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心血管内靶向定基因递送体系——载基因支架的实验研究.pdf 109页
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心血管内靶向定基因递送体系——载基因支架的实验研究
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--------------------------Page1------------------------------中国协和医科大学博士学位论文中文摘要Tf眦sl啪inal经皮腔内冠状动脉成形术(Pemlt鲫eouscoronary动脉硬化性心脏病的主要治疗手段，但PTcA术后血管再狭窄的发生率高达15—60％，迄今仍是临床亟待解决的难题。转基因技术的飞速发展为血管再狭窄的基因抬疗奠定了基础。心血管内基因治疗的成功必须依靠有效的治疗基因，安全的载体和可以把基因(和载体)递送到血管内靶部位的递送体系。心血管内基因治疗的特殊性在于很难把基因专一性递送到血管组织而不进入血液循环系统。以往的研究大多数采用球囊导管向血管内灌注基因(和载体)，研究表明，灌注到血管内的载体大部分随血流进入全身循环系统，到达病灶局部的基因很少，达不到治疗效果。血管内支架携带基因有其独特的优势，可以在植入支架的同时将基因递送到心血管内的病灶部位，借助支架与血管壁的紧密接触，使基因被局部血管组织吸收，随着基因的缓慢释放，达到长期的基因转染和表达。基因载体分为病毒载体和非病毒载体。病毒载体转染效率高，但安全性方面存在潜在的危险性。非病毒载体安全性好，易于制各，近年来倍受关注。阳离子脂质体和壳聚糖是目前研究最广泛的非病毒载体，显示出了一定的优越性。本课题针对心血管基因治疗的主要技术难题，采用血管支架为基因递送平台，将抗DNA抗体一质粒DNA一阳离子脂质体三元复合纳米基因载体和壳聚糖基因纳米粒两种非病毒载体结合在支架上，并通过体内外试验验证这～新型血管内基因递进体系的有效性和可行性。本文第一章对PTcA术后再狭窄的发病机理及治疗现状进行了综述。本文具体研究内容如下：1．制备了新型抗DNA抗体一质粒DNA一阳离子脂质体三元复合纳米基因载体(DAc)，筛选出了最佳配方，并初步进行了细胞摄取及细胞基因转染实验。结果发现，抗DNA抗体一质粒D1qA一阳离子脂质体可以自组装为360IlIll左右的球形粒子，与传统的质粒DNA一阳离子脂质体二元基聚焦显微观察发现抗DNA抗体可促进质粒DNA进入细胞核。使用胶原对金属支架表面进行涂层，通过化学和免疫双重偶联的方法将上述DAc载体固定化在支架表面。使用放射性同位素分别标记抗DNA抗体和质牲DNA来测定支架结合量及释放曲线。用细胞培养及动物体内植入实验验证了这一新型基因递送体系的转基因效果。结果显示，支架表面通过化学交联的胶原涂层具有很好的均一性--------------------------Page2------------------------------中国协和医科大学博士学位论文和结合稳定性。在胶原表面通过化学偶联方法结合抗DNA抗体的量明显高于物理吸附组(0．049±0．0047瞻vs合质粒DNA的量是物理吸附组的两倍(0．73±0．02№vs放达13天以上。该新型基因支架递送体系在细胞转染实验中显示出高效和局部基因转染的特征，兔颈动脉植入实验发现血管壁总细胞转染率大约2．8％，其中新生内膜转染率最高，约7％；中膜次之，约为3％；血管外膜几乎未有转染。携带治疗基因iNOs的支架植入猪冠状动脉的实验正在进行中。(第二章)2．制备了十二烷基化壳聚糖一pEGFp—c1基因纳米粒并进行表征。将纳米粒涂布于金属支架表面，制备了携带十二烷基化壳聚糖基因纳米粒的支架并进行电镜观察。将携带壳聚糖基因纳米粒的支架进行细胞转染和兔颈动脉体内转染实验，结果显示，十二烷基化壳聚糖一pBGFP—c1纳米粒为片状分布于支架表面。细胞转染实验使用携带十二烷基化壳聚糖一pEGFP—c1基因纳米粒的支架，显示出局部转染特征。动物实验使用携带十二烷基化壳聚糖．pGL3质粒基因纳米粒(表达萤光素酶的质粒)的支架，回收支架上黏附的血管组织标本匀浆后，测定有高剂量萤光素酶表达，而对照组动脉及组织萤光素酶测定均为阴性，同实验组支架植入处动脉萤光素酶活性比较有显著统计学差异(p&0．01)，两只动物肝脏标本发现微量萤光素酶表达。使用十二烷基化壳聚糖基因(偶联pEGFP—c1质粒)支架，荧光显微镜及免疫组织化学检查证明新生内膜转染率高达12．3％，中膜外膜未见阳性表达。(第三章)综上所述，以支架为基础的非病毒载体基因递送体系是一种新型有效的血管内基因递送体系。通过化学与免疫双重偶联的方法，可有效的将质粒DNA结合在支架表面，在达到治疗目的同时不出现基因的远处播散，是一种有前途的基因递送体系，可能对诸如血管再狭窄等心血管疾病的基因治疗产生深远的影响。十二烷基化壳聚糖基因支架向血管内转基因有效、可行，同其它心血管基因递送体系比较，本体系具有易于制备、使用方法简单、便于保存以及具有良好的组织和血液相容性、较小的免疫原性和轻微的炎症反应等优点。因此，十二烷基化壳聚
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是最新出现的一种由gRNA介导Cas9核酸酶特异靶向到靶位点，从而对目的基因进行编辑的技术。
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HIV/艾滋病基因治疗进展(三):基于基因编辑技术的基因疗法收藏
HIV/艾滋病基因治疗进展(三):基于基因编辑技术的基因疗法原创
GT客来源：微信公众号 基因治疗领域目前，基于基因编辑技术（如锌指核酸内切酶（ZFN）、类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）和CRISPR/Cas9等）的HIV/艾滋病基因治疗已进行了大量临床前和临床试验，利用此技术对病毒感染和复制相关基因进行改造或干预，希望能够减缓疾病进程，最终实现HIV/AIDS的功能性治愈或彻底治愈。初期的研究结果从侧面表明基因编辑技术用于HIV/艾滋病治疗的巨大潜力。例如：2009年报道的一位患者通过骨髓移植，成功治愈艾滋病。由于骨髓捐献者的CCR5基因编码区域发生突变，使CCR5作为HIV辅助受体的能力受损，最终导致CCR5基因突变的细胞具HIV感染抗性。但由于骨髓配型成功率低，再加上有CCR5相应突变的人很少，因此，上述治疗方案只能用于极个别的幸运患者。但是，此案例使研究人员更加相信通过基因编辑技术改造与HIV感染或复制相关基因（如CCR5、CXCR4、LEDGF等）可以治疗艾滋病。尽管目前存在诸多技术难题，安全性及有效性有待进一步验证，但其临床应用潜力巨大。 1. CCR5基因首个人工改造的CCR5是经ZFN基因编辑技术实现的，在人多能干细胞（hiPSCs）及人胚胎干细胞（hESCs）中表明了此技术治疗艾滋病的可能性。人源化小鼠体内实验表明：经基因编辑技术敲除CCR5基因的造血干/祖细胞（HSPCs）回输后，小鼠可以抵抗HIV感染。另外，一例Ⅰ期临床试验表明：ZFN介导的CCR5编辑技术安全有效，此研究中12位持续HIV病毒血症患者接受了单次剂量的经ZFN改造的自体CD4+ T 细胞，大多数患者血液HIV DNA与 RNA水平降低，其中一位患者的血液RNA水平降至检测限以下。此外，患者的免疫功能也获得重建，CD4+ T细胞数量明显升高。当然，还有一些基于ZFN技术编辑CCR5的艾滋病治疗方案处于或将要进行临床Ⅰ期试验。此外，基于TALEN 或 CRISPR/Cas9的CCR5基因编辑研究也取得了一定进展。 2. CXCR4基因基因编辑技术对CCR5基因的改造达到了良好的HIV/艾滋病治疗效果，启发了科学家利用基因编辑技术对CXCR4基因进行改造。CXCR4是HIV感染细胞的另外一种辅助受体。尽管进行了体外细胞实验及部分动物实验，疗效明显。但是考虑到CXCR4广泛分布在多种细胞表面，参与多种重要的生理功能，因此，基于CXCR4基因突变与敲除的艾滋病临床治疗试验需慎之又慎，必须进行足够大量的临床前评估。或许，未来研究人员能够找到一种更为安全的策略，在不影响正常生理功能的条件下，突变或敲除CXCR4基因来抗HIV感染。 3. HIV前病毒基因编辑技术清除HIV前病毒是另一种基于基因编辑技术的HIV/艾滋病治疗的新策略。抗病毒鸡尾酒疗法（即高效抗逆转录病毒治疗，HAART）虽能够有效控制HIV的复制，但是难以对付潜伏在细胞内的前病毒。一旦停止鸡尾酒疗法，潜伏的前病毒活化后产生大量游离病毒，因此，艾滋病患者必须终身服药。清除患者体内的潜伏前病毒是HIV/艾滋病领域最棘手的问题。近些年，基因编辑技术的发展让人们看到了解决这一难题的曙光。前期研究表明CRISPR/Cas9技术在体外细胞实验上能够将潜伏在细胞内的HIV前病毒清除，并证明此技术对细胞无毒副作用且无脱靶效应，能精确的切割HIV-1前病毒的5′到3′LTR 9709 bp前病毒基因组。这一研究提供了清除患者体内潜伏HIV-1前病毒的新策略。然而，最大的挑战在于如何向体内感染的组织或细胞中导入CRISPR/Cas9系统。近几年备受关注的腺相关病毒（AAV）基因传递系统获得了极大的发展，以其低毒性与导入基因的持续表达时间长等特性而广泛应用于癌症、心脏病、神性系统疾病、关节炎、肌营养不良症和囊性纤维化等疾病。近期，研究人员利用AAV基因载体将saCas9/gRNA运送到有HIV-1前病毒整合的转基因小鼠与大鼠中，两周后，研究人员提取了试验动物不同器官组织中的DNA，分析结果显示实验动物各组织的HIV-1前病毒都被从其基因组中切除了。此研究成果具有重大的临床意义，在未来几年进一步优化此技术的基础上可能会开展部分临床试验。此外，基于CRISPR/Cas9的技术，通过失活其核酸酶活性和设计靶向相应基因启动子的特异sgRNA基因，可以激活相应基因的特异性表达。近期，复旦大学Ji等人研究表明：基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建的dCas9-SunTag-VP64，即将核酸酶活性部分替换为特异性的转录激活因子，可以在不活化T细胞及无细胞毒性的情况下，激活潜伏病毒的转录。此策略也许是活化潜伏HIV的有效手段，与非基因方法相比，基因治疗的优势与不足以及如何有效的将此基因药物导入病毒潜伏库所在的细胞组织是有待解决的问题。另外，基于其它基因编辑技术（如：ZFN）切除HIV前病毒的研究也获得了一定的进展。 4. 其它靶点基因除了基因编辑技术针对的上述治疗靶点外，还有很多其它的治疗靶标也处于试验研究中。如： HIV整合辅助因子LEDGF，宿主限制因子APOBEC3G, TRIM5a，抑制HIV env 表达的TSPO等。其整体策略是：对于利于HIV感染和复制的基因进行突变或敲除，抑制其活性或表达；对于抗HIV基因进行激活或进一步活化，促进其表达。（欢迎分享本文，转载请保留出处：微信公众号基因治疗领域）
看了都是理论为主，何时才能应用临床，啥时候看到治愈曙光？？
前途大好，一片光明
希望能尽快成功治愈！！好好活着！
伟大的科学家。快点研究治愈的药，救救我吧我真的不想死。因为我很爱妈妈
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