液相色谱（LC）
主题：【分享】高效液相色谱仪的结构和原理
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发表于： 10:23:17
高效液相色谱仪的结构和原理首先需要讲的是HPLC 主要测试的是有机物质，无机物质用AAS，UV等光谱仪器，或者用离子色谱测试。经常被我们初学者视为高级货。它确实是挺高级的。我们一些高校的实验室，也经常把高效液相色谱当作宝贝里三层外三层小心地保护着。在校的同学们很难一睹其芳容。所以，一些高校的HPLC课程，就是讲授理论，同学们最多集体像看大熊猫一样地排队到实验室看下HPLC。而老师们说，这个仪器很贵的，它是高科技呢。但是只要我们到一些制药厂，食品企业，高效液相色谱广泛地使用，一个实验员要管理<font color="#-4台HPLC呢。为了让同学们了解HPLC，qingqingcao老师准通过自己的体系，给大家讲解一下HPLC的构成。HPLC的简单维护和清洗。同学们可以通过书本，一起来熟悉这台所谓的“高级货”。但是书本很详细地讲了各个部件的原理，也许会枯燥，先听我来讲讲。HPLC的几大系统HPLC是集成化很高的仪器。它包括了泵输送流动相，六通阀的进样，色谱柱的分离，检测器的检测和记录积分设备的记录和数据计算构成的。Qingqingcao老师首先先给大家一个总的概念，然后详细阐述。<font color="#& & GC和HPLC的工作原理（形象地解释）我们回忆一下，气相色谱，我们用氮气或者氦气做载气。“载”这个字，我们怎么理解，载，就是作为介质，带着样品到色谱柱中去“旅游”。有些人个子小，那么在色谱柱这个迷宫里面，跑得快，有些人个子大，容易被色谱柱中的迷宫中的绳索绊住，所以跑得慢。所以，不同性质的物质在载气的带动下，到色谱柱中旅游，快慢不同，从而到达检测器时间不同。达到分离的目的。那么HPLC呢，同样道理。这里我们把载气换成流动相（Mobile phase）。有些书也称流动相为载液。我们的HPLC是通过管路连接这各个部件按，流动相在泵的驱动下，流经色谱的全系统到达废液，我们可以把它理解成传输带。样品经过了流通阀，进入色谱系统，在流动相的带领下，进入色谱柱进行分离。被分离的样品中各个成分，进入检测器，被检测。由记录仪记录检测信号，流经废液。或者被收集。这是HPLC的整个系统工作描述。<font color="#& & HPLC的各系统那么我概括HPLC是有五大系统构成：动力系统，进样系统，分离系统，检测系统，数据分析和记录系统构成。其中：动力系统：泵进样系统：六通阀和进样针，或者自动进样器分离系统：色谱柱检测系统：检测器，一般有紫外检测器，荧光检测器，示差折光检测器，MS检测器等等。记录系统：电脑工作站等连接这些设备的都是由一根根不锈钢管或者PEEK管构成。<font color="#.1& & & & &
说泵：泵是HPLC的动力系统。气相色谱的动力，实际上是钢瓶中气体的压力。而液体，它只有通过泵的转动而使之流动。我们做一个类比：血液类比成流动相，心脏类比成泵。血管类比成各不锈钢管。那么，血液在心脏作为动力系统，流经着身体的各个系统。如果心脏跳得快点，那么血流量加大，那么血压升高。同样，泵流速提高，流动相流量增大，那么色谱系统压力增高；如果血管被压迫半堵了，那么同样的心跳速度，压力也会增高。同样道理，如果色谱系统被污染，那么污染物堵在色谱柱头，或者各连接口等，那么泵同样的流速，就有可能压力变大。高效液相色谱主要出问题的就是压力莫名地增大，一般认为是色谱系统被污染而堵，解决的方法就是查看各个部件，或者用过滤过的异丙醇清洗流路等。泵的原理，我们看下下面这张示意图。由四个柱塞杆分别作抽，推运动，吸取贮液瓶中的流动相。想想，医生打针，是否也是抽，推注射器的柱塞杆呢？为什么用了四个柱塞杆呢？目的是为了保持流量的稳定。也就是说，一边抽，一边在推，这样可以减小脉冲。同时，现代的泵的出口流液出，还有一个脉冲调节器，避免由于脉冲引起流速不稳定。我们看下，还有一个purge阀。考下大家purge是什么意思呢？对了是清洗的意思。这个派什么用处的呢？我们思考下，色谱系统不能用很大的流速的，如果用很大流速，那么仪器是否就会有损害？通俗地说，压力高了，设备爆了。一般我们更换流动相和排除流动相中的气泡，需要高流速，快速地更换流动相和排除气泡。那么，我们首先是开purge阀，这样流路走的是一条进废液的路，不会进入色谱柱系统，用<font color="#-9mL/min的流速快速更换流动相和排除气泡。更换好并且气泡没有了，那么要停泵，关闭阀门，以正常流速开启泵（例如<font color="#.0ml/min）。则流动相能够进入各个色谱系统中。关于流动相，qingqingcao老师还是需要强调两点，色谱系统不能被污染，尤其是试剂中的固体颗粒是损害HPLC色谱分析的元凶。同时，流动相中的气泡，会是的压力不稳，所以，也要想方设法地排除掉。所以，对于流动相，我们必须对它进行处理。主要有两点。流动相按照要求配制好。需要进行过滤和脱气。过滤：对于流动相，我们使用微孔滤膜过滤。微孔滤膜有三种规格。有水系的，有机系的，有水系-有机系两用的。我们过滤水相一般使用水系滤膜。其孔径有0.45微米，0.22微米 。一般选用0.45微米孔径 。因为 0.22微米 过滤 细菌 的。有机相，比如甲醇，乙腈，四氢呋喃等使用 有机系滤膜。不要搞混了。因为有机系过滤水相，水流不下来的。有机溶剂用水系滤膜，滤膜会被溶解，黏在多孔瓷板上。如果 混合溶剂，一般可以选择水系-有机系两用滤膜。还有，试液一定需要过滤，以前用过的那些 HPLC的甲醇，乙腈，过滤出来，上面会有一层浅浅的黄色固体颗粒物，也许会有灰尘等固体颗粒物。如果不幸进入色谱系统，那么会造成不必呀的麻烦。虽然色谱仪器可以拆洗，但是，拆洗总归费时费力吧。同时流动相需要脱气（degas）。一般脱气 有真空脱气，超声波脱气，吹He脱气，加热脱气。常用前两种。当然也有各自有缺点。问一个问题：流动性为什么要脱气呢？<font color="#.2& & & & &
说说进样系统：现在很少用到手动进样了吧。大部分都用自动进样。自动进样确实方便，只要安排好配制过的样品的位次，那么开动sequence run 就一个个地分析了。要不说说手动进样吧。进样设备是一个六通阀。其中要进样的时候，需要将六通阀转到load状态，由于六通阀后面装了一根定量环，所以，样品一定以大于三倍定量环体积地进去，这样，保证定量环中充满着样品，可以避免进样误差。打个比方，如果定量环是<font color="#μl的，那么我们打入＞<font color="#μl的样品。然后转到inj状态，即可。还有需要注意的是，HPLC 的进样针是平头针，而GC的进样针一定是尖头针。因为气相进样要刺穿隔垫，需呀尖头，而尖头容易划伤金属，所以HPLC 用的是平头针。<font color="#.3& & & & &
说说分离系统。分离系统是HPLC的核心。我们现实生活中需要分析的样品都是混合物。所以，分离后在分析。比如我们分析酱油中肌苷酸鸟苷酸，那么酱油进行稀释处理，注入色谱仪，肌苷酸，鸟苷酸由于性质不同被分离成两个峰。同时酱油中其他物质也被分离。使得肌苷酸，鸟苷酸两个峰十分清楚地呈现。我们需要清楚的是，样品的测试要保证测试的物质被有效地分离，而不需要测试的物质，没有必要让其分离，这可以节省分析时间。关于色谱柱性能和判断，老师在下一讲详细讲述。<font color="#.4& & & & &
检测系统：HPLC的检测器有紫外-可见检测器，（UV-VIS），荧光检测器（FD）,示差折光检测器（RI）,MS检测器等等对于这些检测器，简单来说，是两点：被检测和浓度越大面积越大。对于示差折光，它是通用性检测器，但是灵敏度不够。测试一些没有紫外基团的物质，比如如糖等。<font color="#.5& & & & &
记录系统：HPLC记录系统主要记录色谱图，并且对色谱图进行面积计算（积分）。同时可以用软件计算出其他，比如峰宽，塔板数，拖尾因子等。同时也可以通过输入称样量和稀释倍数，计算出测试样品中各组分的含量。 总结本节课主要讲述了HPLC的各个部件，详细讲了HPLC泵工作原理，流动相处理等；进样器讲了六通阀等。因为HPLC 主要是用的，所以，无需讲许多原理，只要讲为什么这么做就行了。
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14:47:28 Last edit by v3046298
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图文并茂，老师讲的不错，要是能再加些常见故障的维修分析就更完美了。
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真的感谢，很受用
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呵呵，这个，
feitianhul
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谢谢了，太好了
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没看到图啊
hujiangtao
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言简意赅 不错
lijing320323
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ID：lijing320323
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液相色谱系统泵的压力不稳定的原因及解决办法
核心提示： 液相色谱系统泵的压力不稳定的原因及解决办法
在安装调试时以及在日常使用过程中，出现压力不稳的原因：
一、管路里有气泡，建议由流动相多走些时间。或打开排空阀，用配件里的针筒多抽几下。
二、输入单向阀失效所致，这也是经常遇见的。首先如何判断输入单向阀失效。判断步骤为：
A.如果是双泵梯度分析系统，故泵压力不稳必然是其中一台泵压力不稳所致，须逐个分析。
1.在不开UV检测器，工作站的前提下，将其中一台泵接上蒸馏水作为流动相。
2.打开排空阀，用针筒抽出些流动相，确认泵中已有该流动相，然后将针筒内的液体排出，并重新接在排空阀上。
3.按&设置&键直至出现&冲洗&字样，选择是，并启动冲洗功能。流量5ml/min，时间5min（注意：此时排空阀仍要打开，否则将冲坏色谱柱）
4.冲洗完毕后，查看针筒内流动相体积是否为25ml（5&5=25），若正确，则说明该泵在低压情况下无故障；若不正确，则说明该泵中某一单向阀失效（一般为输入单向阀）。
5.用同样方法测试另外一泵。等度只要测试一台就可以了。
B.造成单向阀失效原因有几点：
1.液相色谱从成品到客户手中有一段时间，出厂前每台仪器都要经过调试，一段时间内不用会造成内部残留流动相与宝石球粘连的情况。客户长期不用也会造成类似情况，建议客户在长期不使用情况下，每周用甲醇作为流动相，开机1小时使管路充满液体。
2.流动相内杂质或其它原因污染了单向阀。虽然有的客户认为流动相已过滤过了，但长期使用后，由于液相色谱是微量分析仪器，难免会产生类似情况。这是液相色谱的普遍现象，国内外的泵只要是被动单向阀，都会有类似现象发生，这并不是仪器的质量问题，而是日常维护的一部分。现在介绍一个简单而有效的单向阀失效的处理办法。
C.单向阀失效处理方法：
1.拧下输入单向阀（一共两个）
2.将2个单向阀放入超声波清洗器，用蒸馏水清洗10分钟。
3.用本公司提供的专用针头冲一下（将针头拧紧在单向阀输入端即可，见配件清单）。冲的时候注意要用手按住单向阀前头的垫圈，防止冲时垫圈被冲落。
4.完毕后，将输入单向阀装回原位即可。（注意单向阀须拧紧）
D.若两个泵在低压状态下流量都正确，则建议分别将两泵连接上色谱柱进行高压测试。
高压测试具体操作方法：
1.在双泵分析系统连接的前提下，只须先打开其中一泵（确认接好流动相）
2.设置流量1ml/min
4.观察运行期间，泵的压力是否稳定。若稳定，说明泵无问题；若泵压力不稳，则应检查各管路接头有无泄露，并将有泄漏的接头拧紧；若无泄漏，则问题可能还是出在单向阀上，须再次冲单向阀，反复试验。
（注：不必打开UV检测器及工作站）
5.重复上述步骤，对另一台泵进行高压测试
三、如还出现压力不稳的情况，有可能密封圈受损，建议更换。
编辑：songjiajie2010
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