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重金属Cd、Zn、Cu、Pb污染下土壤生物效应及机理
西南大学 硕士学位论文 重金属Cd、Zn、Cu、Pb污染下土壤生物效应及机理 姓名：王彬 申请学位级别：硕士 专业：植物营养 指导教师：徐卫红
捅婴重金属Ｃｄ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｐｂ污染下土壤生物效应 及机理植物营养学专业硕士研究生王彬指导教师 徐卫红副教授<b
r />摘要土壤的重金属污染问题一真是国内外土壤学、环境科学研究的热点。由于重金属在土壤中难以降解。毒性强，具有积累效应等特征，研究重金属污染下的土壤生物效应，即重金属 对土壤微生物、土壤酶活性的影响已受到广泛关注。重金属污染土壤及其修复，过去一直采 用化学方法来评价，随着土壤微生物污染生态研究的不断深入以及研究方法的改进，采用微 生物学指标评价重金属污染越来越受到人们的关注。近年来，国内外学者就重金属污染土壤 生物、生态效应作了大量的研究工作。并在重金属污染土壤的微生物学评价中取得一定的研究成果。但由于在自然条件下，土壤微生物及酶活性受植被、季节、灌溉、耕作等因素的影响，检测结果差异很大。在自然生态系统中，重金属污染主要以复合污染存在，土壤生态系 统中的复合污染具有多样性、复杂性的复合效应机制，包括重金属间的协同作用、拮抗作用、 竞争作用和抑制作用等等，因此，在揭示重金属污染土壤的生物效应时，开展重金属复合污 染生物学研究更具有理论和实践意义。本文采用室内恒温培养试验、盆栽试验、野外重金属 矿区调查及相关分析相结合的研究方法，探讨了重金属Ｃｄ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｐｂ复合污染下土壤的生 物效应，为重金属污染土壤的修复、环境质量评价及建立有效的土壤重金属污染预警指标体 系提供理论依据。本研究主要取得如下一些结果： １．矿区土壤由于遭受重金属污染，其理化性质受到严重影响，距离矿口越近，土壤ｐＨ 越低，有机质、有效Ｎ、Ｐ、Ｋ的含量也越来越低，即土壤肥力越低。矿区重金属污染土壤的酶活性较对照（距矿口１０ ｏｏｏ米）显著降低，且随着距矿口距离的增加，酶活性越来越高，表明矿区土壤不同区位段上的土壤酶活性存在着显著差异，矿区重金属污染对５种酶的抑制能力为脱氢酶＞酸性磷酸酶＞脲酶＞过氧化氢酶＞蔗糖酶。矿区重金属污染对土壤微生物活性产生了严重的影响，其中细菌和放线菌的数量明显下降，而真菌变化幅度相对较小。随着 距矿口距离越近即随矿区重金属污染程度的加剧，土壤微生物受到的抑制程度明显增强，微 生物活体数量、微生物生物量碳、氮显著下降，而微生物生物量Ｃ烈却明显升高。西南大学硕士学位论文 ２．在恒温（２５℃）培养条件下，供试土壤的酶活性与土壤中重金属镉、锌、铜、铅浓度 有密切的关系，Ｃｄ在≤１０ ｍ∥埏水平时对脲酶和蔗糖酶、Ｐｂ在≤２００ｍ班ｇ水平时对脲酶、蔗糖酶、过氧化氢酶、脱氢酶有刺激作用，土壤酶活性有一定程度的上升，而ｚｎ、Ｃｕ对酶 的活性的影响，随着重金属浓度的增加呈下降趋势，在低浓度的时候，其下降趋势并不明显， 但当浓度较高时，酶活性下降尤为明显，均达到显著水平。‘ ‘３．在恒温（２５℃）培养条件下，重金属污染对不同土壤微生物影响不同。低浓度重金属对土壤细菌、真菌以及微生物生物量碳、氮有一定的刺激作用，高浓度的重金属贝Ｕ对其有强烈的抑制作用；而重金属对土壤放线菌表现为一直都是抑制作用，只是低浓度重金属的抑制 作用不如高浓度抑制作用明显。在本试验供试浓度下，四种重金属以Ｃｄ对供试土壤各项指标的毒性影响最为明显，Ｃｕ、ｚｎ次之，Ｐｂ的影响最小。 ４．复合污染对土壤酶活性和微生物活性的影响明显大于单一重金属污染。与重金属镉、锌、铜、铅的单一污染相比，重金属复合污染的影响效果并非仅仅表现出简单的叠加作用，同时还存在协同效应和拮抗效应。Ｃｄ、Ｚｎ、Ｃｕ之间存在协同作用，而Ｐｂ与Ｃｄ、ｚｎ、Ｃｕ之 间存在一定的拮抗作用。 ５．在恒温（２５℃）培养条件下，随着培养时间的变化，供试土壤中酶活性是总体是呈先下降后上升的趋势，在培养２０天的时候，酶受到的抑制最大，酶活性达到最低值，随后酶活 性有所上升。但脲酶活性变化并不是完全相同，在Ｃｄ和ｃｕ高浓度污染下脲酶活性变化是持 续下降，在培养３０天时，重金属对脲酶的抑制率才达到最大，脲酶活性达到最低值。而随时间的变化，微生物活体数量及微生物生物量碳、氮的变化趋势是明显的先下降后上升。在培 养２０天的时候受重金属的抑制作用最为显著。 ６．盆栽试验中，除低浓度的铅（＜１００ ｍｇ／ｋｇ）对油菜（Ｂｒ口船ｆｃ口，“妒Ｈｓ厶）具有一定的刺激作用，其茎叶及根的生物量有轻微的上升，而其他重金属对油菜生物量都具有强烈的抑制作 用，随着重金属浓度的提高油菜茎叶及根的生物量呈下降趋势。在本试验供试浓度下，当外 加重金属Ｃｄ、ｚｎ、Ｃｕ、Ｐｂ浓度在最大值时，油菜茎叶的生物量分别较对照下降５６．３％、６７．３％、５６．７％和６２．７％，根生物量下降３８．２％、４２．２％、３８．２％和４０．２％，复合污染下降幅度更大。油菜根、茎叶对重金属镉、锌、铜、铅中某一元素的吸收均受到这种添加元素极为显著的影响， 且茎叶中的Ｃｄ和Ｐｂ含量比根高，而根中的ｚｎ和Ｃｕ要比茎叶高。土壤中酶活性及微生物活 性各指标与恒温培养试验趋势相同。但由于受植物的影响，盆栽试验中酶活性及微生物活性各指标显然要比对应的恒温培养试验中要高，而且其变化幅度要小。关键词：重金属镉、锌、铜和铅 土壤酶活性单一及复合污染土壤微生物活性 重金属含量油菜（曰ｍ船五∞ｎ印淞Ｌ．）ＩｌＡｂｓｔｒａｃｔＥｃｏＩｏｇｉｃａＩ Ｅｆ亿ｃｔ ａｎｄＭｅｃｈａｎｉｓｍｏｎｏｆ ＨｅａＶｙＭｅｔａｌ Ｃａｄｍｉｕｍ，Ｚｉｎｃ，ａｎｄ ＥｎｚｙｍｅｓＣｏｐｐｅｒ ａｎｄ ＬｅａｄＳｏｉＩＭｉｃｒｏｂｅｓＷａｎｇＢｉｎＰｌａｎｔ ＮｕｔｒｉｔｉｏｎＳｕｐｅｒｖｉｓｏｒ：Ａｓｓｏｃｉａｔｅ Ｐｒｏｆｅ§ｓｏｒ ＸｕＷ萌ｈｏｎｇＡｂｓｔｒａｃｔｎｅｃＩＩｌｔｕｒｅ ｅｘｐｅ“ｍｅｎｔ，ｐｏｔ ｅｘｐｃｒｉｍｅｎｔ ａｎｄｉｎＶｅｓｔ远ａｔｉｏｎｓｏｆ ｍｉｌｌｉｎｇａｒｅａ、Ⅳｅｒｅｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｔ０ｓｔｕｄｙ ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌｅ雎ｃｔ ａｎｄ枨曲ａｎｉｓｍ ｏｆｈｅａｖｙ眦ｔａｌ ｃａｄｍｉｕｍ（Ｃｄ）’ｚｉｎｃ（ｚｎ），ｃｏｐｐｅｒ（ｃｕ）弛ｄｓｔ“ｙｃｏｎＶｅｙｓ ｓｏｍｅ ｕｓｅ如Ｉｋａｄ（Ｐｂ）ｏｎｓｏｉｌ ｍｉｃｆｏｂｃｓ ａｎｄ ｅｎｚ）ｒｍｅｓ．Ｔｈｉｓｉｎｆ０珊ａ￡ｉｏｎｆＤｒ ｓｏｉｌ他ｍｅｄｉａｔｉｏｎ，ｅｎＶｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｑｕａｌｉｔｙ ｅＶａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｅａｒｌｙ ｗａｍｉＩｌｇ ｓｙｓｔｅｍ ｉＩｌ ｈｅａＶｙ ｍｅｔａｌ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ ｓｏｉｌｓ．Ｔｈｅ ｍａｉｎ ｒｅｓｕｌｔｓ砌『ｅａｓ１．０ｎｏｗｓ：１．１１ｌｅ ｂａｓｉｃ ｂｅｃａｕｓｅ ａｎｄｐｈｙｓｉｃａｌａｎｄ ｃｈｅＩＩｌｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｓ０ｉｌｓｓｉｇｎｉ施姐ｔｌｙｄｅｃｆｅａｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ＩＩｌｉｎｉｎｇａｒｅａｏｆｈｅａＶｙ舭ｔａｌ ｃｏｎｔａＩＩｌｉｎａｔｉｏｎ．ｎｅ ｓｏｉｌｐＨ，ａｎｄ ａＶａｉｌａｂｌｅｎｉ们ｇｅｎ∞，ｐｈｏｓｐｈｏｍｓ（Ｐ）ｐｏｔａｓｓｉｕｍ（目ｄｅｃｆｅａｓｅｄｍａｆｋｅｄｌｙ ｗｉｔｈ ｄｅｃｆｅａｓｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｓｔａｎｃｃ ｆ如ｍ ｔｈｅ ｍｉｎｉｎｇ ｓｉｔｅ．Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ 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很大。因此，重金属污染土壤微生物、生态效应研究多在实验室进行，而不同实验室由于分 析方法不同，实验结果缺乏统一的表示方法，难于比较分析，有的结果甚至互相矛盾。因此， 对于重金属对农业、林业土壤污染的生物学效应已经成为一个极待研究和解决的课题。１、重金属对土壤微生物的影响研究所谓土壤重金属污染是指由于人类活动，使重金属含量明显高于原有含量，并造成环境 质量恶化的现象【ｌｌｏ由于重金属在土壤中的相对稳定，难降解，毒性强，有积累效应等特性， 它不仅严重危害植物生长，影响人畜健康，而且对土壤性质，尤其是土壤微生物产生明显不 良影响。表现在重金属污染不仅带来严重的土壤环境恶化，影响到土壤微生物的区系．改变 微生物群落，降低生物量，影响其生物活性等方面。由于其在土壤中的难降解性，使微生物 生物量大大降低，破坏了微生物群落结构的稳定性，并降低了其生物活性，严重时甚至抑制 微生物的生长和代谢，这也影响到土壤的质量和植物的生长，以致影响到人类的健康。而微 生物活动是土壤基础呼吸的主要来源，是土壤中数量最多的生物类群，也是土壤的形成推动 者，它在一定程度上决定着土壤的基本性质，对土壤的肥力、营养元素的迁移、转化有重要 作用，而且对污染物的分解、净化也起一定作用【２】。１．１土壤重金属污染的微生物效应及毒性１。１．１重金属污染对土壤微生物活性的影响 当土壤受到外来重金属污染物污染时，微生物为了维持生存可能需要更多的能量，而使 土壤生物的代谢活性发生不同程度的反应【３１。微生物的代谢熵是微生物活性反应指标之一，它 反映了单位生物量的微生物在单位时间里的呼吸作用强度【４１。它是微生物对逆境的反应机理，１两南大学硕士学位论文 因此可以作为微生物生理的一个敏感指标，反映重金属的污染程度。土壤微生物的代谢熵通常都是随着重金属污染程度的增加而上升。Ｃ胁刀ｅ，．１５Ｊ等研究认为，含高浓度重金属的土壤中微生物利用有机碳更多地作为能量代谢，以Ｃ０２的形式释放，而低浓度重金属的土壤中微生物能更有效地利用有机碳转化为生物量碳，土壤中的重金属含量的高低影响了微生物的呼吸及代谢，进而影响了土壤的呼吸作用。张玲【６１等研究了铅锌矿区污染土壤的微生物活性，在矿口处土壤基础呼吸为３３．６９ｍｇ瓜ｇ．ｄ，明显高于其他地段，在远离矿口８００而的地方土壤基础呼吸为２４。５７ｍｇ／ｌ（ｇ．ｄ，明显高于对照的４．０６ｍｇ／ｋｇ．ｄ，矿口土壤的土壤基础呼吸和微生物代谢商分别是 对照土壤的１．６倍和２．３倍。ＭｃｇｒａｔｈＩ‘刀研究认为，金属污染土壤的代谢熵是未污染土壤的２倍。Ｂｒｏｏｋｅｓ【８】用Ｃ１４标记的葡萄糖和玉米为基质，研究土壤微生物对不同浓度的重金属的反应，发 现高度污染土壤的微生物比处于低污染的微生物更多的利用有机碳为能量，转化为ｃ０２，而低浓度污染的±壤微生物则更有效的利用有机碳转化为生物量碳。对英国Ｍａｃａｕｌａｖ牧场土壤的研究发现，随铜浓度的升高，微生物呼吸速率迅速上升。滕应等【１４ｌ对铅锌矿区的生物活性调 查也得到相似结果，重金属也影响微生物对能源碳的利用，通过ＢｉｏＩｏｇ实验表明，用不同浓度铜处理后，对糖的利用率增加，对氨基酸和羧酸的利用减少，随时间的推移，相同时间内 对碳源的利用量有所降低，而且对能源碳的利用与对照相比，出现明显的滞后现象，对碳源的优先利用种类也发生变化，对照以消耗糖类为主，而铜处理的土样对其他碳源的利用率高 于对照样。同时生物活性的降低最终也会通过凋落物的分解速度缓慢看出。Ｙａｏｆ９】的研究表明， 重金属降低了土壤微生物对底物的利用水平，重金属污染区凋落树叶的分解速度慢于对照区， 对加拿大ｓｕｄｂｕｒｙ一座冶炼厂的调查表明，在离冶炼厂１０一１５ ｋｍ的地方枯枝落叶层的聚集增加，ｊ在附近８ ｋｍ的范围内凋落树叶在８５１天内的干重损失率是对照区的７９％一８３％，在镉含量２５６ｍ酚ｇ的地区中，橡树叶的干重损失为２２％，而在镉含量为８８ ｍ眺ｇ的地区，其干重损失为３７％。重金属使微生物呼吸增强，代谢熵增大，而ＣｌＩ。ｉｃ／已，。降低。这是由于在此条件下，在微生物量 降低的同时，为维持生存可能需要更多能量，从而使微生物的代谢特性发生不同程度变化， 更多地释放Ｃ０２，从而导致土壤基础呼吸和微生物代谢熵的加剧。这也反映了污染后，微生物 活动从低水平向高水平，从稳定态向不稳定态的过渡。在实验室的生态毒性研究中。重金属 的加人使微生物代谢熵增加，但有人认为这和长期遭受污染的土壤微生物的熵值增加的原理 不同。重金属杀死部分微生物，导致微生物细胞分解，增强代谢熵。这也是不全面的，还需 进一步研究。Ｗｉｌｋｅ【１０ｌ研究了１２种污染物（Ａｓ、Ｂｅ、Ｂｒ、Ｃｄ、Ｃｒ、Ｆ、Ｐｂ、Ｈｇ、Ｓｅ、Ｓｎ、Ｖ和Ｎｉ） 对氮素转化的长期影响，发现除Ｓｅ和Ｓｎ外，其它污染物均抑制氮的矿化作用。重金属污染引起微生物体内代谢过程的紊乱，也影响微生物的代谢功能，而微生物生理生化反应必然影响到土壤的生化过程，改变了土壤的质量状况。雕印６口幽【ｌｌ】等也研究认为，代谢熵是评价重金属微生物效应的敏感指标，它可以反映出土壤重金属污染程度。１．１．２重金属污染对土壤微生物生物量的影响 土壤微生物生物量是指土壤中体积小于５０００ ｕｍ３的生物总量（不包括活的植物体），它能代２文献综述 表参与调控土壤中能量和养分循环以及有机质转化所对应生物量的数量，而且土壤微生物碳或氮转化速率较快，可以很好地表征土壤总碳或总氮的动态变化，是比较敏感的生物学指标【１１】。大量的研究表明，由于土壤重金属污染造成微生物生物量发生变化。杨济龙等【１２ｌ的研究 表明，蔬菜土壤中的微生物量与重金属浓度有负相关性。杨元根等【１３ｌ在英国阿波丁山市的土壤调查中发现，城市工业污染区土壤的微生物生物量不同程度低于农村。滕应等【１４１的研究表明，浙江铅锌银矿区土壤的微生物量明显偏低，可培养的细菌数量也显著降低。‰砝ｅ研等【９ｊ研究指出，Ｐｂ污染矿区土壤的微生物生物量受到严重影响，靠近矿区附近土壤的微生物生物量明显低于远离矿区土壤的微生物生物量。只卸６口曲等【ｌｌ】研究结果表明，低浓度的重金属能刺激微生物生长，可增加微生物生物量碳，而高浓度重金属污染则导致土壤微生物生物量碳的明显下降。在重金属复合污染的土壤中，当重金属总量达到６５８ ｍｇ／ｋｇ时，生物量仅为对照的３２％，当重金属总量达３４４６ＩＩ龇ｇ时，生物量为对照的２２％，生物量碳与土壤有机碳比值较对照下降。Ｋｈａｎ【１５ｌ等采用室内培养实验，研究了Ｃｄ、Ｐｂ和ｚｎ对红壤微生物生物量的影响，当其浓度分别为３０ ｕｇ，ｇ＇、４５０ ｕｇ僖、１５０ ｕｇ纽时导致微生物生物量的显著下降。土壤环境因素也影响重金属污染对土壤微生物生物量的大小。研究表明，在土壤中加入微量的镉，能使土壤 细菌数目由每克土壤４８００×１０４个减少为２０００个【１６ｌ。蔡信德等【１７ｌ的研究表明，某些微生物的必 需微量元素镍，浓度略高于正常值便成为一种极毒元素。同种金属对不同种类的微生物影响 也不同。许炼烽【１８１的研究表明，镉对真菌的抑制作用最明显，其次为细菌。以上研究都说明重金属污染对土壤微生物生物量的影响。 １．１．３重金属对微生物种群结构的影响 土壤微生物种群结构是表征土壤生态系统群落结构和稳定性的重要参数。由于土壤微生物通常都和土壤粘土矿物质和有机质结合在一起，生理和形态差异很大，目前对微生物种群 进行定量分析还存在很大困难。而Ｂｉｏｌｏｇ碳素法是近年来发展起来的根据微生物利用碳源引起的指示剂的变化，检测不同的微生物群落结构的先进方法【”Ｊ。它对细菌群落测定的重现性较好，能区分不同土壤类型的微生物群落结构，及同一类型土壤下种植不同植物产生的群落 结构差别。Ｋｎｉｇｈｔ【加ｌ已经将Ｂｉｏｌｏｇ法应用于评价重金属污染对微生物群落结构的影响。ｌ＜ｅｌｌ【２１１ 等用此法发现锌会影响土壤微生物的群落结构和功能多样性。Ｂｍｃｅ【矧的研究也表明在农田土 壤中，锌含量超标会大大降低土壤微生物的多样性。各类菌对重金属的敏感程度不同，对污染的耐性也不同。研究表明，一般表现为真菌＞细菌＞放线菌，这便会引起微生物种群结构的变化。Ｒｏａｎｅ【２３ｌ等通过ＤＮＡ分析，检测镉污染及无污染的土壤中的微生物组成，结果发现， 镉污染的土壤中可培养的微生物数量减少，但分离出抗性微生物，其中的假单胞菌随镉浓度的提高，其抗性也提高。Ｓｕｈａｄ０１ｉｃ【２４】等的研究表明，污染重的土壤中耐性细菌比轻污染的土 壤中的耐性细菌数量多，土壤受锌、铅污染后，对固氮菌、纤维分解菌、木霉等菌类起抑制 作用，但耐性较强的大豆根瘤菌和含脂刚螺菌比无污染和污染较轻的土壤多。在铝对微生物影响的研究中，发现随铝浓度的提高，氨化细菌、硝化细菌和反硝化细菌的数量均增加，但３西南大学硕士学位论文 当铝质量分数大于１．３ｇ瓜ｇ时，对它们表现不同程度的抑制。当大于１．７眺ｇ时，对氨化细菌抑制为５０，而硝化和反硝化细菌几乎无法存活。同时有害的丝状真菌数量增加，有益固氮菌的 数量减少【瑚。腾应等【２６１采用Ｂｉｏｌｏｇ法分析矿区侵蚀土壤微生物的群落多样性，发现微生物群落结构在污染与对照土壤中有很大不同：在污染最严重的土样中，Ｂｉｏｌｏｇ板的颜色变化最慢，总 体的平均吸光值也最低。随重金属含量的降低，这些指数都呈上升趋势；同时矿区侵蚀土壤微生物群落的Ｓｈａｎｎｏｎ指数明显低于对照土壤，最低的为０．９９７，指数的平均值是对照土壤的５７．３４％。Ｅｒｉｃ【２７ｌ用ＤＮＡ方法研究铜污染，通过分析ＤＮＡ的不均匀性来反映种群的结构特性， 根据单链ＤＮＡ变性重组速率，可知道种群的差异。杨元根㈣等的研究表明，在铜浓度高的土 壤中，由于其对微生物的损伤有长期性，造成了微生物群落结构发生变异，加入铜的时间越 长，这种改变越明显。可见重金属污染导致群落的变异性增大，而降低了群落的稳定性。 一般认为重金属污染会减少微生物对单一碳底物的利用能力，减少群落的多样性。有研 究表明，在土壤微生物发生明显变化以前，整个微生物区系已经发生质的变化，不适应的微生物数量下降，适应生长的微生物数量增大并积累【２９１。理论上会有两种或两种以上更具耐性的物种来填补，从而丰富了微生物系统，抗性微生物通常由于生理适应或基因改变而取代敏 感种。有人认为在重金属的胁迫下，细胞代谢及微生物功能的改变，引起微生物的生存力和 竞争力发生变化而导致种群大小的改变【刈。因此，重金属胁迫对微生物种群结构产生一定影 响。但从微生物进化的角度来看，适当浓度的重金属，对物种的多样性，以及提高微生物的 抗性、耐性机制，有一定的积极作用。 １．１．４重金属污染对微生物的生态毒性 土壤重金属浓度增加时就会影响甚至抑制微生物的生长及代谢活动。某些非生物学功能 的重金属，如Ｃｄ等在其浓度很低时即有高毒性１３ｌｌ。Ｃｄ对细胞具有致突变效应，导致ＤＮＡ链断， 裂，Ｃｄ可与含羧基、氨基，特别是含巯基的蛋白质分子结合，而使许多酶的活性受到抑制和 破坏，。使肾、肝等组织中的酶系功能受到损害。Ｐｂ可与体内一系列蛋白质、酶和氨基酸内的 功能团相结合，从多方面干扰机体的生化和生理功能，可造成细胞膜的损伤，破坏营养物质的运输【３２Ｊ。Ｈａａｎｓｔｒａ【３３ｌ等研究表明：对舡、Ｃｄ、Ｃｒ、Ｃｕ、Ｐｂ、Ｎｉ、ｚｌｌ复台污染的土壤，重金属总量达到６５８．７ ｍｇ／ｌ【ｇ时土壤微生物生物量仅为对照（１２１．Ｏｎｌｇ厥ｇ）的３２％，而当重金属总量为３４４６．６ｍｇ／ｌ（ｇ时，土壤微生物量只有对照的２２％。另外，土壤微生物区系结构的研究表明，同样在舳、Ｃｄ、Ｃｆ、Ｃｕ、Ｐｂ、Ｎｉ、Ｚｎ复合污染的土壤中，重金属总量达到６５８．７ ｎ彬ｋｇ时，细菌和真菌生物量分别较对照（１２１．Ｏｍｇ／ｋｇ）下降２９％和４５％，当重金属总量达到３４４６．６Ⅱｌｇ／ｋｇ时，分别下降８】％和８５％ｆ３４ｌ。１．２微生物对污染土壤中重金属环境化学行为的影响１．２．１微生物对重金属活性的影响４文献综述 微生物对重金属活化的促进主要是通过各种代谢活动直接或间接地进行。土壤微生物的 代谢作用能产生多种低分子量的有机酸，如甲酸、乙酸、丙酸和丁酸等【３５】。Ｓｉｅｇｅｌ等【３６１报道， 真菌可以通过分泌氨基酸、有机酸以及其他代谢产物溶解重金属及含重金属的矿物。 Ｃｈａｎｍｕｇａｔｈ弱等ｐ ７ｌ报道，在营养充分的条件下，微生物可以促进Ｃｄ的活化，从土壤中溶解出 来的Ｃｄ主要是和低分子量的有机酸结合一起。‘他们通过不同碳源条件下微生物对重金属的活化比较实验，研究结果表明，以土壤有机质或土壤有机质加麦秆及易被微生物利用的葡萄糖作为碳源时，经过一段时间后，不灭菌处理的淋溶液中重金属离子的浓度显著高于灭菌处理， 这说明微生物通过其代谢活动可促使土壤中重金属的活化。他们的研究还表明，微生物可促 进土壤对重金属的固定，同时又能通过其代谢活动及其产物促进重金属的溶解。． 根际土壤是微生物的活跃区域，由于根际微生物的存在大大增加了根系分泌物的数量和 种类，从而促进了根际土壤中重金属的活性。谢正苗等ｐ８ｌ报道，铝超量积累植物如多花野牡 丹的体内ｐＨ值非常低，可以释放Ｈ＋到根际土壤，使根际土壤酸化，导致铝活度增加，引起植物对铝的高量吸收。Ｙｅ等【３９Ｊ报道，Ｃｕ超量积累植物Ｚｊ口疽７ｂ妇根际的Ｆｅ和Ｍｎ氧化物含量较非根际明显要多。此外，根际微生物可以通过分泌有机酸改变根际ｐＨ值，从而改变重金属在根际的存在形态和毒性。而土壤中Ｐｂ、Ｃｕ、ｚｎ、舡浓度增大有利于土壤解吸，７０％以上的吸附Ｃｄ可以被解吸液解吸下来进入土壤溶液，增加Ｃｄ的活性。 土壤中的重金属通过微生物的代谢作用、氧化．还原作用及对重金属的活化作用，改变重 金属在土壤中的存在形态，有利于重金属的植物吸收，有利于重金属在土壤中的生物吸附固 定，有利于重金属毒性的降低。 １．２．２微生物对重金属的氧化．还原过程 微生物可通过直接的氧化作用或还原作用，改变重金属的价态，金属价态的改变会影响 到金属的溶解性、移动性以及生态毒性。微生物能氧化土壤中多种重金属元素，某些自养细菌如硫．铁杆菌类（刀ｌ幻妇ｃｌ髓“ｓ细．，Ｄ６口ｄ口淞）能氧化Ａ一、Ｃｕ＋和Ｆｃ２＋等，假单孢杆菌（Ａ叫如ｍ伽口ｓ）能使触¨、Ｆｃ“和Ｍｎ“等发生氧化，微生物的氧化作用能使这些重金属元素的活性降低ｆ４０ｌ。硫还原细菌可通过两种途径将硫酸盐还原成硫化物，一是在呼吸过程中硫酸盐作为电子受体 被还原；另一是在同化过程中利用硫酸盐合成氨基酸，如胱氨酸和蛋氨酸，再通过脱硫作用 使Ｓ２。分泌于体外【４１１。Ｓ２。可以和重金属Ｃｄ２＋形成沉淀，这一过程在重金属污染治理方面有重要 的意义。可溶的汞（Ｈ９２＋）在环境中可以被好氧细菌还原为可挥发的ＨｇＯ并释放到空气中，可使 用汞还原菌促使汞（Ｈｇ）还原和挥发，以达到对汞污染土壤生物修复的目的。 １．２．３微生物对重金属的生物吸附和富集 土壤微生物本身及其代谢产物都能吸附和转化重金属。微生物对重金属的生物积累机理 主要表现在胞外络合作用、胞外沉淀作用以及胞内积累３种形式。微生物可通过带电荷的细胞 表面吸附重金属离子，或通过摄取必要的营养元素主动吸收重金属离子，将重金属离子富集 在细胞表面或内部【４羽。微生物表面结构对重金属的吸附起着重要的作用，微生物细胞壁和黏５西南大学硕士学位论文 液层能直接吸收或吸附重金属。Ｂｅｖｅｒｉｄｇｅ【４３】认为，重金属首先被吸附于细菌表面的活性位点 上，这个过程符合化学计量规律，并且形成一个重金属的“核”，重金属不断在“核”周围累积， 直到填满核周围的空隙为止。据报道，芽孢杆菌属的菌株都有强大的吸附金属的能力ｍ】。用地衣芽孢杆菌Ｒ０８吸附 Ｐｂ２＋，４５窳ｎ后吸附量可达２２４．８ ｍｊ妇【４卯。最大螺旋蓝细菌吸附Ｃｄ时，Ｃｄ和干细胞的最大吸附量分别可达４３．６３ ｍｇ俘手口３７．ｏｏ ｍｇ鹰。用碱提取的极生蓝细菌能够从Ｃｄ溶液中吸收超过９０％的 Ｃｄ“，所吸附的金属可占生物体干重的１８％（质量分数）脚１。在国外，现阶段主要集中于利用含某目标重金属的培养基，诱导具有重金属抗性的吸附 菌株，通过基因工程技术提取抗性基因，并对该基因进行序列分析，获取遗传密码。也可利 用微生物的代谢产物吸附固定土壤中的重金属，微生物在其生长过程与土壤环境因素相互作 用时会释放出许多代谢产物，如Ｈ２Ｓ及有机物等，这些代谢产物能与重金属发生反应从而吸附固定重金属。１．３重金属污染土壤的微生物预警作用重金属污染土壤的微生物修复是利用微生物的生物活性对重金属的亲合吸附或转化为 低毒产物，从而降低重金属的污染程度。在长期受某种重金属污染的土壤上，生存有很大数量的、能适应重金属污染环境并能氧化或还原重金属的微生物类群。重金属污染土壤的微生 物修复主要包括两方面，即生物吸附和生物氧化．还原。生物吸附是重金属被活的或死的生物 体所吸附的过程，而生物氧化是利用微生物改变重金属离子的氧化．还原状态降低土壤环境中， 重金属含量。仰铂ｎ１４７】研究表明，表面传送的金属绑定缩氨酸细菌吸收剂的生物聚集作用，可 以作为一种通用的重金属污染的清除方法。ＤｅｓｉａｒｄｉｌｌＩ矩】在法国某污染区土壤开展了微生物活，性对铬化学形态的影响研究。该区土壤Ｃｒ含量为４７００ｍ眺ｇ，并有４０％的铬以可溶的六价铬存在；经过研究发现，土壤在３０℃饱和水含葡萄糖和营养物基质内培养后，其内天然微生物的 活性对将Ｃｒ¨还原成低迁移率的Ｃ一有显著的影响。从中分离出还原Ｃ一的菌种链霉菌属 （刀ｌｅ册ｏ∞ｒ蚰砂出，），当细菌细胞群集或附着到悬浮固体颗粒上，劢ＰｒｍＤｃ口ｒ６Ｄ研妇ｓ还原Ｃ， 为Ｃ一，使Ｃｒ的活性及毒性降低。微生物可使还原态重金属氧化，如无色杆菌、假单胞菌能使 亚砷酸盐氧化为砷酸盐，从而降低Ａｓ的毒性【捌。在厌氧条件下，微生物通过沉淀作用，利用 产Ｈ２Ｓ细菌产生的Ｈ２Ｓ与Ｃ‘１２＋结合生成ＣｄＳ沉淀，可以降低Ｃｄ的毒性。除此而外。重金属污染土壤的微生物修复的另一重要方面是菌根的作用。菌根是植物根系和真菌形成的一种共生体，菌根与土壤的交互作用形成了菌根际。对根际的研究结果表明，根际环境的改变直接影响了重金属在土壤．植物系统中的迁移、转化及生物有效性。菌根对于 植物吸收Ｃｕ、ｚｎ和Ｐｂ等重金属有着调控的作用，这可能与菌根对重金属的生物吸附和富集， 或者由于菌根促进磷酸根离子的吸收使其与重金属形成多聚磷酸盐在根部累积有关【姗。在重 金属污染土壤上培育对重金属具有降毒能力的微生物，有些微生物具有嗜重金属性，利用特６文献综述 异微生物有效地吸收土壤中的重金属，使污染区净化，以保证土壤生态健康和农业的可持续 发展。１．４重金属污染土壤的微生物学评价．．土壤微生物与土壤重金属污染之间的关系是国内外环境科学领域的一个研究热点。由于重金属能够明显影响土壤微生物的生长、形态和生化活性，进而降低其生物量和多样性，土壤微生物已经成为一个公认的早期敏感指标被用于重金属污染土壤的评价。 １．４．１±壤中对重金属敏感的微生物廖瑞纠５１ｌ等人在９种土壤以及矿物盐、蔗糖培养基中观察固氮菌对５种重金属及砷的毒性临界浓度，发现六价铬的浓度在３一ｌＯ ＩＩｌ｛班ｇ、铜浓度达１“．２５ ｍｇ／ｌ【ｇ、铅浓度为３０ ｍｇ／ｌ【ｇ、汞为０．３加．７ ｍ眺ｇ、砷浓度为２．５―１０ ｍ酣（ｇ时，土壤中固氮菌数量显著减少，可作为毒性临界浓度使用。有研究报道【５２１，抗铅微生物比例随土壤铅含量加大而增大，其中对照土样中仅有０．０１６％ｍｍｏｌ／Ｌ硝酸铅，且所有微生物均不能耐受２．５姗０ｌ／Ｉ彳消酸铅，而所有的 污染区土壤都有一定数量微生物可以耐受２．５舢ｏｌ／Ｌ稍酸铅。其最大抗性比例分布在核心污染的微生物可以耐受１．０区，土壤微生物中３０．５１８％可以耐受１．ｏｍｍｏｌ儿硝酸铅，２０．３９ｌ％可以耐受２．５嘲ｌ／Ｌ硝酸铅，抗性比例是对照的１２７４倍。这些数据表明，土壤抗性微生物比例可为重金属污染程度评价提 供有价值且非常敏感的信息。已有研究结果表明ｆ５３１，不同微生物类群对重金属的敏感程度不同。Ｇａｄｄ和Ｆ∥矧研究了未污染土壤与污染土壤中的细菌种群，发现每种土壤中的细菌种群都包括两类，其中一种比另 一种能忍耐更大浓度范围的重金属。研究还发现污染重的土壤（Ｃｄ、饥、Ｎｉ、Ｐｂ分别为１２、８２、１９９、２０７ ｍｇ／ｌ【ｇ）比污染轻的土壤（Ｃｄ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ｐｂ分别为２、１１、４８、１３ｍ班ｇ）中耐性细菌的数量多１５倍。Ｋａｎｄｅｌｅｒ等ｆ５５Ｊ在研究不同浓度Ｃｄ对微生物的影响时发现，随Ｃｄ浓度的增加，细 菌的总量并没有明显变化，但敏感菌与耐性菌的数量之比却发生了明显变化。因此这一比值可作为指标来评价土壤重金属污染。 １．４．２生物有效性的影响因素。重金属生物有效性是衡量重金属元素迁移性和生态影响的关键参数，在生态地球化学评 价中有重要的作用。ＭｃＣａｎｈｙｆ５６ｌ强调生物有效性是一个动态的过程，包括两个截然不同的阶 段：以物理化学作用驱动机制的解吸过程和以生理学作用为驱动机制的吸收过程。两种概念 的实质都在于研究化学物质与生物体的一种潜在的相互关系，它必须将生物体与周围环境联 系起来综合考虑，因此，生物有效性不仅受环境的影响，也受生物体自身的影响。目前生物 有效性的评价方法较多，根据不同的研究对象可归为两类，即直接或间接的物理化学法和生 物学评价法，其中物理化学法包括总量预测法、化学提取法和自由离子活度法。各种方法都有其适用范围和局限性。７西南大学硕士学位论文重金属的生物有效性通常受土壤理化性质的影响，孟昭福【５ ７】利用通径分析对ＣＥＣ、ｐＨ、ＯＭ的３个主要污泥性质对５种重金属生物有效性的影响进行了分析，结果表明，ＣＥＣ、ｐＨ为主 要影响因素。土壤施肥能改变土壤的理化性质如ｐＨ、溶液中离子的组成、阳离子交换量等，或直接与重金属离子发生反应，影响重金属的生物有效性。孙波ｌ鹞ｌ等通过对重金属复合污染 红壤菜园土和水稻土的培育试验表明，石灰对土壤重金属污染的修复效果比有机肥好，土壤生物有效性重金属含量与可溶性有机碳（ＤＯＣ）呈极显著相关，而作物生长期的生理指标可以指 示土壤重金属生物有效性的变化。种植不同的作物也会改变土壤重金属的生物可利用性。如种植水稻会促进土壤中的锌向 非活性的残余态转化．使土壤重金属的生物有效性降低１５９Ｊ；而蚕豆使土壤中的锌保持较高活性【６０ｌ；种植油菜后土壤锌的有效态增加、活性增加【６¨。２、重金属对土壤酶活性的影晌研究土壤组成中酶是其中最活跃的有机成分之一，它驱动着土壤的代谢过程，对士壤圈中养分元素的循环和污染物质的净化起着重要作用【６２ｌ。土壤酶来源于土壤中动物、植物和微生物细胞的分泌物及其残体的分解物，其中微生物细胞是其主要来源【峨删土壤酶活性反映了土壤中 各种生物化学过程的强度和方向，其活性是土壤肥力评价的重要指标之一，同时也是土壤自净能力评价的一个重要指标陋】。土壤酶的活性与土壤理化特性、肥力状况和农业措施有着显 著的相关性【鲫。因此，研究土壤酶活性的影响因素，提高土壤酶活性，对改善土壤生态环境，提高土壤肥力有重要意义。２．１重金属对土壤酶的作用机理重金属对土壤酶的作用机理分为３种类型：（１）酶作为蛋白质，需要一定量的重金属离子作为辅基。此时重金属的加入能促进酶活性中心与底物间的配位结合，使酶分子及其中心保持一定的专性结构，改变酶催化反应的平衡性质和酶蛋白的表面电荷，从而可增加酶活性，即．有激活作用；伫）重金属占据了酶的活性中心，或与酶分子的巯基、氨基和羧基结合，导致酶活性降低，即有抑制作用；（３）重金属与土壤酶活性没有专一对应关系，酶活性有时并不能显二 示重金属的专性影响。 关于重金属对土壤酶活性产生影响的主要原因ｆ６７１，一般认为ｃｄ、Ｐｂ、ｚＩｌ与酶活性的功能产生直接作用。使其功能的空间结构发生了一定的变化所致。周札恺认为ｆ６８ｌ，重金属对酶的 钝化，可能是高浓度的重金属导致了与某些酶分子的巯基、氨基、或羧基结合，占据了酶活 性的功能基位置；产生了抑制作用；当重金属离子促进了酶活性中心功能与底物之间的配位结合时，便产生激活作用。另外：重金属（Ｃｄ、Ｐｂ、Ｚｎ）可通过抑制土壤微生物的生长和繁殖， 减少其体内酶的合成与分泌，导致土壤酶活性的降低。 Ｌｅｂｅｄｃｖａ【６９】发现质量分数为２０ｍ／ｋｇ的Ｃｄ不会引起脲酶活性明显降低，而１００―１５０ ｍｇ／ｋｇ．８文献综述 的Ｚｎ和８０―１００ｍ眺ｇ的Ｐｂ则使脲酶活性显著降低。沈桂琴等㈣的研究显示Ｈｇ、Ｃｄ、Ｐｂ对土壤ｍｇ瓜ｇ；脲酶、转化酶、碱性磷酸酶和蛋白酶活性有明显的抑制作用，而Ｃｄ具有激活作用，脲酶的反 应最敏感；他们提出重金属的临界质量分数，Ｈｇ为１．５ ｍｇ／ｌ【ｇ、Ｃｄ为３．０ ｍｇ／ｌ【ｇ、Ｐｂ为５００同时发现“抗性酶活性”现象，认为当重金属在土壤中达到一定质量分数时。大部分微生物死亡．而一小部分微生物在有毒物质污染下能生存下来，自行繁殖，从而产生抗性酶活性，．表观上 酶活性值降低后又增大，有时还会出现多个抗性峰。吴家燕【７１?７２ｌ对水稻根系酶活性的研究也发现类似现象。杨志别。７３】等发现，ｃｄ、ｚｎ、Ｐｂ对土壤酶活性的抑制效应顺序Ｃｄ＞ｚＩｌ＞Ｐｂ：在过氧 化氢酶、脲酶、碱性磷酸酶、转化酶中，脲酶受重金属的抑制作用最为敏感。１砌ｏｒｏｖ等【７４Ｊ认为Ｐｂ对蛋白酶活性没有影响，而明显激活脲酶活性，抑制淀粉酶。Ｃｈａｎｄｅｓ等【７５ｌ发现铜与脱氢酶活性之间关系不密切．认为脱氢酶不能表征土壤铜污染的程度。２．２影响土壤酶活性与重金属关系的因素２．２．１土壤机械组成和有机质质量分数土壤酶的存在状态是吸附并固定在有机质和土壤粘粒上，即土壤具有保护酶的能力。这． 种能力的高低即土壤对酶的保护容量主要取决于有机质和粘粒质量分数等。重金属进入土壤 后，大多数便与土壤有机质、粘粒等发生吸附作用，以吸附态存在，结果使其生物毒性减弱，有机质和粘粒质量分数越高。重金属的生理毒性就越弱，即有机质和粘粒对重金属毒性的缓．冲作用就越强。不同粒径团聚体的酶活性不一样，小团聚体的酶活性要比大团聚体中的高。团 聚体的稳定性也与酶活性有关，如脲酶活性与土壤团聚体的稳定性及土壤容重呈显著负相关，转化酶活性与土壤团聚体的稳定性呈显著的正相关。周礼恺等【７６】提出，黑土、棕壤脲酶活性主要集聚在微团聚体上，相当于土壤粒级的粘粒部分。随粒径增大，脲酶活性有下降趋势。 糖酶主要吸附在粉砂粒上，粘粒和粉砂对酶吸附量的多少，与这些土粒的矿物组成有关。 Ｆｒａｎｋｅｎｂｃｒｇｃｒ等【明的试验表明沙土土壤酶受重金属的抑制作用比粘质土壤中的更加敏感：当锰质量分数为２５０ｍｇ瓜ｇ时，沙土蔗糖酶活性缩减了７０％，而粘质土壤中的蔗糖酶活性只 降低了１０％。２．２．２重金属种类、离子价等 有人试验分析六种土壤中的重金属对脲酶活性的影响【７８１，方法是将重金属加入样品后３０分钟，再加入尿素以测定脲酶活性的抑制率呈Ａｇ＋＞Ｈ９２＋＞ｃＩｕ２＋＞ｃｄ２＋＞ｚｎ２＋＞ｓｎ“＞Ｍｎ２＋的规律变化。在多种情况下，ｚｌｌ和Ｃｕ土壤中各种酶（维生素酶、蛋白酶、脱氢酶）的活性没有明显的抑制 作用，相反，常常产生刺激作用，有人发现【７９１，Ｃｒ“抑制土壤磷酸酶的活性，但ｃ一表现出。激活作用。 ２．２．３温度：～’土壤温度直接影响释放酶类的微生物种群及数量，因此，土壤温度是影响酶活性的因素之一。有有研究表吲矧，当温度由１０℃上升到６０或７０℃时，土壤酶活性显著增加；但随着温９西南大学硕士学位论文 度的进一步升高；脲酶迅速钝化：在１０５℃下加热２４小时或在１１５℃下加热１５小时，土壤酶活 性就会完全失活。随着温度升高；土壤中重金属的物理和化学反应速度加快，重金属毒性有所改变，对酶抑制作用也会随之改变。重金属在高温的条件下可能失活，那么对酶活性的作用也就会改变。２．２．４’’ｐＨ土壤酸碱性直接影响着土壤酶参与生化反应的速度。有些酶促反应对ｐＨ值变化很敏感， 甚至只能ｐＨ在较窄的范围内进行【８ｌｌ。在酸性条件下，土壤中的重金属主要以离子态存在；ｐＨ 越低，土壤中游离出来的重金属数量越大，活性越强，对生物的毒害就越高：反之；亦然。其主要机理是土壤胶体的吸附并伴有专性吸附作用；重金属与碳酸盐、铁锰结合为沉淀反应， 以及与有机质的结合作用等。土壤酶蛋白具有一或多个酶促反应的最适ｐＨ，所以其活性的高低必然受到土壤酸碱度的影响，这方面已经有人研究得到结果。如Ｆｌｒ蛆ｋｃｎｌ，ｅ唱ｅｒ等【跎１的研究发 现，土壤脲酶有两个最适ｐＨ值，‘即ｐＨ６．５―７．０和ｐＨ８．８―９．０；土壤磷酸酶的最适ｐＩ｛值为４．０―５．Ｏ、６．００．０、８．乱９．０，分别为酸性、中性和碱性磷酸酶。２．２．５植物植物在其生长过程中，不停地向土壤中分泌各种有机、无机物和生长激素，它们促进了微生物的生长发育，使得土壤中的酶含量增加。植物还会吸收土壤中的重金属类物质，使重 金属质量分数降低，生态毒性减弱，可提高土壤中酶的活性，可见植物对重金属与土壤酶之间的关系有重要影响。龙育堂掣∞】对非食用经济作物苎麻净化土壤中的汞的效果进行了研究，发现在汞质量分数为１３０．０ｍＩ她的土壤上苎麻仍能正常生活，它属耐汞作物。据测算，其种植会使土壤自净年限缩短８．５倍。由于植物能吸收土壤中的重金属，因此研究考虑用植物来消除土壤中的重金属污染成为当今治理重金属污染的重要途径。 ２．２．６水分一般情况下，土壤湿度较大时，酶活性较高，但土壤过湿时，酶活性减弱。周礼恺等１７６ｌ 研究了具有连续雨季和旱季地区的土壤酶活性，他指出当旱季结束雨季开始时．土壤酶活性 显著增强。土壤含水量减少时，酶活性也减弱。Ｍａ亿ａｄｏｒｉ等【驯发现，在湿润条件下．土壤脱氢酶活性受到抑制时所需的Ｐｂ质量分数为１００―５０００ ｕｇ／ｌ【ｇ范围内，土壤脱氢酶活性则会持续降低，但统计差异不显著；磷酸酶活性对湿度的反应不明显，随Ｐｂ质量分数的增加。酶活性降低。。上述各种影响因素对重金属和酶活性都有重要的影响，但是在土壤环境中，往往是各种 因素共同作用来影响土壤中的酶活性和重金属，因此，在考虑酶活性和重金属之间的关系时，应该考虑多种因素的作用。２．３土壤酶与重金属关系的研究现状李华等【明采用油菜盆栽实验表明，随着向土壤中加入重金属量的增加，在重金属量低时．１０文献综述土壤酶活性呈上升的趋势；在高时呈下降的趋势。Ｎａｐｌｅｋｏｖａ等人【８６ｌ研究发现，高含量的ｚｎ、ｃｄ可减少土壤细菌、真菌、放线菌数量；抑制脲酶、过氧化氢酶活性、降低土壤氨化速率。Ｇ麟ｚｔａ等人即ｌ发现，土壤微生物群体数量和土壤酶活性随ｃｄ、Ｐｂ、Ｚｎ污染物的增加而降低。Ｔｙｌｅｒ报 道【嘲，ｚＩｌ、Ｃｕ污染能降低土壤腐殖质分解速率：磷酸酶活性和Ｐ的矿化速率。珞躯∞ｎ【８９１通过ｚ丑、Ｍｎ和Ｎｉ污染的模拟试验研究表明，ｚｎ对土壤酶活性抑制的顺序是；脲酶＞转化酶＞脱氢 酶＞过氧化氢酶。曹利军等人咖ｌ研究表明，Ｃｄ对土壤酶、过氧化氢酶、脲酶和碱性磷酸酶活性 有抑制作用。石忠庆【９ｌｌ发现，水稻土脲酶和过氧化氢酶活性受Ｃｄ、Ｐｂ、Ｃｕ、ｚｎ污染的抑制。 Ｋｕｍａｒ等将质量分数为５０ｍｇ瓜ｇ或２５ｕｍｏ垤的不同金属离子添加到土壤中，脲酶活性可受到抑制。胡桂荣（１９卿的试验【９ｌｌ发现，向红壤中投入Ｃｎ、Ｐｂ，当Ｃｄ质量分数为３０呐，Ｐｂ为７５０时对脲酶有显著抑制作用，而低浓度Ｃｄ、Ｐｂ则有激活作用，许炼峰等在蔬菜盆栽模拟Ｃｄ 分数为２０ｍｇ／】ｋｇ１．Ｏｍｍｇ瓜ｇ）、Ｐｂ（０―１０ ｍｇ／ｌ【ｇ）污水灌溉。发现蔗糖酶比脲酶对重金属更敏感。ｋｂｅｄｅｖａ列发现质量ｍ班ｇ的Ｃｄ不会引起脲酶活性明显降低。而１００一１５０ ｍｇ他的ｚｎ和８０一１００ ｍｇ／ｌ【ｇ的Ｐｂ则使脲酶活性显著降低。沈桂琴【９２瞎的研究显示，Ｈｇ、Ｃｄ、Ｐｂ对土壤脲酶、碱性磷酸酶和蛋界质量分数；但它们对酶活性作用的浓度不同Ｈｇ为１．５哦、Ｃｄ为３．Ｏ抑制作用最为敏感。白酶活性有明显的抑制作用，而Ｃｆ具有激活作用。脲酶的反应最敏感，他们提出重金属的临ｍｇ／ｋｇ、Ｐｂ为５００ｍ眺ｇ。Ｔ（＇ｄｏｍｖ等认为Ｐｂ对蛋白酶活性没有影响，而明显激活脲酶活性，抑制淀粉酶。Ｃｈ勰ｄｅｓ等【叫发现铜与脱氢酶活性之问关系不密切。杨志新等【舛ｌ发现，Ｃｄ、ｚｎ、Ｐｂ对土壤酶活性有抑制， 其顺序为Ｃｄ＞ｚｎ＞Ｐｂ：在过氧化氢酶、脲酶、碱性磷酸酶、转化酶四种酶中，脲酶受重金属的综合国内外的研究结果，重金属对土壤酶活性的影响，因土壤重金属含量和种类不同而 不同，含量高会使土壤酶失活，含量低并未达到污染时，会对土壤酶有激活作用。同时不同重金属对土壤酶活性的作用效果也不同。重金属和土壤酶活性之问确实在一定程度上，土壤酶活性可以表征重金属的污染程度。目前提出的土壤酶活性类型有土壤脲酶、过氧化氢酶、 转化酶、磷酸酶等监测结果差异较大，不同酶受重金属的影响也不同，其主要原因是由于酶 类型，土壤性质、温度等测定条件较难控制所致。不过由于影响因素较多，所以测定方法的最佳条件，有待于进一步研究。西南大学硕士学位论文第２章引言２．１选题背景及依据随着我国工农业的迅速发展，采矿、冶金、电镀、化工、电子、制革、染料、塑料等工业产生的三废，以及污灌、化肥和农药的不合理施用等农业措施使得大量的重金属进入土壤， 污染土壤，通过食物链危害人们的健康。根据护国农业部对全国污灌区的调查结果，在约１４０ 万ｈｍ２的污水灌区中，遭受重金属污染的土地面积占污水灌区面积的６４．８％，其中轻度污染 的占４６．７％，中度污染的占９．７％，严重污染的占８．４％【９５ｌ。土壤作为环境的组成部分，受到来自工业和社会的废水、固体废物、农药化肥及大气降尘等的污染。其中重金属以其在土壤中难降解，毒性强，具有积累效应等特征受到广泛关注。 近年来，国内外学者就重金属污染土壤生物、生态效应作了大量的研究工作，并在重金属污染土壤的微生物学评价中取得了一定的研究成果。ｌ（ａｎｄｅｌｅｒ等【９６１人研究指出Ｃｕ、ｚｌｌ、Ｐｂ等 重金属污染矿区土壤的微生物生物量受到严重影响，靠近矿区附近土壤的微生物生物量明显低于远离矿区土壤的微生物生物量。研究表明：不同重金属及其不同浓度对土壤微生物生物量 的影响效果也不一致。Ｋａｎｄｅｌｅｒ等【９７１（１９９２）报道了金属冶炼厂附近土壤的酶活性遭到重金属污染，与无污染土壤相比，其中脱氢酶、蛋白酶、碱性磷酸酶以及硫酸酷酶活性均受到明显。抑制。ｃａｍｐｂｅｎ等ｆ９８１（２０００）研究结果表明，铜对土壤Ｂ一半乳糖苷酶和脱氢酶的Ｅ（‰值分别ｊ为７５．３９和２４．５５吨啦ｇ，。ｗｉｌｋｅ眇１（１９８７册究发现ｚｎ和ｃｕ分别加入土壤８年和１０年后，土壤脱氢酶和蛋白酶活性受到极显著的抑制作用，尽管供试土壤的Ｚｎ浓度为２２２ｍ∥ｋｇ，没有 超过建议标准（３００ ｍｇ／ｌ【ｇ），但它仍降低了土壤酶活性。但由于自然条件下，突然微生物及酶 活性受植被、季节、灌溉、耕作等因素的影响，检测结果差异很大。因此重金属污染土壤生 物、生态效应研究多在实验室进行，而不同实验室由于分析方法不同，试验结果缺乏统一的 表示方法，难于比较分析，有的结果甚至互相矛盾。因此，对于重金属对农业、林业土壤污染的生物学效应已经成为一个极待研究和解决的课题。２．２主要研究内容１、重金属污染对土壤酶活性的影响： （１）矿区污染土壤中酶活性研究（２）研究恒温条件下重金属污染对土壤酶活性的影响（３）采用盆栽试验研究重金属污染下土壤酶活性的变化。１２第２章引言 ２、重金属污染对土壤微生物数量及活性的影响： （１）矿区污染土壤微生物数量及活性研究 （２）研究恒温条件下重金属污染对土壤微生物数量及活性的影响（３）采用盆栽试验研究重金属污染下土壤微生物数量及活性变化。２．３研究目标：研究废矿区土壤酶和微生物活性变化，结合实验室模拟实验及盆栽试验。旨在进一步弄 清楚重金属污染对土壤酶和微生物活性的影响．为确定重金属污染土壤的生物预警阀值，重金属污染下的土壤生物效应及安全预警系统评价提供理论依据。２．４技术路线（附图）西南大学硕士学位论文第３章矿区重金属污染土壤的生物效应研究我国南方有色金属矿区分布密集。大量的土壤遭采矿破坏或重金属污染退化，并造成土壤生态系统的严重破坏。目前，‘有关我国煤矿区废弃地复垦研究较多，但有关有色金属矿山 废弃地复垦研究的报道很少。国内外对工矿废弃地的研究多侧重于退化生态系统植被的恢复 过程及特征的研究，而对有色金属矿区废弃地土壤酶活性及微生物生态及恢复的研究明显缺 乏。事实上，在恢复一个受重金属污染的废弃地土壤生态系统时，不仅要恢复地上部分的植 被，还要恢复土壤微生物生态群落，重建土壤微生物生态系统。因此，积极开展重金属污染 土壤的生物效应研究，对于了解矿区土壤生态系统退化的本质和成因极有帮助，进而可以指导矿区土壤生态系统的恢复和重建。同时，研究重金属污染下的生态效应，包括对土壤酶活性及微生物的影响，可为建立重金属污染的微生物评价诊断指标以及控制污染提供理论依据。３．１材料与方法３．１．１矿区土壤样品的采集东川是昆明市所辖五区之一，东临会泽，南接寻甸，西连禄劝，北与四川省会东县隔金 沙江相望，北纬２６。０６?，东经１０３。１２ｔ，自古就有“天南铜都”之美誉，东汉以后为历代王朝提供铸币原料，到清代盛极一时，称为“京铜”、“云铜”。东川矿产资源丰富，为我国六大产铜基地之一，境内最高海拔４３４４．１米，最低海拔６９５米，高差３６４９．１米，所采土样矿区海拔为１４７３ 米，年平均气温１６．２℃，年平均降水量为８７６．５毫米。所选取的废矿区主要植被为马尾松（Ｐｆ，ｌ搬ｍ口删妇ｎ）、水冬瓜似伽“ｓ ｎ印口切坫西Ｄ．Ｄ溯）、芸香草（俗名石灰草等，ｃ）能的ｐＤｇ伽ｄ妇细船肚￡砂腑舾）等，矿区周围大部分表面基本裸露，土壤类型是发育于风化残坡积物的红黄壤，土体比较疏松，水蚀风蚀现象严重。在铜矿污染区根据污染情况以距离矿口不同距离设置采样带，土壤编号分别为ｌ＿４号，其中１号土壤为矿区矿口，２号土壤距矿口１００．２００米，主要为废矿堆，３号土壤距矿口８００ 米，有极少量散落的矿渣存在，４号土壤为远离矿区１０ ｋｍ的无污染区，作为对照。每个采样带选取６个点，取１０．１５厘米的土层混合土样，土样装入无菌封口塑料袋内。将一部分新 鲜土样去除石砾、枯草等后研磨过２毫米尼龙网筛，调节土壤含水量至田问持水量的４５％左右，装入无菌塑料袋内，置于０４℃冰箱内保存，以供土壤微生物活性指标分析，另一部分 土样于室内自然风干、研磨、过筛，以供土壤酶活性及基本理化性质测定。１４第３章矿区苇会属污染＿十壤的乍物敛ｊ遁研究 表３．１．土壤基本理化性质’表３．２．十壤机械组成表３．３．土壤主要重金属含量 重金属全量（ｍｇ／ｋｇ） 土样编号ｏ有效重金属含量（ｍｇ瓜ｇ）Ｃｄ １ ２ ３ ４ ２３．５７ １７．４５ ９．６８ ０．６２Ｚｎ １４５７．８５ ９９７．２６ ４６８．３９ １２８．３４Ｃｕ ２５３８．６７， １５２９．５２ ２５８．３７ ２７．６９Ｐｂ ２０５８．６７ １４５４．３１ ３８９．３９ １４．６３Ｃｄ １．８１ １．２７ Ｏ．２３ Ｏ．０２ｚｎ １５０．６７ １２９．２９ ５１．３５ ２３．７４Ｃｕ ０３７１．５８ ２４１．３５ ７６．１８ ７．１６ｏＰｂ ３８６．５９ ２９８．５４ ８４．５９ ６．５３３．１．２测定方法土壤基本理化性质均采用七壤农化常规分析方法测定【１００】；土壤有效铜、锌、铅、镉含量 采用１ｍｏｌ／Ｌ ＮＨ４０Ａｃ浸提，全铜、锌、铅、镉含量经ＨＮ０３．Ｈｃｌ０４混合消化，原子吸收分光光度计测赳１０¨。蔗糖酶活性采用３，５．二硝基水杨酸比色法测定，以２４小时后１克ｒ十壤葡萄糖的毫克数表 示，即ｍｇ（葡萄糖）／ｇ（３７℃，２４ｈ）【１０甜。 脲酶活性采用靛酚蓝比色法测定，以２４小时后１克土壤中ＮＨ３．Ｎ的毫克数表示，即 ｍｇ（ＮＨ３．Ｎ）鹰（３７℃，２４ｈ）【１叫。 酸性磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法测定，以２４小时后１克土壤中释出的酚的毫克数 表示，即ｍｇ（酚）偿（３７℃，２４ｈ）‘１０２１。 过氧化氢酶采用Ｏ．１ｍｏｌ／Ｌ高锰酸钾滴定法测定，以２０分钟后１克十壤的０．１ｍｏｌ／Ｌ高锰酸 钾的毫升数表示，即ｍｌ（０．１ｍｏＩ／Ｌ高锰酸钾）鹰（窒温，２０ｍｉｎ）ｆ１吲。脱氢酶采用三苯基四氮唑氯化物ｍＣ）比色法测定，以２４小时后１克土壤中ＴＰＦ的毫克１５Ｐｑ南大学大学硕ｌｊ学位论文数表示，即ｍｇ（ＴＰＦ）鹰（３０℃，２４ｈ）【１０２１。 土壤微生物生物量碳采用氯仿熏蒸一Ｋ２ｓ０４浸提，１’ｏＣ一５００自动分析仪测定【１０３】。 土壤微生物生物量氮采用氯仿熏蒸．Ｋ２ｓ０４浸提，开氏定氮法测定【１０３ｌ。 土壤微生物数量测定：细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基，放线菌采用改良高氏一号培养基， 真菌采用马丁氏培养基，氨化细菌采用蛋白胨琼脂培养基，硝化细菌采用改良的斯蒂芬逊 （Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ）培养基，纤维素分解菌采用赫奇逊（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ）氏培养基，固氮菌采用改良的阿须 贝（Ａｓｈｂｙ）无氮琼脂培养基，以稀释平板法进行计数【１０４ｌ。３．１．３统计分析方法所列数据为３次重复的测定值，数据采用ｓＰｓＳｌ２．０统计软件进行分析。３．２结果与分析３．２．１矿区土壤污染状况由矿区土壤主要重金属含量（表国一３）可以看出，土样重金属含量表现为矿口（１号）＞距矿口１００．２００一米（２号）＞距矿口８００米（３号）＞距矿口１０００Ｇ米（对熙４号）。矿区Ｃｄ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｐｂ全量分别是对照十壤的１５．６１～３８．０２、３．６５～１１．３６、９．３３―９１：６８、２６．６２～１４０．７２倍， 各金属元素含量顺序为Ｃｕ＞Ｐｂ＞Ｚｎ＞Ｃｄ。表明矿区土壤的重金属污染非常严重。由矿区土壤基本理化性质（表３．１）可以看出，距离矿区越近，污染越严重，土壤ｐＨ越低，有机质、有效Ｎ、Ｐ、Ｋ的含量也越来越低，即土壤肥力越低。３．２．２矿区土壤重金属污染对土壤酶活性的影响表３―４．供试十壤主要酶活性表巾数据为平均值±ｓＤ（ｎ－３）；ａ，ｂ，ｃ、ｄ表ｊ≯：０．０５水平上的差异显著性。由表３―４可以看出，土样间各种酶活性存在着一定程度的差异，其中矿区土样的酶活性 较低，且随着距矿口距离的增加，酶活性越来越高，表明矿区土壤不同区位段上的十壤酶活 性存在着差异，而对照土壤的各种酶活性均为最高。在５种酶中，以脲酶、酸性磷酸酶、过 氧化氢酶、 脱氢酶活性的变异幅度较人，变异幅度分别达剑了２３％～７４％、３１％～８３％、１６第３章矿区重金属污染土壤的生物效应研究１７％托９％、３５％一９２％，只有蔗糖酶活性的变异幅度相对较小，变异幅度只有２５―４７％。３．２．３矿区土壤重金属污染对微生物活性的影响３．２．３．１矿区土壤微生物活体数量表３．５．供试土壤微生物数量表中数据为平均值：ｓＤ（昭３）；＿，ｂ，ｃ、ｄ表示网．０６水平上的差异显著性?从表３．５中可看出在随着远离矿区口的距离的增加，土壤中的微生物的数量也将会增加。 与对照土壤（４号）相比，矿区土壤（１、２、３号）的土壤细菌、放线菌数量有明显差异，其 中细菌、放线菌数量分别下降３２．８０％、８％．５０％。但真菌的数量变幅不大，只下降了３％．８％， 并且数量上细菌＞放线菌＞真菌。与对照相比，矿区土壤微生物总数下降了２９．７７％。３．２．３．２矿区重金属污染土壤微生物的主要生理类群表３．６．供试土壤微生物的主要生理类群表中数据为平均值±ｓＤ（弘３）ｌ?ｔ ｂ，ｃ、ｄ表示ｐ＝０．０５水平上的差异显著性．土壤微生物各主要生理类群直接参与土壤中Ｃ、Ｎ等营养元素循环和能量流动，其数量 和活性直接关系到土壤生态系统的维持和改善１１０５】。由表３－６中可以看出，随着重金属污染程 度的加剧，土壤微生物各主要生理类群数量均呈下降趋势，对照土壤（４号）氨化细菌、硝 化细菌数量分别是矿区土壤（１、２、３号）的４．１２．２１．５８倍和４．７０－５９．９２倍。土壤中氨化细菌 和硝化细菌直接参与分解土壤中有机态Ｎ，矿区土壤中这两类土壤微生物数量减少，降低了 土壤的供Ｎ能力。土壤中自生固氮作用是土壤氮素的重要来源之一，与对照相比，矿区土壤 的固氮菌数量减少趋势明显，下降幅度达到４５．１％．９３．７％。纤维素是组成枯枝落叶物的主要 成分，纤维素分解菌积极参与植物残体中纤维素的分解。与对照土壤相比，矿区土壤纤维素１７西南大学硕士学位论文 分解菌数量下降６９．３％．９６．５％，矿区土壤纤维素分解菌数量降低，直接影响到植物残体的转 化速度，使土壤中难分解的植物残体积累量增加。３．２．３．３矿区土壤的微生物生物量表３．７．供试土壤的微生物生物量表中数据为平均值±ｓＤ（ｎ＝３）ｉ－，ｂ。ｃ、ｄ表示ｐ＝ｏ．０５水平上的差异显著性．本试验测定了土壤微生物生物量碳、氮含量，用于表征土壤微生物生物量。由表３．７ 可以看出，矿区土壤的重金属污染对微生物生物量碳和氮以及微生物生物商都是随着距离矿区口距离的增加而逐渐减弱，与对照相比，微生物生物量碳、氮及微生物生物商分别下降２３．６７―６６．２０％、３１．８５～７４。７０％、２０．７５《７．２６％，而微生物生物量Ｃ烈逐渐升高。３．３讨论土壤中一切生物化学过程都离不开土壤中各类酶的参与，同时土壤酶活性也是衡量土壤生物学活性和土壤生产力的重要指标【１ａ７ｊ。土壤重金属污染对土壤酶活性影响很复杂，尤其在自然状态下影响更是多方面的。酶作为土壤的组成部分，其活性的大小可敏感的反映土壤 中生化反应发生的方向和强度，是探讨土壤重金属污染生态效应的重要途径之一【１吲。３．３．１土壤中蔗糖酶直接参与土壤的Ｃ素循环，而脲酶直接参与土壤中含Ｎ有机化合物的转化，其活性强度常用来表征土壤Ｎ素的供应强度１１０５１。在矿区土壤中由于重金属含量高，蔗糖酶和脲酶活性降低，削弱了土壤中Ｃ和Ｎ素的营养循环。土壤酸性磷酸酶酶促作用能加速土壤有机磷的脱磷速度，从而提高土壤磷的有效性，由于土壤酸性磷酸酶活性的降低，从而降低了矿区土壤的供磷能力。可知，矿区及其周边土壤环境的酶系统遭到破坏，距离矿区口越近，重金属含量越高，其酶活性值越低。这与重金属对酶产生的抑制作用有关，其作用机理可能因酶分子中的活性部位－巯基和含咪唑的配位结合，形成较稳定的络合物，产生了与底物的竞争性抑制作用，或者可能是由于重金属通过抑制土壤微生物的生长和繁殖，减少体内酶的合成和分泌，最终导致酶活性下降【１傩ｌ。１８第３章矿暖．重会属污染十壤的乍物效应研究３．３．２矿区土壤的重金属污染导致士壤中细菌、放线菌、真菌数量明显降低，其中细菌在 数量变化上最大，这也表明了细菌是三者中对重金属最为敏感的微生物；最少的则是真菌。 真菌的数量变幅不大，可能的原因是作为初级真核生物的真菌对环境的适应力和抗逆性要强 于细菌和放线菌，从而表现出高浓度的重金属对真菌生长具有刺激作用。 ３．３．３与对照土壤相比，在矿区士壤内参与土壤中Ｃ、Ｎ转化的氮化细菌、硝化细菌数量明显 降低；随着重金属污染加剧，直接导致同氮菌数量减少；纤维素分解菌数量降低，使土壤中 难分解的植物残体大量积累。因此，矿区土壤生态环境恶化，生态系统处于不利于有益 微生物的繁殖和活动的境地，从而大大削弱了土壤中Ｃ、Ｎ营养元素的循环速率和能量流 动。 ３．３．４重金属胁迫对土壤微生物生物量的影响与重金属含量密切相关，随着距离矿区口距 离的增加，污染程度下降，土壤微生物生物量碳、氮的含量均由明显的增加趋势，微生物生 物商也明显上升，表明重金属对微生物量有抑制作用，这与Ｂｆｏｏｋｅｓ Ｐ．Ｃ．等的研究结果一致【１０６】。而微生物生物量Ｃ小却随着污染的加剧而升高。相关性分析结果表明，微生物生物量碳、氮、微生物生物商与土壤有效铜、锌、铅、镉呈显著负相关，微生物生物量Ｃ／Ｎ与土壤有效铜、 锌、铅、镉呈显著正相关，重金属污染降低了土壤微生物生物量、微生物生物商，同时微生 物生物量Ｃ／Ｎ却升高。， ｏ微生物生物量的下降一定程度上削弱了矿区土壤Ｃ、Ｎ的周转速率和循环速率以及供Ｐ 能力。微生物商是指土壤微生物生物量ｃ与土壤有机碳总量的比值。近年研究表明微生物商 对重金属污染较敏感，是反映土壤生态系统中Ｃ平衡的指标，当外界环境发生改变时可较早 检测出Ｃｍｉｃ／Ｃｏｒｇ的变化。有研究认为用微生物商表示土壤过程或土壤质量的变化，比单独用 微生物生物量或土壤有机碳总量有效，因为商是比值，可避免使用绝对量或有机含量不同的 土壤进行比较时所出现的某些问题。３．４结论矿区重金属污染土壤研究结果表明：距离矿区越近，土壤ｐＨ越低，有机质、有效Ｎ、Ｐ、 Ｋ的含量也越来越低，土壤肥力越低。矿区周围土壤的微生态系统也遭到破坏。矿区重金属污 染土壤的酶活性较对照显著降低，且随着距矿口距离的增加，重金属污染程度逐渐降低，酶 活性越来越高。矿区重金属污染对５种酶的抑制作用为脱氢酶＞酸性磷酸酶＞脲酶＞过氧化 氢酶＞蔗糖酶。矿区重金属污染对十壤微生物活性产生了严重的影响，其中细菌和放线菌的 数量明显下降，而真菌变化幅度相对较小。随着矿区重金属污染程度的加剧，土壤微生物受 到的抑制程度明显增强，土壤微生物的主要生理类群、微生物生物量碳、氮都显著下降，从 而在一定能力上削弱了土壤Ｃ、Ｎ的周转速率和循环速率以及供Ｐ能力。１９两南人学硕十学位论文第４章恒温培养试验下重金属污染土壤的生物效应研究４．１材料与方法４．１．１供试土壤供试土壤为中性紫色土，系侏罗系沙溪庙组紫色沙页岩母质上发育而来的灰棕紫泥，采 自重庆市北碚区西南大学资源环境学院农场。测得土壤基本理化性质为有机质１２．６ １９／ｌ（卧ＣＥＣｌ５．２ｃｍｏｌ（＋）瓜ｇ、ｐＨ ６．４、全Ｎ１．１３７ｇ／ｌ（ｇ、碱解氮７９．６ ｍｇ／ｌ（ｇ、全磷０．５２ ｇ／ｌ【ｇ、有效磷１２．１Ｏ．６３ｍ眺ｇ、全钾２２．６ ｍ班ｇ、Ｃｕｇ／ｌ（ｇ和速效钾９５．９ ｍｇ／ｋｇ。土壤重金属全量为Ｃｄｍ班ｇ、ｚｎ１２８．２６ｍｇ瓜ｇ、Ｃｕ ３１．２５ ｍｇ瓜ｇ和Ｐｂ ５８．６１ ｍｇ／ｌ（ｇ，有效重金属含量为Ｃｄ ０．０１ ｍｇ／ｌ【ｇ、Ｚｎ １．０１１．０７ｍｇ／ｌ（ｇ和Ｐｂｌ．０５ｍ眺ｇ。表４．１供试土壤机械组成（％）０Ｏ４。１．２供试重金属形式ｏ。Ｏ据滕应研究【２６】，醋酸盐在土壤中的溶解性、重金属生物有效性要强于氯化盐，所以本试验选择供试重金属的形式为醋酸盐形式，分别为：醋酸铜（Ｃ狙６Ｃｕ０４?Ｈ２０）、醋酸锌 （Ｃ４Ｈ６ｚｎ０４?２Ｈ２０）、醋酸铅（Ｃ４Ｈ６Ｐｂ０４?３Ｈ２０）、醋酸镉（Ｃ４Ｈ６Ｃｄ０４?２Ｈ２０），均为分析纯。４．１．３模拟试验设计与方法本试验于２００７年３月２０日至２００７年４月２１日于西南大学资源环境学院农化实验室恒 温培养箱内进行。将所采取的土壤除去植株残体、砾石等，然后取过２。３ ｍｍ筛的土，称相当 于干土重２００克左右装入小塑料杯中，重金属铜、锌、铅、镉以醋酸盐的形式溶解后施入土 中，搅拌均匀，用透气塑料薄膜封口，放剑恒温（２５℃）培养箱中培养３０天，期间保持土壤 含水量在田间最大持水量的４０～６０％之间，每隔三天检查一次，并用称重差量法调节土壤水分。 每隔１０天取一次土进行土壤酶及微生物指标测定。取土时将＿十倒出充分混匀，按四分法取样， 一部分鲜样保存在０―４℃冰箱内供测微生物活性用，一部分风干后，研磨、过筛供测定酶活性 用。试验分单因素和复合冈素，单冈素处理重金属浓度５个浓度梯度，分别为对照及铜１００２０第４章恒温培养试验下重金属污染土壤的生物效应研究ｍｇ／ｌ【ｇ、２００ ｍｇ瓜ｇ、３００ ｍｇ／ｋｇ、４００ ｍ酢ｇ，锌ｌｏｏｍｇ／ｋｇ、２００ ｍｇ，Ｉ嘻、４００ ｍｇ，ｋｇ、８００ ｍｇ，ｋｇ，铅１００ｍ眺ｇ、２００ ｍｇ他、４００ ｍ如、８００ ＩＩｌｇ／ｌ【ｇ，镉５ｍｇ／ｌｃｇ、１０ ｍ眺ｇ、２０ ｍｇ他、５０表４．２．培养试验复合因素处理方案ｍｇ／ｋｇ，共１６个处理。复合因素处理见表４―２。处理Ｃｄｚｎ ｃＩｌ Ｐｂ１２３ ７．５１５０ ３２５ １５０４５ ７５ １５０ ３２５６５０６ ７．５ ６５０７８４２５ １５０９１０１１ ４２－５ １５０１２ ４２’５１３ Ｏ１４１５ ２５１６７．５ １５０ ７５ １５０７。５ １５０ ７５６５０７．５ ６５０７５ １５０７。５６５０４２５ ６５０ ７５１５０４２５１５０ ３２５２５ Ｏ２５６５０ ３２５６５０４００４∞４∞０ ４００３２５１５０７５６５０７５１５０７５６５０３∞３００４００４００３００ Ｏ１５０４．１．４测定方法测定方法同３．１．２。４．１．５统计分析方法所列数据为３次重复的测定值，数据采用ＳＰＳＳｌ２．０统计软件进行分析。４．２结果与分析４．２．１恒温培养试验下重金属污染对土壤酶活性的影响４．２．１．１单一重金属污染下土壤酶活性的变化４．２．１．１．１镉污染下土壤酶活性的变化表４．３．镉污染下土壤酶活性 酸性磷酸酶ｍｇ／ｌ【ｇ １１．８２±０．８９ａ ｌＯ．７４±Ｏ．５３ａ ８．６３±Ｏ．３９ａｂ ６．５２±Ｏ．３５ｂ ４．１２±Ｏ．２ｌｃ＿Ｃｄ水平蔗糖酶 ｍ∥ｋｇ＿＿一－－＿＿ｌ－－＿－＿－＿＿＿－－＿●Ｉ－●＿－－－－＿＿＿＿●ｌ＿＿ｌ＿－－●－●－＿＿ｌｌ－ｌ＿－Ｉ－＿ 过氧化氢酶 脱氢酶脲酶 ｍｇ／ｌ【ｇ０．２７±０．０３ａ Ｏ．２７±ｏ．Ｏｌａ Ｏ．２８±Ｏ．０２ａ ０．２６±Ｏ．０ｌａｂ Ｏ．１８±Ｏ．Ｏｌｂ ｎｌｌ，ｋｇ １．２４±０．０７ａ １．１７±ｏ．０７ａｂ １．０１±Ｏ．０５ｂ ｍ∥Ｋｇ ０．１４±０．０２ａ Ｏ．１３±Ｏ．０３ａ ０．１３±０．０ｌａＯ ５ １００．９０±Ｏ．０４ａ Ｏ．９０±Ｏ．０２ａ Ｏ．９１±Ｏ．０３ａ ０．８７±０．０２ａｂ Ｏ．４３±Ｏ．０ｌｂ２０５０Ｏ．嬲±Ｏ．０５ｃＯ．５５±Ｏ．０２ｄＯ．鸺±０．０４ｂＯ．０３±Ｏ?０１ｃ●＿－＿＿＿＿＿－＿ｌｌｌ－＿●－－＿＿－●＿ｌＩ＿Ｉ＿－－＿－ｌ－＿＿－－＿●＿－●＿ｌｌ＿＿＿－ｌ＿Ｉ－ｌ＿－－ｌ＿－一上表为培养３０天时酶活性指标。表中数据为平均值±ｓＤ（ｎ一３）Ｉ ａ．ｂ．ｃ、ｄ表示Ｐ＝０．０５水平上的差：异显著性?由表４．３可以看出，恒温（２５℃）培养３０天后，镉污染使供试土壤几种酶活性发生了一 定程度的变化，土壤酸性磷酸酶、过氧化氢酶、脱氢酶活性均随Ｃｄ浓度的增加而降低，但随Ｃｄ浓度增加呈抛物线变化，即脲酶活性、蔗糖酶活性分别在Ｃｄ ５和１０ｍ班ｇ下达到最大西南大学硕士学位论文 值，然后下降。与对照相比，当土壤中Ｃｄ为５０ ｍｇ／ｌ【ｇ水平时，各种酶活性均受到明显抑制，到达最低值，蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶、过氧化氢酶和脱氢酶抑制率分别达到５２％、３３％、６５％、５６％和７９％。 ４．２．１．１．２锌污染下土壤酶活性的变化表４－４．锌污染下土壤酶活性上表为培养３０天对酶活性指标，表中数据为平均值：ｓＤ（ｎ＝３）：。?ｂ，ｃ、ｄ表示ｐ＝０．∞水平上的差异显著性．恒温（２５℃）培养３０天后，锌污染使供试土壤几种酶活性都有一定程度的下降趋势（表４４）。但在ｚｎ≤２００ ｍｇ／ｌ【ｇ水平时５种酶活性的下降趋势并不明显，随着供试土壤中锌离子 浓度的增加，当ｚｎ≥４００ ｎｌｌ啦ｇ时，土壤蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶、氧化氢酶和脱氢酶呈显著下降趋势。当ｚｎ浓度为８００哦水平时，蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶、过氧化氢酶和脱氢酶活性到达最低值，下降幅度分别达到了５４％、４４％、６５％、３８％和“％。４．２．１．１．３铜污染下±壤酶活性的变化表４．５．铜污染下±壤酶活性上表为培养３０天时酶活性指标．表中数据为平均值±ｓＤ（ｎ＝３）；“ｂ，ｃ、ｄ表示Ｐ宰ｏ．０５水平上的差异显著性．由表４－５可见，恒温（２５℃）培养３０天后．铜污染对土壤酶活性的影响趋势与ｚｎ相类似。铜污染下，供试土壤几种酶活性呈现不同程度的下降，但在Ｃｕ≤２００ ｍ班ｇ水平时５种酶活性的下降趋势并不明显。随着供试土壤中铜离子浓度的增加，蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶、 过氧化氢酶和脱氢酶都呈明显下降趋势。当达到Ｃｕ浓度为４００ｍ眺ｇ水平时，蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶、过氧化氢酶和脱氢酶活性到达最低值，分别较对照下降了５２％、３０％、６３％、 ４０％和７１％。第４章恒温培养试验下节令属污染ｆ：壤的生物放心研究４．２．１．１．４铅污染下土壤酶活性的变化表４．６名台污染下土壤酶活性上震为培养３０天时酶活性指标．表中数据为平均值±ｓＤ（ｎ＝３）；ａ，ｂ，ｃ、ｄ表示ｐ卸．０５水平上的差异显著性。由表４―６可以看出，恒温（２５℃）培养３０天后，除了酸性磷酸酶活性随Ｐｂ污染浓度增加而 下降外，其余几种土壤酶均随Ｐｂ浓度增加而呈抛物线变化。当Ｐｂ≥４００ ｍｇ?ｋｇｄ水平时，供试 几种士壤酶活性都显著下降。以Ｐｂ浓度为８００ ｍｇ／ｌ（ｇ时的土壤酶活性最低，与对照相比，蔗 糖酶、脲酶、酸性磷酸酶、过氧化氢酶和脱氢酶分别下降６０％、４８％、５３％、４９％和７１％。４．２．１．２复合重金属污染下土壤酶活性的变化表４．７．复合重金属污染下土壤酶活性表为培养３０大时酶ｉ一‘性指标，袤ｆｆｌ数据为平均值±ｓＤ（Ⅱ＝３）；ａ，ｂ，ｃ、ｄ表．，Ｊｉｐ＝Ｏ．０５水、Ｉｊ Ｉ．的差异显著性。Ｐｑ雨人’７：坝ｆｊ’亨：化论文由表４．７可见，重金属Ｃｕ、ｚｎ、Ｐｂ、Ｃｄ复合污染条件卜．，与其对照相比，除了处理４ 的土壤脲酶活性外，其余几种酶活性都显著降低。显示，复合污染对土壤酶活性的影响明显 人于单一重金属污染。随着ｃｄ浓度的升高，蔗糖酶活性显著下降，而Ｃｕ、ｚｎ、Ｐｂ虽然对蔗 糖酶活性产生一定的抑制作用，但随着重金属浓度的增加，其下降趋势并没有显著变化。复 合污染对过氧化氢酶活性的影响与蔗糖酶相似，也是Ｃｄ的抑制作用最为显著，而Ｃｕ、Ｚｎ、 Ｐｂ对过氧化氢酶活性的抑制作用并不显著，但是当Ｐｂ浓度增人的时候，过氧化氢酶活性并没 有明显变化，与Ｃｕ、ｚｎ、Ｃｄ之间表现出一定的拮抗作用。 在Ｃｕ、ｚｎ、Ｐｂ、Ｃｄ复合污染条件下，随Ｃｕ、Ｐｂ、Ｃｄ浓度的增加，土壤脲酶活性显著 降低，其中可以看出Ｃｄ的抑制作用最为显著，而随着Ｚｎ浓度的增加，其脲酶活性变化则不 明显，甚至还出现了轻微的升高，表现出一定的刺激作用，表明Ｃｕ、Ｚｎ、Ｐｂ、Ｃｄ元素共存 的情况下，Ｃｕ、Ｐｂ、Ｃｄ之间对脲酶活性表现出一定的协同效应，而ｚｎ与Ｃｕ、Ｐｂ、Ｃｄ之间 对脲酶活性表现出拮抗作用。复合污染对脱氢酶的影响与脲酶相似，也是Ｃｄ的抑制作用最为 显著，其次为Ｃｕ，而ｚｎ和Ｐｂ的抑制作用并不显著。 在Ｃｕ、ｚＩｌ、Ｐｂ、ｃｄ复合污染条件下，随着Ｃｕ、Ｐｂ、ｃｄ复合浓度的增加，土壤酸性磷 酸酶活性显著下降，其中可以看出Ｃｄ的抑制作用最为显著，Ｐｂ次之，而随着ｚｎ浓度的增加， 其酸性磷酸酶的变化不明显，与Ｃｕ、Ｐｂ、Ｃｄ之间表现出一定的拮抗作用。４．２．１．３培养时间对重金属污染下土壤酶活性变化的影响重金属污染下土壤酶活性随培养时间也有一定的变化，本试验选取重金属Ｃｄ、ｚｎ、Ｃｕ、 Ｐｂ浓度分别为５０ ｍｇ／ｌ（昏８００ ｍｇ瓜ｇ、４００ ｍｇ／１（ｇ、８００ ｍｇ／ｌ（ｇ水平下进行分析。―◆一Ｃｄ―●ｌ―Ｚｎ―★一Ｃｕ―■一Ｐｂ ―◆一Ｃｄ―●一Ｚｎ―■一Ｃｕ――一Ｐｂ０．２５ Ｏ．２ Ｏ．１５ Ｏ．１ Ｏ．０５Ｊ０ ２０ ３０＼∞冀婶 艇 一ｂｏ昌１０２０３０图４―１蔗糖酶活性变化时闯（天）图４―２骡酶活性变化时间（灭）由图４―１可以看出，蔗糖酶活性随着培养时间的增长逐渐下降，在培养２０天的时候，重 金属对蔗糖酶的抑制率达到最大值，随后蔗糖酶活性缓慢的升高，并逐渐趋丁．平稳。由图４．２ ⅡＴ以看出，脲酶活性随着培养时间的增Ｋ逐渐卜降，在培养２０大的时候，重金属ｚｎ和Ｐｂ２４第４章恒温培养试验下覃会属污染－卜壤的生物效麻研究对脲酶的抑制率达到最人值，随后蔗糖酶活性缓慢的升高，并逐渐趋于平稳，而Ｃｄ和Ｃｕ污 染下的脲酶活性持续下降，在培养３０天时重金属的抑制率达到最大值。＋ｃｄ＋ｚｎ．十ｃｕ十Ｐｂ之ｏ?一Ｏ．―ｃｄ―ｚ“＋ｃ“＋Ｐｂ墓ｏ． 蓬ｏ．：ｏ．目Ｏ． １０ ２０ ３０３０图４―３过氧化氢酶活性变化时间（天）图４―４脱氢酶活性变化时间（天）６?凹―◆一Ｃｄ―－一Ｚｎ―★一Ｃｕ―■一Ｐｂ：５．鑫乏４．目３． ｌＯ ２０ ３０图４―５酸性磷酸酶活性变化时间（天）４种重金属污染对过氧化氢酶活性的抑制率都是在培养２０天的时候达到最大值，随着培 养时间的增氏，５种酶的活性有轻微的升高，最后趋于平稳（图４―３）。由图４－４可见，４种重 金属污染对脱氢酶活性的抑制率都是在培养２０天时达到最大值，随着时间的增长，Ｃｕ和Ｚｎ 污染下的脱氢酶活性有所升高，并趋于稳定。由图４―５可以看出，４种重金属污染对酸性磷酸 酶活性的抑制率都是在培养２０天时达到最大值，随后随着培养时问的增长５种酶活性都有小 幅度的升高。４．２．２模拟试验下重金属污染对土壤微生物活性的影响４．２．２．１单一重金属污染下土壤微生物活性的变化４．２－２．１．１土壤微生物活体数量的变化两南人学硕ｆ。学位论文２?５ ２冀１．５ 羹－ Ｏ．５ ０∞一｜囱０ ５ １０ ２０回圈ｆ弱 翘 蜮翰＋豳Ｏ ５ １０ ２０ ５０５０图４―６细荫数量变化ｃｄ浓度（ｍｇ／ｋｇ）图４―７真菌数量变化Ｃｄ浓度（ｍｇ／ｋｇ）由图４．６、４．７、４．８可以看出，随Ｃｄ浓度增加土壤中的细菌、放线菌和真菌数量先增加， 在ｃｄ浓度为１０ ｍｇ?ｋｇｄ水平时达到最大值，然后逐渐下降。在Ｃｄ５０ｍｇ?ｋｇｄ水平时，到达最低，与对照相比，恒温（２５℃）培养试验中土壤细菌、放线菌和真菌数量分别下降５５．５％、４７．５％ 和１５．２％。 可以看出，细菌下降幅度最大，放线菌次之，而真菌下降幅度最小。ｌ２２?５ｌ ０ ８ Ｏ ６栅赫楹帮疆Ｏ ４ ０ ２ＯＯ图４―８放线菌数量变化Ｉ腓一 窿蒜５２冀１．５鋈? ０?５ ０豳“０ １００? ２００ ４００ ８００ｌＯｎｏｃｄ浓度（图４―９细菌数量变化ｚｎ浓度（ｍｇ／ｋｇ）删 鼎｛匿憾寓。２００圈嘲赫ｊ圈螂 辎鳓一ｈ０ １００ ２００ ４００ ８００ｚｎ浓度（＿ｇ／ｋｇ）图４一１１放线菌数量变化Ｚｎ浓度（ｍｇ／ｋｇ）由图４―９、４．１０、４―１ｌ可见，随着Ｚｎ浓度的增加，土壤放线菌数量早卜－降趋势，而十壤 中的细菌和真菌数茸先增加，当Ｚｎ浓度增加到２００ｍｇ?ｋｇ。１水平时，十壤中的细凶和真菌数’造 到达最人值，然后下降。以ｔ壤Ｚｎ浓度０～２００ ｍｇ?ｋｇ‘１范同时，士壤中细菌、放线菌、真菌变２６第４章恒温培养试验Ｆ审令强污染十壤的乍物设膨研究化进程比较缓慢，当Ｚｎ≥４００ ｍｇ?ｋ９１水平时，下降才比较显著。以Ｚｎ浓度为８００ ｍｇ?ｋｇ?时， 十壤中的细菌、放线菌和真菌数量到达最低值，与对照相比，恒温（２５℃）培养试验中土壤细菌、 放线菌和真菌数量分别下降５６．９％、５２．８％、１７．８％。比较三种土壤微生物，以细菌卜．降幅度’ ‘最大，放线菌次之，真菌最小。２．５ ２翼．ｓ 簧?Ｏ．５Ｏ¨ｔ霭ｌ衄｜籁 翘 冰ｌ＿冀ｏ．糨０．甄０．ｌ旧．Ｉ霪１塑．０咖０彝：随器１００２００３００４０００ｌＯＯ２００４００８００图４―１４放线菌数量交化Ｃｕ浓度（ｍｇ／ｋｇ）图４一１５细菌数量变化Ｐｂ浓度（ｍｇ／ｋｇ）由图４．１２、４．１３、４．１４可以看出，Ｃｕ对土壤微生物的影响与ｚｎ相类似。随着重金属Ｃｕ 浓度的提高，土壤放线菌数量是下降趋势，而十壤中的细菌和真菌数量先增加，当ｃｕ浓度为２００ｍｇ?ｋｇ‘１时，土壤细菌和真菌数}