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浅论用PCR-PAGE切胶回收-PCR测序法制备DXS9898基因座等位基因分型标准物
来源：　 15:04:00　【】　
【摘要】& 目的 ：探索一种快速制备X染色体短串联重复序列(short tandem repeat，STR)基因座等位基因分型标准物的简便方法。方法 ：采用PCR-聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)切胶回收-二次PCR-测序的方法制备X-STR基因座等位基因分型标准物。结果：应用此法制备出大量的DXS9898基因座等位基因分型标准物。结论：利用PCR-PAGE切胶回收-PCR测序制备STR基因座等位基因分型标准物是一种简便易行的方法。 【关键词】& 聚丙烯酰胺凝胶电泳;切胶回收;DXS9898基因座;等位基因分型标准物X染色体的STR广泛分布于真核基因组中，高度稳定且有高度多态性， X-STR的最大应用价值就在于可以解决一些特殊的亲子鉴定案[1]，如单亲父女的亲权鉴定，缺乏双亲认定姐妹亲权关系。X-STR不仅在法医学中有其独特的应用价值，而且是进行X连锁遗传病基因诊断和基因定位的重要方法，对于人类学研究也有重要意义。X-STR基因座的基因型检测需经扩增、与等位基因分型标准物同步电泳才可获得正确的基因型。我们将PCR、聚丙烯酰胺凝胶电泳、切胶回收PCR产物、再次扩增及直接测序结合起来，探索了一种简单、快速制备DXS9898基因座等位基因分型标准物的方法。　　1 材料和方法　　1.1 DNA样品 174名汉族无关女性个体的血液样本来自温州地区，系本实验室日常检案积累。血液样本采用EDTANa2抗凝，Chelex-100快速法提取DNA。　　1.2 方法　　1.2.1 首次PCR扩增：DXS9898基因座的引物序列参照基因组数据库(www.gdb.org)，由上海生工生物工程公司合成。PCR扩增条件为94 ℃变性3 min，然后94 ℃变性35 s，58 ℃退火35 s，72 ℃延伸40 s，循环35次后，72 ℃保持5 min，于4 ℃保存。扩增产物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分型，银染显色。　　1.2.2 从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段：在凝胶尚未完全干燥时用手术刀片切取含有目的条带的凝胶，要使切下的凝胶尽可能的细，用小镊子将其移入0.5 mL的离心管内，加20μL TE，用小镊子将凝胶夹碎，放入湿盒内，置于60 ℃ 恒温干燥箱中过夜后，将管子放入PCR仪中95 ℃ 变性10 min，短暂离心后取上清液2μL作为再次PCR扩增的模板。注意切取不同条带时要将刀片和小镊子尽可能地清洗干净，防止DNA交叉污染。　　1.2.3 再次PCR扩增和序列测定：用上述DNA模板，使用原引物，建立20μL PCR反应体系，按第1次PCR条件完成35个循环。产物纯化后，委托上海盛兆生物科技有限公司用双脱氧终止法在ABI公司的3730测序仪上测定序列。　　2 结果　　2.1 首次PCR的PAGE电泳结果 在174名温州汉族无关女性个体中，DXS9898基因座共检出5个等位基因，其多态性片段长度范围为193～214 bp。挑选含不同等位基因的5个汉族个体的PCR扩增产物与pUC19 DNA/MspⅠ(HpaⅡ)Marker同步电泳(见图1)。　　2.2 切胶回收与再次PCR结果 分别切胶回收DXS9898基因座各等位基因(见图2)，并以回收DNA为模板再次PCR，结果见图3。　　2.3 再次PCR产物直接测序结果 取DXS9898基因座两个等位基因直接测序，测序结果按照重复单位的重复次数命名为等位基因8.3和等位基因11(见图4)。　　3 讨论　　目前，PCR-STR分型技术已成为国内外物证鉴定的主流技术，按照国际DNA委员会的要求，STR基因座的片段长度等位基因命名应有等位基因分型标准物作为参照，按重复单位的重复次数命名等位基因和基因型。因此，找到一种简便易行的方法制备一套精确的、国际标准化命名的标准参照物是非常必要的。1&&&
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跑电泳切胶回收DNA,因为试剂盒比较贵,所以我用的传统的沉淀法,但是这样会含有琼脂糖而影响后续试验.
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不太清楚你用的是什么方法,不过用pH8.0的平衡酚（Phenol,equilibrated to pH 8.0）和酚-氯仿反复抽提效果还是不错的,一般后续试验,比如PCR或者连接都是可以的.不然可以考虑转膜的办法,可能可以更干净些?传统回收方法还是比较多的,
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注意事项1. 测序项目及收费标准：
样品及服务种类
数 量（次）
价&& 格（元）
40（包括纯化费）
切胶纯化PCR产物&
40+10（切胶纯化费)
质粒克隆测序
250(克隆)+10(纯化费)+40(测序)
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 备注：“数量”是指每个反应 / 每样本
2. 特色服务：（1）本实验室应用ABI公司310型DNA测序仪进行样品的序列鉴定。测序者可以观看测序全过程。 （2）DNA测序的过程及步骤如下：待测样品PCR产物（包括样品的1.5％琼脂糖电泳图）→我室对PCR产物纯化（或切胶纯化）→测序PCR扩增待测样本→测序PCR产物纯化（二次纯化）→纯化产物上机测序。（备注：整个过程需要10小时的工作时间，且全程开放观看。能让您更直观了解DNA的测序过程。)。（3）正常情况下PCR产物和切胶纯化PCR产物每个反应 / 每样本一次测序长度430bp, 质粒克隆测序长度600bp。（4）在我实验室测序的样本，我们提供chromas2.23软件一个，该软件可以直接进入NCBI数据库进行相关数据的分析。
3.测序样本注意事项。（1） 测序PCR扩增待测样本需要您提供：PCR扩增引物浓度3.2pmol/μl（或3.2umol/L）,体积10μl /样本，提供引物全序列、PCR退火温度、Tm值、GC含量和3－5μl测序样品的1.5％琼脂糖电泳图。备注：随机引物（RAPD、AFLP引物）、简并引物、引物长度不足15bp的扩增产物不能用于测序。 （2） 未纯化PCR产物请提供25μl PCR产物，待测产物片段应大于130bp，浓度大于200ng/μl。 （3）需要切胶纯化PCR产物请提供50μl PCR产物，待测产物片段应大于130bp，浓度大于200ng/μl。 （4）已自行纯化PCR产物请提供15μl 溶解于蒸馏水PCR产物（请勿溶解于TE），待测产物片段应大于130bp，浓度大于200ng/μl。（5）如需质粒克隆测序的样本，我室提供通用引物：M13＋、M13—; 抗生素：A 质粒puc18、BLU；细菌：大肠杆菌。（6）如已自行克隆纯化的质粒，质粒溶于20－40μl蒸馏水中（请勿溶解于TE），浓度大于200ng/μl。『备注：质粒提取建议用试剂盒提取，同时提供1ml含相应质粒的菌液备用，需要注明载体和插入目的片段的长度；如不是使用通用引物：M13＋、M13—的样本，请提供您的通用引物。
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