Western-Blot经验之谈：如何做好蛋白转印
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Western-Blot经验之谈：如何做好蛋白转印
在Western-Blot中，最为常用的转印方法是半干转和湿转，这两种转印方法各有优劣。
湿转适合所有的蛋白，转膜效率最佳，但试剂、溶液，对普通分子量大小的蛋白转染操作时间长于半干转；半干转适合分子量较小的蛋白，省时、省试剂。
蛋白分子大小如何界定呢？习惯上认为150KDa以上为大蛋白，其他均属于小蛋白，&当然这只是一个相对标准。因此，通常对大蛋白的转印多数人会选择长时程的湿转。
此外，有必要指出的是，实际上用半干转缓冲液进行湿转效果也非常理想，通常这种缓冲液可以反复使用多次（&=5次&常规1hr电转，如有3hrs长时程转染，缓冲液使用次数会减少），不过要注意初始电流（同样温度下，初始电流高，表明缓冲液中电解质剩余不多，为确保转膜温度，可开始或中途更换新鲜转膜液）。
电转液中的SDS会增加蛋白的水溶性，促进蛋白在电转液中泳动。若不加SDS，蛋白会沉淀在胶上，但SDS过多会影响蛋白与膜的吸附。甲醇能使SDS与蛋白分离，甲醇浓度越高SDS与蛋白分离越快，但高浓度的甲醇对蛋白会有固定作用，不利于蛋白从胶里跑出来。一般来说甲醇的浓度为20%，但PVDF膜截留marker上交联的小分子颜料的能力很差，可考虑提升甲醇的浓度至25%（它对普通蛋白的转膜影响不太，颜料截留更多）；大蛋白转印可考虑降低甲醇浓度，另外SDS必须添加。甲醇的另一个作用是降温，旧的电转液由于电解质的消耗和甲醇的挥发，电转时电流或电压变化更快、温度升高也更快，因此可考虑增加额外的甲醇；这点对半干转缓冲液的意义较大，因为半干转缓冲液消耗很慢，缓冲液放置的时间较久，甲醇挥发比较严重，可临时少量补加。
湿转一般采用稳压，电压控制在120-140V，时长1-3hrs（小蛋白控制在1hr，大蛋白3hrs），有人会选择60V过夜，从实验的效率来讲太浪费时间，对转膜到底有多大程度的增益难说，不太推荐；半干转一般稳流，依milliporePVDF膜附带说明书，当2.5-3mA/cm2，电压25V，时间一般15–45min（常规用0.5hr）；如果是3mA/cm2，时间不要超过0.5hr。
尽管厂家一再表明PVDF膜比NC膜对蛋白的截留更高（但NC带负电性，理论上它的吸附量应该更高，所以通常同样使用TBST这种低盐洗液背景比PVDF膜高），但PVDF膜对小分子的截留明显不如NC膜，因此交联在预染marker上的颜料小分子很容易穿过PVDF膜，造成转膜过度的假象（除可考虑提升甲醇浓度至25%外，也可以考虑增加marker的上样量）；NC膜没有这种问题，所以通常它的转膜时间也是小蛋白1hr、大蛋白3hrs，电流控制在200-300mA（16cm*9cm大胶300mA，如果胶面积小很多可以考虑降低，实际上相当于2.5-3mA/cm2左右）。NC膜唯一不如PVDF膜的地方是干燥的膜易碎。当然目前某些厂家为解决这个问题，将NC成分涂在另一种介质的表面，这种膜的支持强度和PVDF膜类似，但转膜效率稍差于纯NC膜，且有明显的正反面；因此制作转印三明治的时候要特别注意正反面。此外，20KDa以下的蛋白适宜采用0.22uM孔径的转印膜。
转膜最好在低温进行（高温会局部溶胶或降低转膜效率），尽管很多半干转仪没有具体要求，但用预冷过的电转液湿滤纸比未预冷的转印效率更高。因此，有条件建议湿转、半干转均在低温（4度）进行。此外，湿转缓冲液可以考虑转印前-20度预冷，时间不能长于2hrs，否则电泳液冻结；mini3型有内置冰槽的，冰槽置-80度预冷。
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【详细说明】
Western Blot技术服务 WB免疫印迹（wb实验代做）免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting)，它是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究DNA 结合蛋白和其相关的DNA 结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA 结合蛋白，目前已用于研究RNA 结合蛋白和特定的RNA 序列的相互作用。Western blot 检测&1200元/膜每张膜1--8样本EMSA &&2800元/膜&每张膜1--8样本，包括探针及试剂南京信帆代做实验项目:ELISA,免疫组化,免疫印迹Western Blot,放射免疫,实时荧光定量ＰＣＲ,，免疫组织，特殊染色,病理学检测技术服务等等!我们拥有最好的实验室,客户检测项目均提供实验室仪器型号,提供操作详细步骤.欢迎联系!021-Western Blot实验成功完成Western Blot检测，必须满足4个条件：凝胶洗脱：转移期间蛋白质必须从凝胶中洗脱出来，如果蛋白质还截留在凝胶中，将无法在膜上进行分析吸附到膜上：在转移过程中蛋白质必须吸附到膜上，如果蛋白不吸附，将无法在膜上进行分析处理期间仍截留在膜上：在转移后的处理过程中蛋白质必须保持吸附在印迹膜上处理过程中可接近：被吸附的蛋白质必须能够与检测试剂接触，如果蛋白质被掩盖则无法检测成功进行WB检测，则设置合适正确的对照是必不可少的，只要正确设置了这些对照，即可快速和准确的找到WB的问题所在，并保证实验结果的准确性和特异性！一般需要设置的对照如下：阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性内参对照：检测标本的质量和二抗系统空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果&WB&检测基本过程&1&、获取细胞或组织裂解物&1)根据检测蛋白的位置选择合适的裂解buffer：&蛋白位置&&推荐buffer&全细胞&NP-40 or RIPA&胞浆（可溶性蛋白）&Tris-HCl&胞浆（骨架结合蛋白）&Tris-Triton&膜蛋白&NP-40 or RIPA&核蛋白&RIPA or 核蛋白提取试剂盒&线粒体蛋白&RIPA or 线粒体分离试剂盒&亦可购买商业化的蛋白提取试剂盒来保证标本制备的质量2)选择合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准确性！2&、蛋白定量&常用的蛋白定量方法：Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。定量后，可根据情况将标本保存在-20&C /-80&C备用，进行免疫沉淀（IP）或者直接进行电泳分离蛋白3&、电泳分离蛋白质&根据待测蛋白状态确定电泳条件：&&待测蛋白状态&凝胶条件&上样buffer&电泳buffer&Reduced - Denatured&还原，变性&含&-巯基乙醇或DTT，含SDS&含SDS&Reduced - Native&还原，不变性&含&-巯基乙醇或DTT，不含SDS&不含SDS&Oxidized - Denatured&不还原，变性&不含&-巯基乙醇或DTT，含SDS&含SDS&Oxidized - Native&不还原，不变性&不含&-巯基乙醇或DTT，不含SDS&不含SDS&根据待测蛋白分子量大小确定凝胶浓度&蛋白分子量（kDa）&凝胶浓度（％）&4-40&20&12-45&15&10-70&12.5&15-100&10&25-200&8&4&、转膜&根据不同的检测目的和待测蛋白的特性,选择合适的膜类型。常用的转移膜类型有:PVDF膜、硝酸纤维素膜（NC膜）和尼龙膜，其中PVDF和NC膜的使用频率最高。各种膜的技术参数及比较如下：&　&PVDF膜&NC膜&尼龙膜&灵敏度和分辨率&高&高&高&背景&低&低&较高&蛋白结合能力&100-200ug/cm2（适用于SDS存在时与蛋白结合）&80-100ug/cm2&&400ug/cm2&机械强度&强&干的膜易脆&软而结实&溶剂抗性&强&差&差&使用前是否需要浸润&100%甲醛润湿&缓冲液润湿&缓冲液润湿&适用染色方法&胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁、考马斯亮兰&胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁&不能用阴离子染料&适用检测方法&显色法、化学发光、荧光、放射性、化学荧光、快速免疫检测&显色法、化学发光、荧光、放射性&显色、化学发光、放射性&适用范围&普通蛋白WB、糖蛋白检测、蛋白质测序、氨基酸分析、重复检测&普通蛋白WB、氨基酸分析、重复检测。0.1um膜适用于7kDa以下蛋白&低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸检测常用&价格&高&较低&低&5&、封闭&去掉膜上多余的非特异性结合位点，降低背景。常用的封闭溶液有：含BSA或者脱脂奶粉的TBST或TBS6&、一抗孵育&一抗的选择成功与否，是整个WB实验成功的关键：选择一抗有以下几个注意点：选择适合检测标本种属的一抗（说明书有验证）选择适用于WB实验方法的一抗（说明书有验证）选择单克隆抗体或者经过亲和纯化的多克隆抗体Western Blot技术服务 WB免疫印迹（wb实验代做）一抗的保存和使用：根据说明书的要求条件进行抗体的保存；一般需要将抗体分装后放入-20度保存，绝对避免反复冻融。抗体的工作液最好现配现用，在4度保存最好不要超过2周根据说明书推荐浓度使用TBST稀释一抗。由于实验室条件和检测方法等的差异，说明书推荐的稀释比例只作参考，需要在说明书推荐的浓度周边进行多个浓度梯度的实验检测，然后选择信噪比最好的抗体浓度进行实验。如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索稀释度（1:100-1:3000）。孵育条件：推荐4&C孵育过夜（一般大于18个小时），根据抗体亲和力不同孵育时间有所区别内参的选择和使用：WB&过程监测以及目的蛋白定量的标准！&WB常用内参及其技术参数：&内参名称&分子量大小&适用范围&beta-actin&43kDa&胞浆和全细胞&GAPDH&30-40kDa&胞浆和全细胞&Tubulin&55kDa&胞浆和全细胞&VCDA1/Porin&31kDa&线粒体&COXIV&16kDa&线粒体&TBP&38kDa&细胞核&详情请参考7&、二抗孵育&根据说明书推荐浓度使用TBST稀释一抗。如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索稀释度（1:00）。孵育条件一般为室温1-2小时8&、底物孵育&选择显色或者化学发光底物。一般倾向于化学发光，灵敏度高且背景低，节省抗体用量9&、结果分析和检测&凝胶成像系统检测或者暗室曝光到胶片注意事项&1、 抗体：事先咨询信帆生物，明确抗体种属及指标名称，确定我司抗体库否有该抗体可使用，如有一抗可免费提供，如无可由双方协商而定，客户自己购买提供或我公司代购；2、 标本收集与保存：&组织样品 &新鲜组织放入液氮或-70度保存，组织不少于100mg（约绿豆大小）；&培养细胞 &通过细胞计数取不少于100万个细胞于EP管，加入0.5ml生理盐水或蛋白保护剂，混匀后保存于冰箱（-70℃，避免反复冻融）；&血液细胞标本 &以抗凝管保存血样或以淋巴细胞分离液分离细胞后加入0.5ml生理盐水或蛋白保护剂，保存（-70℃可长期保存，避免反复冻融）&血清或细胞培养液标本 &离心去掉杂质后取上清入EP管，保存（以上4℃可保存15-20天，-70℃可长期保存，避免反复冻融）&3 、 样本运输：可选以下任何的一种方式寄送标本&组织样本、细胞样本以干冰运输或加入蛋白保护剂后加冰袋运输；&细胞样本也可以直接快件寄送培养瓶（密封保证不污染，培养液不漏出，细胞不要长得太满，50%左右，灌满培养液）；&血清或上清液直接加冰袋寄送（密封保证液体不漏出，视路途远近2-3天可到达）。&流程：1、客户告知实验分组、编号、检测样本类型、种属、指标，有具体要求请事先说明；2、签订合同，寄送样本和抗体，如需我方提供抗体请事先说明；3、客户支付预付款，进行实验。4、提供原始数据，分析数据，实验室仪器型号，所用试剂品牌货号，图片，实验报告等！&Western Blot技术服务 WB免疫印迹（wb实验代做）&&
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