｌＢ、ＲｅｌＢ／ＲｅｌＡ和ＲｅｌＢ／Ｒｅｌ到目前为止尚未检测到）。不同的ＮＦ．ｒ，Ｂ／Ｒｅｌ蛋白二聚体具 有不同的结合序列，而且具有各自的特性。就人类而言，最先被确认的、且为唯一生存所必需的ＮＦ．ｒ，Ｂ是ｐ５０／ＲｅｌＡ（ｐ５０／ｐ６５），通常所说的ＮＦ．ｒ，Ｂ即指此。该二聚体与相应ＤＮＡ的心位点具有较高的亲和力。其中，ｐ６５的羧基端含有转录活化域；ｐ５０则与ＤＮＡ结合有关［１０８］。标 准ＮＦ．ｒ，Ｂ ｐＳ０与ｐ６５二聚体的结合序列为ＧＧＧＲＮＮＹＹＣＣ（其中Ｒ为嘌呤，Ｙ为嘧啶，Ｎ代表 任意碱基）。 在静息状态下，ＮＦ．１ｃＢ主要形成ｐ５０和ｐ６５异源二聚体并与其抑制蛋Ｉ兰ｔ（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｒ，Ｂ，Ｉｒ，．Ｂ） 结合而存在于细胞质当中。Ｉｒ３３主要包括Ｉｒ，．Ｂａ、Ｉ＇ｃＢＢ、Ｉｔ，Ｂ７、Ｉｒ，Ｂ￡及Ｂｃｌ－３等［１０９］，它们同样含有一段锚蛋白重复序列，从而覆盖了ｐ６５当中的ＮＬＳＢｌＯ］，进而阻止ＮＦ．心核易位并与其调 控基因启动子上心保守序列结合，阻止转录的进行。１．３．３ＮＦ．ＫＢ的激活炎症因子、化学因子、免疫应急、细菌感染、化学药物、凋亡介质及自由基等因素均可使Ⅻ？柚激活【１１１―１１２］（图１?８）。ＮＦ―ｌ（Ｂ信号通路有两种激活途径：经典途径和非经典途径。在经典途径的激活中，比如依赖促炎症细胞因子肿瘤坏死因子ａｆＴＮＦ―ｑ）刺激的信号通路，将导 致Ｉｒ，Ｂ激酶（ＩＫＫ）复合物ｐ亚基的激活，然后使Ｉｒ，Ｂ蛋白的Ｎ末端两个丝氨酸残基磷酸化（图 ｌ一９）。在非经典途径中，ＩＫＫａ被激活并磷酸化ｐ１００（图ｌ－８）。磷酸化的Ｉｒ，Ｂｓ被遍在蛋白连接９第１章综述酶识别，导致它们的聚泛素化及随后的降解，或者在ｐ１００存在的情况下通过蛋白酶体ｋ隗（ｆｏｒｒｅｖｉｅｗ，ｓｅｅ Ｋａｒｉｎ ａｎｄ Ｂｅｎ－Ｎｅｒｉａｈ２０００）。游离的ＮＦ―ｒ，Ｂ二聚体移位入核，结合到靶基因的启动子或增强子上的特多两旁列上。激活的ＮＦ－诏可通过多种机制被下调，包括凭借新合成的Ｉｒ，Ｂｏｔ蛋白结合核内的ＮＦ．１歪并将其输出到胞质。１．３．４ＮＦ．ＫＢ的靶基因东南大学硕士学位论文Ａ ＣｌａｓｓｉｃａｌＮＦ－ＫＢ ＰａｔｈｗａｙＢ ＡｌｔｅｒｎａｔｉｖｅＮＦ－一：Ｂ Ｐａｔｈｗａｙ图１．９ ＮＦ－１ｄ３激活信号通路的经典途径和非经典途径【１２５】 表１－１已报道的ＮＦ―ｒ，Ｂ的全部靶基因（包括直接靶基因和间接靶基因）Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓＡＳＣＢａｘＣｙｔｏｋｉｎｅｓ／Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ ａｎｄｔｈｅｉｒ ｍｏｄｕｌａｔｏｔ＇ｓ ＢＡＦＦＭＭＰ－９．ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｉｌｏｐｒｏｔｅｉｎａａｓｅ－９ ＭｅＣＫ ｉＮＯＳ ｎ－ＮＯＳ ●ＰＤＥ７ＡｌＢＬＩＭＰ．１ＣＣＬ５ ＣＣＬｌ５／Ｌｅｕｋｏｔａｃｔｉｎ／ＳＣ、＆～１５ ＣＣＬｌ７ ＣＣＬｌ９ ＣＣＬ２０ ＣＣＬ２２ ＣＣＬ２３／ＳＹ－气２３ ＣＣＬ２８ ＣＩＮＣ．１ ＊ＣＸＣＬ １ １Ｂｎｌ／Ａｌ Ｂｃｌ－ｘＬ Ｂｃｌ－２ Ｂ７－Ｈｌ ＢＮＩＰ３ Ｃａｓｐａｓｅ－Ｉ Ｉ Ｎｒｌ３ ｅ－ＦＬＩＰＰＩＭ－ｌＰｌｋ３ ＰＩＫ３ＣＡ ＊ＰＰ５ ＰＫＣｄｅｌｔａ ＰＬＣｄｅｌｔａ ｌ ＊ＰＴＧＩＳ，ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓｙｎｔｈａｓｅＣＤ９５（Ｆａｓ）ＣＩＤＥＡ ＋Ｆａｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ－Ｉｌｌ第１章综述Ｅｏｔａｘｉｎ Ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅ Ｇｒｏ ａｌｐｈａＣＪｒＯＦａｓ－Ｌｉｇａｎｄ ＩＡＰｓＩＥＸ－ＩＬ＋ＰＧＥＳ，ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎＥ ｓｙｎｔｈａｓｅ ＰＴＰｌＢｂｅｔａ即ＲＡＦ―ｌＴＲＡＦ－２ＰＴＨｒＰ ＲＡＣＫｌ ●ＲＥＶ３ Ｓｌ丘ｌ－２ Ｓｅｒｐｉｎ ２ＡＧｒｏ ｇａｍｍａ ＣＪｒＯ－１ ’ＩＣＯＳＩＦＮ－ｇ ＩＬ－ｌａ’ＴＲＡＦ－２ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃａｒｐ）ＸＬ气ＰＧｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ，ｌｉｇａｎｄｓ，ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓａｎｔａｇｏｎｉｓｔ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ ＢＣＡＰ ＢＤＮＦＳＩ―盯ｌ ＳＮＡＲＫ ＳＳ√虹’ ‘ＳＵＶ３ １飞ＲＴ Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ ＴＴＧ 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ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａａｓｅ－３串代表基因在启动子区有心位点但尚未被证实受ＮＦ．ＫＢ的调控；或者基因的表达与增强的ＮＦ．ＫＢ活性相关但尚未被证实为其直接靶基因。参考文献见：ｈｔｔｐ：／／ｐｅｏｐｌｅ．ｂｕ．ｅｄｕ／ｇｉｌｍｏｒｅ／ｎｆ－ｋｂ／ｔａｒｇｅｔ／ｉｎｄｅｘ．ｈｍａｌ１．４本论文研究背景经过几十年的发展，鉴定转录因子结合靶点及靶基因的研究取得了很多的成果，不仅诞生了很多重要技术，对很多重要转录因子（如ＮＦ．佃、ｐ５３、ＧＲ、ＳＴＡＴ等）的全基因组ＤＮＡ靶点及靶基因的研究也取得了显著的进展，越来越多的转录因子靶基因被鉴定出来。但截止目前 还没有任何一个转录因子的全基因完整ＤＮＡ靶点及靶基因名单（１ｉｓｔ）得到阐明。因此，需要 创新研究思路，发展新的转录因子靶基因研究策略，以便高效识别转录因子靶基因，鉴定出一 个转录因子所有的靶基因（可称为“靶基因谱”），为转录因子靶基因转录调控网络的绘制奠 定基础。 近年来，大量转录因子ＤＮＡ靶点及靶基因预测生物信息技术以及生物学实验技术得到发 展。但生物信息技术和生物学实验技术各有优缺点，单纯依靠哪种技术都不能完全胜任转录因 子的全基因完整ＤＮＡ靶点及靶基因的鉴定识别研究。因此，将生物信息技术与生物学实验方 法如染色体免疫沉淀（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ，ＣＨＩＰ）等相结合，成为该领域研究的显著特 征，并因此取得了显著的成果［３６，４２，１２６．１３５１。大量新颖的研究表明，要在全基因组范围描述 转录因子的ＴＦＢＳ及靶基因，必须将干湿实验技术有机结合，才能尽快弄清一个转录因子的功 能性ＴＦＢＳ及靶基因［１３６―１４０】。 ｄｓＤＮＡ微阵列芯片是体外研究ＤＮＡ结合蛋白与ＤＮＡ相互作用的一种重要技术【１８】。因此， 我们实验室从２０００年就开始了ｄｓＤＮＡ微阵列芯片的相关研究。针对当时国际上已经出现的双分 子（ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ）ｄｓＤＮＡ微阵列芯片的不足之处，我们提出了单分子ｄｓＤＮＡ微阵列芯片（ｕｎｉ．ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｓＤＮＡｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）概念，并发展了三种单分子ｄｓＤＮＡ微阵列芯片制备技术【２４．２６，１４１】。同时制备了针对重要转录因子ＮＦ．ｒＢ的全单核苷酸突变ｄｓＤＮＡ微阵列芯片，用该 芯片研究了ＮＦ．１ｃＢ对大量单核苷酸突变ＤＮＡ位点的结合特异性和亲合性，发现有些核苷酸的突 变对亲合性影响不大，而有些核苷酸的突变会导致亲合性的剧烈下降，因此筛选出９个具有较高 亲合性的单核苷酸突变位点【２６】，并且推断这些突变位点若在基因组存在，有可能是ＮＦ－ｒ，Ｂ的结 合位点，其临近基因也可能是ＮＦ－ｒ，Ｂ的靶基因。 基于这些研究，我们构思出一种转录因子ＤＮＡ靶点及靶基因研究的新思路，即“湿实验 ＿÷干实验＿湿实验”紧密结合技术体系。首先以湿实验手段获得一个转录因子与大量人工设计 ＤＮＡ结合序列的结合特异性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）及亲合性（ａｆｆｉｎｉｔｙ），筛选出那些具有较高亲合性的结１５第１章综述合序列（湿实验技术）；然后以干实验（生物信息学技术）手段扫描人全基因组，定位这些序列 在基因组中的分布，将它们推定为转录因子在基因组中的假定结合位点（ｐｕｔａｔｉｖｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ）， 并依据这些位点找出附近的基因，将这些基因推定为转录因子在基因组中的假定靶基因（ｐｕｔａｔｉｖｅ ｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｓ）；最后，以干实验预测的假定结合位点及靶基因名单为蓝图，指导新的湿实验研究，以便快速高效鉴定转录因子的功能性（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）结合位点及靶基因。 在新的研究思路中，第一次湿实验是ｄｓＤＮＡ微阵列芯片（ｄｓＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）实验，第二次 湿主要是染色质免疫沉淀（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｍｍｕｎｏ－ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ，ＣＨＩＰ）、荧光定量ＰＣＲ、转录因子诱 骗子（ｄｅｃｏｙ）、凝胶迁移实验（ＥＭＳＡ）、ＲＮＡ干扰、过表达技术等。干实验是基于第一次湿实 验数据的生物信息学分析、归纳和预测。 我们已经用转录因子蛋白ＮＦ．ｒ，Ｂ的单核苷酸突变ｄｓＤＮＡ微阵列芯片研究证明了该技术体系 中第一次湿实验的有效性和可行性【２６】。因此，本论文希望通过进一步的“干实验－÷湿实验”结 合，证明该技术体系的可行性。１６东南大学硕士学位论文第２章转录因子ＮＦ．ＫＢ ＤＮＡ结合位点全基因组扫描及靶基因预测ＮＦ．ｒ，Ｂ是由Ｒｅｌ／ＮＦ．ｒｄ３家族的多肽成员组成的一组转录因子。１９８６年，ＮＦ－心首次被确认为一种能与免疫球蛋白Ｉｇｌｃ的轻链基因的增强子元件（５＇－ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ－３’）相结合的核因子［１００】。 王进科等根据这一序列设计了单碱基突变的寡核苷酸探针，并用双链ＤＮＡ微阵列（ｄｓＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）技术检测了它们与ＮＦ．ｒＢ的亲和性，研究表明ＮＦ－ｒｄ３对野生型结合位点 ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ以及９个引入单核苷酸突变的人工序列都具有很高的亲合性【２６】。并且推断这些 突变位点若在基因组存在，有可能是ＮＦ．ｒ．Ｂ的结合位点，其临近基因也可能是ＮＦ－ｒ，Ｂ的靶基因。 因此，本章中我们将这１０个序列做为全基因组扫描的对象，提取了这１０个序列在基因组中的定 位信息，以及附近的基因信息，并对基因组存在序列的分布特征、附近基因的功能聚类等进行 了细致分析。 以前，在有关转录因子蛋Ｉ刍ＤＮＡ结合位点鉴定研究中，常常仅将基因上游短距离ＤＮＡ序列 （启动子）做为转录因子ＤＮＡ结合位点研究的范围。近年来的研究却表明，转录因子的ＤＮＡ结 合位点常常与其靶基因转录起点（ＴＳＳ）距离很远，将这类ＤＮＡ结合位点称为长程位点（１０ｎｇ－ｒａｎｇｅ ｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅ）［１４２］。实验研究表明，这类结合位点通常形成噜哺（１００ｐ）结构使结合其上的转录因子与基本转录机器（基础转录因子与ＲＮＡ聚合酶形成的复合物）发生相互作用， 调控基因的表达水平［１４３］。染色质免疫沉淀（ＣＨＩＰ）研究表明，ＮＦ．ｒＢ的不少靶基因受长程位 点的调节，最远的达４０ｋｂ；同时很多位点还定位于基因内元（ｉｎｔｒｏｎ）和基因下游（３’ｒｅｇｉｏｎ）［１ １８， １４４．１４５】。基于这些新的认识，在本研究中，我们将位点附近基因信息的提取范围从传统的 ．１ｋｂ－－２ｋｂ扩展到基因上下游ｌＯ ｋｂ及整个基因ＤＮＡ序列，以便尽可能避免遗漏有价值的信息。２．１实验方法２．１．１１０个位点的人类全基因组扫描及周围基因提取Ｓ等设计的一个ＢＬＡＳＴ搜索工具：ＴＦ－ＴａｒｇｅｔＭａｐｐｅｒ［８８】使用Ｈｏｒｓｍａｎ（ｈｔｔｐ：／／ｔｆｔａｒｇｅｔｍａｐｐｅｒ．ｅｒａｓｍｕｓｍｃ．ｎｌ／）在人全基因组序列中检索以＿ＥＩＯ个位点，并提取周围 （１０ｋｂ）已知基因的ＥｎｓｅｍｂｌｇｅｎｅＩＤ。共得到４２０１７个靶点，其中２２１７０个靶点１０ｋｂ内有基因。ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ，我们将上下游ｌＯｋｂ内有已知基因的位点视为ＮＦ．ｒ，Ｂ的推测结合位点（ｐｕｔａｔｉｖｅＰＢＳｓ），将附近１０ｋｂ内的基因视为ＮＦ－ｒ．Ｂ的推测靶基因（ｐｕｔａｔｉｖｅ ｔａｇｅｔ ｇｅｎｅｓ，ＰＴＧｓ）。 ＢＬＡＳＴ／Ｅｎｓｅｍｂｌ参数设置：Ｐｒｏｇｒａｍ Ｎａｍｅ：ｂｌａｓｔｎ；Ｄａｔａｂａｓｅ：ｈｕｍａｎ；ｅ－ｖａｌｕｅ：１００００；Ｗｏｒｄｓｉｚｅ：１０；Ｅｎｓｅｍｂｌ ｗｉｎｄｏｗ：１００００。２．１．２ＤＮＡ靶点与基因位置关系的确定通过Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｂｉｏｍａｒｔ获取ＰＴＧｓ的详细基因信息（基因官方名称、基因全名、染色体定位、 转录本信息、基因类型及状态等信息），并确定ＰＢＳｓ相对于ＰＴＧｓ的定位。ＤＡＴＡＢＡＳＥ：Ｅｎｓｅｍｂｌ ４７；ＤＡＴＡＳＥＴ：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｇｅｎｅｓ（ＮＣＢｌ３６）；Ｆｉｌｔｅｒｓ－ＩＤ ｌｉｓｔ ｌｉｍｉｔ： Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｇｅｎｅ ＩＤ（ＲＩ］ＴＦ．ＴａｒｇｅｔＭａｐｐｅｒ提取的位点周围（１０ｋｂ）已知基因的Ｅｎｓｅｍｂｌｇｅｎｅ ＩＤ）。２．１．３ＮＦ．ｒ，Ｂ靶基因的文献检索查找关于ＮＦ．ｒ，Ｂ靶基因的文献报道。主要参考美国波士顿大学托马斯教授创建并维护的ＴｈｅＲｅｌ／ＮＦ．ｋａｐｐａＢ ＴＲＡＮＳＦＡＣ ７．０ ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＦａｃｔｏｒ网站（ｈｔｔｐ：／／ｐｅｏｐｌｅ．ｂｕ．ｅｄｕ／ｇｉｌｍｏｒｅ／ｎｆ－ｋｂ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）和Ｐｕｂｌｉｃ数据库的信息。 ＧＥＮＥＳ栏目收录了文献报道的ＦａｃｔｏｒＴｈｅ Ｒｅｌ／ＮＦ．ｋａｐｐａＢ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ网站的ＴＡＲＧＥＴＮＦ．ｒ，Ｂ相关靶基因，包括直接靶基因和间接靶基因。在ＴＲＡＮＳＦＡＣ的ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＣｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ栏目下，依次进入４．１．１ Ｆａｍｉｌｙ：ａｅＶａｎｋｙｒｉＩｌ条目下的人相关ＮＦ．ｒ，Ｂ亚型的ｆａｃｔｏｒ１７查看相将不同位点及其对应的靶基因标记在染色体上，以图谱的形式展现出来。然后利用Ｃｒｕｚ）提供的交互式基因组可视化浏览器―Ｇｅｎｏ―ｍｅ ―Ｂｒｏｗ―ｓｅｒ，查看感兴趣区域靶点及基因分布的详细信息。ｕｃｓｃ（ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｓａｎｔａ２．１．５功能聚类利用Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ开发维护的在线基因聚类分析工具ＷｅｂＧｅｓｔａｌｔ（ＷＥＢ．ｂａｓｅｄ ＧＥｎｅＳｅＴＡｎａＬｙｓｉｓＴｏｏｌｋｉｔ，ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ．ｅｄｕ／ｗｅｂｇｅｓｔａｌｔ／）对位点位于－ｌｋｂ的推测靶基因进行Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆＡｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ ＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＧｏ功能聚类。 然后利用ＮＩＡＩＤ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）开发维护的基因功能注ｆｏｒ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ。Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，释及可视化数据库工具ＤＡＶＩＤ（Ｄａｔａｂａｓｅｈｔｔｐ：／／ｄａｖｉｄ．ａｂｃｃ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ／ｈｏｍｅ．ｊｓｐ）６．７，通过它的基因统计分类功能，对文献报道的确证靶 基因（４７１个）和ｌＯ个位点的９８６９个ＰＴＧｓ分别进行功能分类的统计分析，并分别绘制功能分 类条形图。２．２实验结果２．２．１Ｍａｐｐｅｒ，在人全基因组对序列（ＧＧＧＡＣ肌Ｃ、ＧＧＧＡＣＴＴＣＣＣ、 ＧＧＧＡＣｌＴｒＡＣ、ＧＧＧＡＣＴＧＴＣＣ、ＧＧＧＡＣ唧Ｃ）进行扫描，并提取周围（０ｋｂ、ｏ￣ｌｋｂ、１￣２ｋｂ、利用＂ＩＴ．ＴａｒｇｅｔＧＧＧＡＴＴＴＴＣＣ、１０个序列的基因组定位信息及其相关的基因信息ＧＧＧＡ Ａｒｒ］陀Ｃ、ＧＧＧＡＧＴｒｒＣＣ、ＧＧＧＧＣＴＩＴＣＣ、ＧＧＧＴＣｌｌＴＣＣ、２～５ｋｂ、－１０ｋ）基因信息。然后用Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｂｉｏｍａｒｔ获取ＰＴＧｓ的详细基因信息，确定ＰＢＳｓ相对于 ＰＴＧｓ功能区的定位。部分扫描结果如表２．１、表２．２，位点位于．１ｋｂ内的ＮＦ．ｒ．Ｂ假定靶基因见附录。 表２－１ 序列ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ在Ｙ染色体上的扫描结果（ＴＦＴａｒｇｅｔＭａｐｐｅｒ）１８东南大学硕士学位论文３６４５ ３６４６ ３６４６ ３６４７ ３６４８ ３６４９ ３６５０ ３６５ ｌ ３６５２ ３６５３ ３６５４ ３６５５ ３６５５ ３６５６ ３６５６ ３６５７ ３６５８ ３６５９ ３６６０ ３６６ｌ ３６６２ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ ＧＧＧＡＣｌ、ＴｒＣＣ ＧＧＧＡＣＴｌｌＣＣ ＧＧＧＡＣｌｌＴＣＣ ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ ＧＧＧＡＣｌ’ＴＴＣＣ ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ ＧＧＧＡＣｌ’ＴＴＣＣ ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ ＧＧＧＡＣｌｌＴＣＣ２４ ２４ ２４ ２４ ２４ ２４ ２４ ２４ ２４ ２４ ２４ ２４ ２４ ２４ ２４ ２４ ２４ ２４ ２４ ２４ ２４２０４４０２６３ ２２０８１０４９ ２２０８ １ ０４９ ２２ ｌ ０４５９０ ２２４５ １６１５ ２２４９６２１４ ２２５３５５７８ ２２７４００７ｌ ２２８３３４５ ｌ ２２９０９７７７ ２３１６１８７９ ２３２０１２４２ ２３２０１２４２ ２４１０６００６ ２４１０６００６ ２４１４４８６９ ２４８０２８３ ｌ ２４８８２７１０ ２５８９８５０１ ２５９７８３７３ ２６０４７０４２２０４４０２７２ ２２０８１０５８ ２２０８ ｌ ０５８ ２２ ｌ ０４５９９ ２２４５ １６２４ ２２４９６２２３ ２２５３５５８７ ２２７４００８０ ２２８３３４６０ ２２９０９７８６ ２３１６１８８８ ２３２０１２５１ ２３２０１２５ ｌ ２４１０６０１５ ２４１０６０１５ ２４１４４８７８ ２４８０２８４０ ２４８８２７１９ ２５８９８５ １０ ２５９７８３８２ ２６０４７０５ １．１ ｌ ｌ ｌ ．１ ．１ ．１ ．１ ．１ ｌ ｌ ｌ １ ．１ ．１ ．１ ．１ ｌ ．１ １ ．１ ＥＮＳＧ０００００１ ７２２９４ ＥＮＳＧ０００００２０５９９５ ＥＮＳＧ０００００２ ｌ ５５５８ ＥＮＳＧ０００００２１５５４０ ＥＮＳＧ０００００１９７９５５ ＥＮＳＧ０００００２０６０ １１ ＥＮＳＧ０００００１６９８００ ＥＮＳＧ０００００１６９８１ｌ ＥＮＳＧ０００００ ｌ ７４６２２ ＥＮＳＧ０００００ ｌ ７４６２２ ＥＮＳＧ０００００２０６０４６ ＥＮＳＧ０００００２０６０４６ＧＧＧＡＣＴｎＣＣＧＧＧＡＣｌ＿ＩＴＣＣ ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ ＧＧＧＡＣＴＩＴＣＣ ＧＧＧＡＣＴＩＴＣＣ ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ表２．２序列ＧＧＧＡＣｎ可ＣＣ在Ｙ染色体上１０ｋｂ内的基因（１０ｋｂ内含有序列ＧＧＧＡｃｌｌｍＣＣＥｎｓｅｍｂｌ Ｇｅｎｅ ＩＤ ＥＮＳＧ００００００９９７ １ ５ ＥＮＳＧ０００００２１５６０ｌ ＥＮＳＧ０００００１９７０３８ ＥＮＳＧ０００００１８８６８ｌ ＥＮＳＧ０００００１２９８６４ ＥＮＳＧ０００００１６５２４６ ＥＮＳＧ０００００ｌ ６５２４６ ＥＮＳＧ０００００２１５５７９ ＥＮＳＧ００００００９９７４９ ＥＮＳＧ０００００ｌ ７４６２２ ＥＮＳＧ０００００ｌ ６９８ １ｌ ＥＮＳＧ０００００ｌ ７４６２２ ＥＮＳＧ０００００２０６０４６ ＥＮＳＧ０００００２０６０４６ ＥＮＳＧ０００００１６９８００ ＥＮＳＧ０００００２０６０ １ １ ＥＮＳＧ０００００２１５５５８ ＥＮＳＧ０００００２０５９９５ ＥＮＳＧ０００００２ １ ５ ５４０ ＥＮＳＧ０００００１９７９５５１９的基因）（Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｂｉｏｍａｒｔ）Ｈｉｔ ＩＤ ３６３０ ３６３４ ３６３６ ３６３８ ３６４１ ３６４３ ３６４３ ３６４４ ３６４４ ３６４６ ３６４６ ３６４７ ３６４８ ３６４９ ３６５ｌ ３６５３ ３６５５ ３６５５ ３６５６ ３６５６ Ｇｅｎｅ Ｎａｍｅ ＰＣＤＨ １１ Ｙ Ｇｅｎｅ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｃｈｒ２４：４９２８２６７．５６７０２５６ ｅｈｒ２４：８２０８２３９．８２１０２４３ ＮＲ ００１５４７．１ ｅｈｒ２４：９２１４６７０．９２２０４８３ ｃｈｒ２４：１１７６９４８１．１１８３０６８２ ＶＣＹｌ ＨＵＭＡＮ ＮＬＧＮ４Ｙ ＮＬＧＮ４Ｙ ｃｈｒ２４：１４６０７０４６．１４６０７７８６ ｃｈｒ２４：１５１４４０２６．１５４６６９２４ ｃｈｒ２４：１ ５ １ ４４０２６．１ ５４６６９２４ ｃｈｒ２４：２０１９７２８３．２０１９７４５６ ＣＹ６ｒｆｌ ５Ａ ｃｈｒ２４：２０ ｌ ８８６２４．２０２ １１ ５６４ ｃｈｒ２４：２２０８２６４６．２２ １２０６００ ｃｈｒ２４：２２０６４７９３．２２０７３２４２ ｃｈｒ２４：２２０８２６４６．２２ １ ２０６００ ｃｈｒ２４：２２４３５６１１－２２４９４６８３ ｃｈｒ２４：２２４３５６１１－２２４９４６８３ ｃｈｒ２４：２２７２４０７９．２２７３８４８３ ｃｈｒ２４：２２８６４３８３．２２９７３４ １６ ｃｈｒ２４：２３２０８１５４．２３２１２５４５ ｃｈｒ２４：２３２０４７８０．２３２０４８８４ ｃｈｒ２４：２４０９４７ １ ２．２４０９９ １ ０３ ｃｈｒ２４：２４１０２３７３．２４１０２４７７ Ｈｉｔ Ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｔｈｅｒ ｉｎｔｒｏｎ ｏｔｈｅｒ ｉｎｔｒｏｎ ．３５６０．５ ｏｔｈｅｒ ｉｎｔｒｏｎ ９５０２．５ １ｓｔ ｉｎｔｒｏｎ ｏｔｈｅｒ ｉｎｔｒｏｎ ２９２．５ ｌ ｓｔ ｉｎｔｒｏｎ ．１ ５９２．５ ７８ １１．５ ｏｔｈｅｒ ｉｎｔｒｏｎ ｏｔｈｅｒ ｉｎｔｒｏｎ －１５３５．５ －１５９２．５ １ ｓｔ ｉｎｔｒｏｎ ．６９０７．５ ―３５３３．５ 一６９０７．５ ―３５３３．５ＲＢＭＹｌＢ Ｑ ｌ ５３７８ＨＵ删ＲＢＭＹ ｌ ＢＲＢＭＹｌＥＲＢＭＹｌＥ ＮＰ ６８９７９８．１ＲＢＭＹ ｌ Ｆ第２章转录因子ＮＦ．１ｃＢＤＮＡ结合位点全基因组扫描及靶基因预测３６６２ＥＮＳＧ０００００１７２２９４Ｑ９６ＲＭ９ＨＵ＾嗄Ａ小ｉｃｈｒ２４：２６０３８４４３．２６０４２２４０４８０６．５２．２．２不同范围推测靶点及推测靶基因数目统计对不同范围的推测靶点进行统计，统计结果如下。表２．３ｃｈｒ ｕｐｓ打ｅａｍ ｌ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ ｌＯ １１ １２ １３ １４ １５ １６ １７ １８ １９ ２０ ２ｌ ２２ ２３ ２４ Ｓｕｍ ２４０ １５２ １４１ １０５ １０６ １３ｌ １１４ １０ｌ １０１ ８７ １５０ １０５ ４４ ９４ ９１ ９８ １６２ ２８ １３４ ７ｌ ３３ ７２ ７３ １４ ２４４７ ｕｐｓ仃ｅａｍ １９６ １３６ １２０ ８１ ９０ １０７ １１６ ６９ １１３ ８０ １２７ ９９ ３４ ７０ ９２ ７５ １１６ ３０ １３０ ５ｌ ２４ ５８ ８０ １０ ２１０４ ｕｐｓ打ｅａｍ ５ｌ ３７ ２３ ２６ ３２ ４２ ２９ ２６ ２２ ３３ ４４ ２１ ８ ３１ ２３ ３７ ４６ ７ ４５ １５ ３ １５ １８ ｌ ６３５１０个ＴＦＢＳ（ＰＢＳｓ）的统计结果（相对于ｇｅｎｅ）１０ｋｂ ５ｋｂ ｌｋｂ 一１Ｓｔ．ｏｔｈｅｒ ｉｎｔｒｏｎ ｉｎｔｒｏｎ ５０４ ３１９ ２７５ ２２１ ２３３ ３００ ２９２ ２１８ ２１９ ２７２ ２７１ １８９ １３８ １７４ １６２ １４６ １９９ ９２ １６１ １２６ ９４ ９８ ２１９ １０ ４９３２ １０６６ ８１３ ８２３ ５３２ ５９６ ６１９ ６９４ ５０３ ５４７ ６８９ ５３３ ５０９ ２８９ ３５２ ３７１ ３９２ ４４８ ２６０ ３３８ ３３４ １６７ ２３７ ３９０ ３４ １１５３６ｅＸ０ｎ３?１０ｋｂ蚰锄ｎｏｔａｔｃｄ４３７ ３０８ ２５２ １８ｌ １９５ ２１５ ２７３ １９４ １９０ １８４ ２７５ ２３１ ７０ １５９ １６７ ２２０ ２８２ ７１ ２６３ １３ｌ ６８ １３４ ２０１ ２２ ４７２３ １２２８ １７５３ １３１７ １４３６ １３６４ １１９９ ９７８ １１４７ ８５４ ９４４ ８６８ ９０２ ７２３ ６０７ ４８０ ５９１ ３７１ ６３８ ２１１ ４３０ ２４４ ２１０ １１４３ ２０９ １９８４７１５４ ９０ ９１ ４８ ５２ ６３ ５０ ４１ ４１ ５８ ７５ ６９ １９ ３１ ４２ ５０ ７４ １４ ６４ ４１ １８ ３０ ５４ ０ １２６９表２．４推测靶点（ＰＢＳｓ）分布总体统计（相对于ｇｅｎｅ）５－１０ｋｂ ＴＦＢＳ ｕｐ ｕｐ ｕｐｉ‘ｎｔｒｏｎｌ一５ｋｂＯ－ｌｋｂ１ｓｔｏｔｈｅｒｅＸ０ｎ０～１ ０ｋｂ ｄ‘ｏｗｎｔｌｌｌａｎｎｏ ｔａｔｅａ‘ｉＩｌｉｒｏｎ ｍ东南大学硕士学位论文ＧＧＧＡＣＴｌｌＴＣＳｕｍ２１４ ２４４７１８２ ２１０４６１ ６３５４８６ ４９３２１ １５８１ １７ １２６９４４０ ４７２３２００５ １９８４７１１５３６表２。５推测靶基冈（ＰＴＧｓ）分布统计．５－１０ｋｂ１－５ｋｂ０－ｌｋｂ１ｓｔｏｔｈｅｒｅｘｏｎ１０ｋｂＴＦＢｓ ＧＧＧＡＣｌｎＴＣＣ ＧＧＧＡＣＴＴＣＣＣ ＧＧＧＡＴｌ＿ＩＴＣＣ ＧＧＧＡＡＴｌｌ℃Ｃ ＧＧＧＡＧｌ’ＴＴＣＣ ＧＧＧＧＣＴＴｒＣＣ ＧＧＧＴＣ下ＩｖｒＣＣ ３０７ ２７５ ２８９２７５ｉｎｔｒｏ Ｉｎｔｒｏｎ ｉｎｔｒｏ Ｉｎｔｒｏｎ ｐ ｕｎ ｕｐ ｗｏ ｄｄｏｗｎ ｕｐ ２０４ ２２０ ２９４２３５７６ ７９ ６９７２４４８ ４２３ ５６６５０８８９７ ８８９ １２５ ｌｌ １２９１２８ １ ５６ １３３ １０２ ９０ １９０ ｌ １６ ５９ １７５ １１８５６０ ５６２ ６５２ ５６４ ５７６ ６５３ ６６１ ２３３ ５ １９ ４９２２８１ ２７８ ２８５ １２２ ２６５ ２２７２２７ ２４７ ３０７ ９４ ２２０ １８８４１ １００ ６１ ２８ ６８ ６２４９９ ５０８ ５２５ ２４２ ４０７ ４５２１０８０ １０６６ ｌ １９８ ５９０ ８７４ １００３ＧＧＧＡＣＴ丌ＡＣＧＧＧＡＣＴＧＴＣＣ ＧＧＧＡＣＴＴＩＴＣＰＴＧｓ ｉｎ Ｐｕｔａｔｉｖｅ ＴＦＢＳ １０ｋｂｕｎｃｈｅｃｋｅｄ ＰＴＧｓＣｍｈｅｃｋｓｅｄ篡尊陋Ｇ―ｅｎｅｓ如ｂ惋ｙＢ２Ｍ，ＢＣＬ２，ＢＣＬ３，ＣＣＬ５，ＣＤ３Ｇ，ＣＲ２，ＣＳＦｌ，ＣＳＦ２，ＣＳＦ３，ＥＮＧ，ＦＡＳ，ＩＣＡＭｌ，ＧＧＧＡＣｌｖＩＴＣＣ ２４２ １ ２３９３ ２８ＩＬｌｌ，ＩＬｌ５，几ｌＢ，ＩＲＦｌ，ＬＴＡ，ＬＴＢ，ＮＦＫＢ２，ＮＯＤ２，ＮＯＳ２，ＯＰＩｔＭｌ，ＰＬＣＤｌ，ＰＳＭＡ２， ＰＳＭＢ９，ＴＡＰｌ，ＴＮＦ，ＴＮＦＡＩＰ３ＡＬＯＸｌ}