技术篇细胞凋亡专题（六）Caspase-3活性的检测
Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中 caspase-3
为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。
1. Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的 Caspase-3
及对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。
方法：收集细胞→PBS洗涤→抽提细胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE
电泳→硝酸纤维素膜或PVDF膜转移→5%脱脂奶粉封闭，室温1.5~2h或4°C过夜→Caspase-3多抗或单抗室温反应1~2h或4°C过夜→TBS-T（含0.05%
Tween 20的TBS）洗3次，5~10min/次→HRP-标记的羊抗鼠IgG或AP标记的羊抗鼠IgG室温反应1~2h→
TBS-T洗3次， 5~10min/次→ECL显影或NBT/BCIP显色。图9
2. 荧光分光光度计分析
原理：活化的Caspase-3能够特异切割 D1E2V3D4-X 底物，水解 D4-X
肽键。根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。
方法：收获细胞正常或凋亡细胞，PBS洗涤，制备细胞裂解加
Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽荧光底物）37°C反应1h，荧光分光光度计（Polarstar）分析荧光强度（激发光波长380nm，发射光波长为430-460nm）。
结果：图10
3. 流式细胞术分析
方法：收获细胞正常或凋亡细胞，PBS洗涤，加Ac-DEVD-AMC 37°C反应1h
UV流式细胞计分析caspase-3阳性细胞数和平均荧光强度。
结果：图11
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以上网友发言只代表其个人观点，不代表新浪网的观点或立场。肿瘤条件培养基诱导血管平滑肌细胞凋亡--《河北医科大学》2015年硕士论文
肿瘤条件培养基诱导血管平滑肌细胞凋亡
【摘要】：目的:肿瘤的生长和转移依赖于新生血管生成,而肿瘤新生血管缺乏平滑肌层,血管的不稳定性为肿瘤的侵袭和转移提供了条件。近年来,有关肿瘤血管生成的研究主要集中于肿瘤细胞与内皮细胞的相互作用。肿瘤发生过程对血管平滑肌细胞(VSMC)特性有何影响至今尚无研究报道。本研究采用肿瘤条件培养基(TCM)模拟肿瘤发生微环境,观察肿瘤细胞对VSMC增殖的影响,并探讨其分子机制,为抗肿瘤药物的开发提供新思路和作用靶标。方法与结果:1 TCM抑制VSMC增殖MTT分析与细胞计数结果显示,与对照组相比,不同浓度TCM孵育VSMC 24 h,VSMC增殖活力与细胞数量均明显下降(P0.05),且随TCM稀释倍数增多,其对VSMC增殖活力与细胞数量的抑制作用减弱。2 TCM不影响VSMC中PCNA的表达为了确定VSMC增殖活力下降的机制,用Western blot检测增殖标志物PCNA(增殖细胞核抗原)。结果显示,TCM孵育VSMC 24 h并未影响PCNA的表达。因此推测,VSMC增殖活力的降低、细胞数量的减少,可能并非通过增殖抑制,而是凋亡诱导的结果。3 TCM诱导VSMC凋亡Annexin V-FITC/PI试剂盒可检测细胞的早期、晚期凋亡活性,处理后的样品可用流式细胞仪和荧光显微镜检测。流式细胞术结果显示,TCM组的细胞凋亡高于对照组16.58±3.14%(P0.01),其中早期凋亡前者高于后者11.07±2.47%(P0.01),晚期凋亡前者高于后者5.51±0.79%(P0.01)。荧光显微镜结果也显示,TCM组的细胞凋亡明显高于对照组。JC-1试剂盒可检测膜电位的改变,从而反映细胞的早期凋亡情况。荧光显微镜结果显示,TCM组的早期细胞凋亡明显高于对照组。TUNEL试剂盒可检测细胞凋亡晚期过程中细胞核DNA的断裂情况。荧光显微镜结果显示,TCM组的晚期细胞凋亡明显高于对照组。4 TCM诱导VSMC中Caspase-3的活化Caspase-3为细胞凋亡关键执行分子,正常以酶原(32KD)的形式存在于胞浆中,其在凋亡早期阶段被激活,活化的Caspase-3由两个大亚基(17KD)和两个小亚基(12KD)组成,细胞凋亡的晚期和死亡细胞中,Caspase-3活性明显下降。Western blot结果显示,与对照组相比,TCM组的pro-Caspase-3表达量减少(P0.05),而cleaved-Caspase-3表达上调(P0.01)。表明TCM可诱导VSMC中Caspase-3的活化,进而诱导细胞凋亡。5 TCM诱导VSMC中Bax的表达,抑制Bcl-2的表达Bcl-2家族的表达和调控是影响细胞凋亡的关键因素之一,在细胞凋亡信号转导途径中发挥重要作用。Bcl-2和Bax分别是Bcl-2家族中最有代表性的抑制凋亡和促进凋亡基因。Western blot结果显示,与对照组相比,TCM组Bcl-2表达量减少,而Bax表达上调,Bax/Bcl-2比率升高(P0.01)。表明TCM可通过增强Bax表达活性、下调Bcl-2诱导细胞凋亡。结论:1 TCM诱导VSMC凋亡,是肿瘤组织血管结构异常的机制之一。2 TCM通过线粒体通路诱导VSMC凋亡,并涉及Caspase级联反应。
【学位授予单位】：河北医科大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2015【分类号】：R73-3
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400-819-9993　　生物通报道& 来自天津医科大学的李兵辉（Binghui Li）博士领导的科研小组，开发出了一种新型的遗传编码荧光生物传感器，证实在蛋白质裂解激活的条件下，这种传感器可用于检测细胞内的caspase-3活性。相关成果发表在7月16日的《自然通讯》（Nature Communications）杂志上。
凋亡（apoptosis）同细胞增殖、分化一样，是多细胞生命活动的基本特征之一，具有重要的生理意义。近年的研究表明，细胞凋亡不仅与许多正常的生理过程有关，而且细胞凋亡异常还是许多疾病产生的重要原因之一，如在肿瘤、免疫系统疾病/神经系统疾病及心血管系统疾病中，都已注意到存在异常的细胞凋亡。因此，细胞凋亡已成为近年生物学、细胞分子生物学及医学等领域研究的热点。相应地，其检测方法也日益完善。
Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中 caspase-3 为关键的执行分子,它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。而在细胞凋亡的晚期和死亡细胞中，caspase-3的活性明显下降。
为了方便监测多细胞环境中的caspase-3活性，研究人员开发出了一种遗传编码接通荧光生物学传感器（genetically encoded switch-on fluorescence-base indicator），这一传感器是一种环化的嵌合体，其中包含有一个caspase-3裂解位点作为开关。当遭到类caspase-3蛋白酶裂解时，这一传感器会发出荧光，由此可以实时监测这些caspases蛋白的活性情况。
研究人员构建出了组成性表达这些嵌合体的培养细胞，证实所有的健康细胞都不会发出荧光。而当将这些细胞暴露于凋亡刺激物之下时，死亡细胞显示出与caspase激活相关的强荧光。
利用这些工具，研究人员对各种条件下每个细胞中的caspase-3活性进行了实时监测，并第一次在改良的软琼脂克隆形成实验(soft agar assay)证实了，癌细胞的环境可以影响它们对于化疗药物的敏感性。这些生物传感器将帮助研究人员更好地了解类caspase-3蛋白酶的生物学意义。
（生物通：何嫱）
生物通推荐原文摘要：
Visualization of caspase-3-like activity in cells using a genetically encoded fluorescent biosensor activated by protein cleavage
Cytosolic caspase-3-like proteases, such as caspase-3 and caspase-7, have a central role in mediating the progress of apoptosis. Here to conveniently monitor caspase-3-like activity in the multicellular environment, we have developed genetically encoded switch-on fluorescence-base indicators that are cyclized chimeras containing a caspase-3 cleavage site as a switch. When cleaved by caspase-3-like proteases, the non-fluorescent indicator rapidly becomes fluorescent, and thus detects in real-time the activation of such caspases. We generate cultured cells constitutively expressing these chimeras, and all the healthy cells are non-fluorescent. When these cells are exposed to apoptotic stimuli, dead cells show strong fluorescence depending on caspase activation. With these tools, we monitor in real-time caspase-3-like activity in each cell under various conditions, and show for the first time that the environment of cancer cells affects their sensitivity to chemotherapeutic drugs in a modified soft agar assay. These biosensors should enable better understanding of the biological relevance of caspase-3-like proteases.
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联系信箱：股骨头坏死组织中半胱氨酰天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3与细胞凋亡的关系
Relationship between Caspase-3 and Apoptosis in Aseptic Necrosis of Femoral Head
目的 探讨半胱氨酰天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3在无菌性股骨头坏死(avascular/aseptic necrosis of femoral head,ANFH)进展过程中的表达及意义. 方法 21例(22髋)ANFH取股骨头病灶周围骨松质,其中早期ANFH组(6髋),中期ANFH组(8髋),晚期ANFH组(8髋);另取19例(19髋)新鲜股骨颈骨折的股骨头对应部位骨松质为对照组.采用原位末端标记(TUNEL)法、空骨陷窝计数法检测细胞凋亡水平,比色法检测股骨头组织Caspase-3活性. 结果 骨陷窝空虚百分率(F=45.43,P=0.000)、成骨细胞凋亡率(F=120.86,P=0.000)等凋亡指标均随ANFH临床分期进展而显著升高,ANFH早、中期组显著高于对照组(q=18.899,P<0.05;q=6.398,P0.05).Caspase-3活性与细胞凋亡率统计学相关性不显著(r=0.126,P=0.425). 结论 在ANFH进展过程中,Caspase-3可能不是细胞凋亡的主要执行分子;Caspase-3在ANFH进展中可能发挥非凋亡作用.
Shi Lei[1]
Zhang Bing[2]
Xia Chun[1]
厦门大学附属中山医院骨科,厦门,361004
厦门大学医学院形态学教研室,厦门,361004
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&&8:00-11:30,13:00-17:00(工作日)低剂量照射对K562细胞凋亡、MMP及Caspase-3活性影响的实验研究--《肿瘤学杂志》2015年12期
低剂量照射对K562细胞凋亡、MMP及Caspase-3活性影响的实验研究
【摘要】：[目的]探讨低剂量照射及低剂量联合大剂量照射对人红白血病细胞系K562凋亡、线粒体膜电位(MMP)变化及Caspase-3活性的影响及其可能机制。[方法]实验分成4组:对照组(0Gy)、低剂量照射组(0.08Gy、0.2Gy、0.5Gy、0.8Gy,LDR组)、大剂量照射组(6Gy,HDR组)及低剂量联合大剂量照射组(0.08Gy/6Gy、0.2Gy/6Gy、0.5Gy/6Gy、0.8Gy/6Gy,LDR/HDR组),体外培养K562,取对数生长期细胞分瓶分组分别给予不同剂量的6MV-X射线照射;照射后按不同时间点收集细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡及照射后24h细胞MMP(△Ψm)的变化,酶标仪检测照射后24h Caspase-3活性(A405nm OD值)变化。[结果]LDR后48h凋亡增加(P0.05),96h达峰值(P0.01),且随照射剂量增大而增加,0.5Gy及0.8Gy剂量组最高(P0.01);LDR/HDR后24h凋亡增加(P0.05),持续至96~120h达峰值(P0.01),以0.5Gy/6Gy及0.8Gy/6Gy组凋亡最高,较对照组及HDR组比较差异均有统计学意义。LDR 24h后K562的△Ψm下降,LDR/HDR组△Ψm亦明显下降,以0.5Gy、0.8Gy、0.5Gy/6Gy及0.8Gy/6Gy组下降更明显(P0.05)。LDR 24h后Caspase-3活性增强(P0.05);LDR/HDR 24h后,Caspase-3活性进一步增强(P0.05)。[结论]LDR能诱导K562凋亡,LDR有增强HDR对K562的凋亡作用;LDR后24h MMP下降及Caspase-3活性增强,且早于凋亡的增加,其可能机制为LDR增加K562细胞线粒体膜通透性,使MMP下降,Caspase-3活性增强,激活Caspase-3级联反应而启动线粒体凋亡途径。
【作者单位】：
【基金】：
【分类号】：R730.55【正文快照】：
the activity of caspase-3.Subject words:low-dose radiation(LDR);leukemia/K562;mitochondrial membrane po-tential(MMP);caspase-3;hyper-radiosensitivity(HRS)低剂量照射(low-dose radiation,LDR)指一次性受照射剂量低传能线密度(linea energy transfer,LET
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