上传用户：iytfkcbkoy资料价格：5财富值&&『』文档下载 ：『』&&『』学位专业：&关 键 词 ：&&&&&权力声明：若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请点击。摘要:（摘要内容经过系统自动伪原创处理以避免复制，下载原文正常，内容请直接查看目录。）本研讨应用嗜热表达载体pSeSD在冰岛硫化叶菌(Sulfolobus islandicus)中同源表达了RNA聚合酶亚基RpoL，采取Ni柱共纯化和凝胶过滤层析纯化到了多个卵白质组分，经由过程质谱验证为RNA聚合酶复合体。同时本研讨经由过程应用2M/4M/6MUrea和1M/2M/3MNaCl处置纯化到的RNAP复合体，初步研讨了RNA聚合酶亚基间的互相感化关系。成果注解RpoL与RpoB“， RpoA’和RpoA”之间的互相感化较其它亚基更强。依据该成果可推想在硫化叶菌中RNA聚合酶亚基的组装进程能够有别于真核生物，起首构成L一B“一A’一A”平台，其他亚基再联合该平台构成完全的RNA聚合酶复合体。别的，我们还在年夜肠杆菌中表达了硫化叶菌通用转录因子TBP和TFB1。本文在EMSA实验中应用上述纯化的RNA聚合酶和TBP、TFB1研讨了硫化叶菌转录机械与araS根本启动子和杂合启动子(T6BRE)的互相感化，成果注解转录机械与杂合启动子(T6BRE)联合较强，与araS启动子有微弱联合。该成果在体外试验中证明了araS根本启动子不克不及启动转录的缘由是由弱BRE形成的。本研讨还在硫化叶菌表达载体pSeSD的基本上，构建了串连纯化标签表达载体pSeSH和双宿主表达载体pT7SH。串连纯化标签表达载体pSeSH可以或许有助于进步共纯化卵白的特异性，双宿主表达载体pT7SH能在年夜肠杆菌和硫化叶菌平分别应用T7启动子和araS启动子掌握目标卵白表达。本研讨还应用申报基因体系剖析了单链联合卵白基因(ssb)的启动子，研讨成果注解，虽然BRE位点存在缺点，ssb根本启动子依然具有很高活性。是以我们推想能够存在一个下流激活元件加强ssb启动子活性。最初，本研讨应用微生物卵白跨细胞膜转运的道理，在极端嗜热硫化叶菌中构建卵白跨膜转运系统。我们将硫化叶菌胞外卵白a一Amylase作为运载卵白，将其基因克隆到硫化叶菌表达载体pSeSD上，构建成跨膜转运载体，并以lacS为申报基因，验证了该卵白跨膜转运系统的可行性。综上所述，本研讨为进一步剖析硫化叶菌RNA聚合酶亚基组装形式、ssb启动子下流激活元件和共纯化法判定硫化叶菌卵白质互相感化打下了坚实的基本。Abstract:Research and application of the thermophilic expression vector pSeSD in Iceland Sulfolobus strains (Sulfolobus islandicus) homologous expression of the RNA polymerase subunit rpol strongly bond, take Ni column co purification and gel filtration chromatography purified multiple protein components, through verified by mass spectrometry for RNA polymerase complex. At the same time, this study through the process of 2M/4M/6MUrea and 1M/2M/3MNaCl treatment of the RNAP complex, the preliminary study of the interaction between RNA polymerase. Results notes RpoL and RpoB &, RpoA& and RpoA interaction is stronger than other subunits. According to the results can be reasoned in Sulfolobus RNA polymerase subunit assembly process can have different from eukaryotes, first and foremost a l a B &a& a &platform, the other subunit combined the platform constitutes a complete RNA polymerase complex. In addition, we also expressed the general transcription factor TBP and TFB1 of the common gene in the intestinal bacilli. In this paper, we used the purified RNA polymerase and TBP, TFB1 to study the interaction between the transcription machinery and araS promoter and hybrid promoter (T6BRE) in the EMSA, the results of the transcription machinery and the hybrid promoter (T6BRE) is stronger, and the araS promoter has a weak association. The results in vitro experiment proved that the araS promoter could not start the transcription of the reason is the formation of weak BRE. This study also Sulfolobus expression vector pSeSD basically constructed series purification tag expression vector affinity and a dual homed expression vector pT7SH. Tandem purification tag expression vector affinity can may help to improve co purified protein specificity and dual host expression vector pT7SH in coliform organisms and sulfide Ye Junping were applied T7 startup and ARAS promoter for grasping the target protein expression. This study application of the reporting system of gene analysis and single strand protein gene (SSB) promoter, research notes, although the shortcomings of Bre sites, SSB fundamental to start son still has very high activity. So we suppose there can be a low activation element strengthen the activity of SSB promoter. Initially, the research and application of microbial protein cross cell membrane transport of truth, in halophilic heat Sulfolobus construct protein transmembrane transport system. We will Sulfolobus extracellular protein A - amylase as a carrier protein, the gene was cloned into Sulfolobus expression vector pSeSD, construct a transmembrane transporter, and to lacS for the declaration of the gene to verify the the protein cross membrane transport system feasibility. To sum up, the study for further analysis of Sulfolobus RNA polymerase subunits assemble to form, SSB start sub dirty activation element and co purification method determine the Sulfolobus proteins affects mutually to lay a solid foundation.目录:摘要6-7Abstract7-8缩略语表9-111 前言11-24&&&&1.1 古菌11-13&&&&1.2 硫化叶菌13-15&&&&1.3 古菌启动子的主要元件15&&&&1.4 古菌RNA聚合酶15-17&&&&1.5 古菌通用转录因子17-20&&&&1.6 古菌遗传操作体系20-22&&&&1.7 蛋白跨膜转运与蛋白质耐热性改造22&&&&1.8 研究目的及内容22-242 材料与方法24-39&&&&2.1 实验材料24-28&&&&&&&&2.1.1 菌株和质粒24&&&&&&&&2.1.2 培养基成分及培养条件24-27&&&&&&&&2.1.3 主要分子生物学试剂和由公司完成的实验27&&&&&&&&2.1.4 主要仪器27-28&&&&2.2 实验方法及原理28-39&&&&&&&&2.2.1 大肠杆菌DH5a感受态制备和热激转化法28&&&&&&&&2.2.2 硫化叶菌感受态的制备和电击转化法28-30&&&&&&&&2.2.3 提取硫化叶菌总DNA30&&&&&&&&2.2.4 硫化叶菌RNAP和GTFs表达载体的构建30-32&&&&&&&&2.2.5 RNAP和GTFs的表达与纯化32-33&&&&&&&&2.2.6 包涵体蛋白的复性纯化33&&&&&&&&2.2.7 SDS-PAGE和Western Blot33-34&&&&&&&&2.2.8 电泳迁移率变动实验(EMSAs)34-35&&&&&&&&2.2.9 双宿主表达载体pT7SH的构建35-36&&&&&&&&2.2.10 硫化叶菌ssb基因启动子缺失突变报告质粒的构建36-37&&&&&&&&2.2.11 β-Galactosidase(LacS)酶活分析37-38&&&&&&&&2.2.12 MALDI-TOF鉴定38&&&&&&&&2.2.13 跨膜转运表达载体和报告质粒的构建38-393 结果与分析39-60&&&&3.1 古菌RNA聚合酶组装及T6BRE/araS启动子元件分析39-51&&&&&&&&3.1.1 基本转录因子(GTFs)的表达纯化39-44&&&&&&&&&&&&3.1.1.1 TBP的表达纯化39-43&&&&&&&&&&&&3.1.1.2 TFB1的表达纯化43-44&&&&&&&&3.1.2 RNA聚合酶亚基同源表达及互作分析44-49&&&&&&&&&&&&3.1.2.1 RNAP复合体纯化44-48&&&&&&&&&&&&3.1.2.2 RNA聚合酶亚基间相互作用的分析48-49&&&&&&&&3.1.3 GTFs和RNAP与硫化叶菌启动子序列互作分析49-51&&&&3.2 嗜热古菌表达载体的改进及ssb基因启动子的分析51-56&&&&&&&&3.2.1 串联纯化标签表达载体的改进及应用51-53&&&&&&&&3.2.2 双宿主表达载体的构建53-54&&&&&&&&3.2.3 ssb启动子突变株的电转化及菌株酶活测定54-56&&&&3.3 利用嗜热古菌表达系统改造酶的耐热特性56-60&&&&&&&&3.3.1 跨膜转运表达载体的构建56&&&&&&&&3.3.2 lacS基因为报告基因验证该系统的可行性56-604 讨论60-64&&&&4.1 古菌RNA聚合酶组装及T6BRE/araS启动子元件分析60-61&&&&4.2 嗜热古菌表达载体的改进及ssb基因启动子的分析61-63&&&&4.3 利用嗜热古菌表达系统改造酶的耐热特性63-64参考文献64-69附录69-71致谢71分享到：相关文献|RNA聚合酶Ⅲ和Ⅰ在CHO细胞核中转录位点及其相互关系研究.pdf -max上传文档投稿赚钱-文档C2C交易模式-100%分成比例文档分享网
RNA聚合酶Ⅲ和Ⅰ在CHO细胞核中转录位点及其相互关系研究.pdf
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文档介绍：首都师范大学硕士学位论文RNA聚合酶Ⅲ和Ⅰ在CHO细胞核中转录位点及其相互关系的研究姓名：李宁申请学位级别：硕士专业：遗传学指导教师：张飞雄RNA聚合酶IIl和I在CHO细胞核中转录位点及其相互关系的研究摘要真核生物细胞核中具有三种不同的RNA聚合酶，分别是RNA聚合酶I、RNAtRNA、多数的snRNA以及某些病毒基因如VA基因的转录。从上个世纪六十年代开始人们就通过放射自显影、免疫标记结合细胞化学染色的方法对这三种RNA聚合酶在细胞核中的转录位点进行了研究。研究结果显录发生在核质中。由于RNA聚合酶IⅡ转录位点的研究存在特殊性，而传统的研究方法又存在一定的局限性，因此近几年人们对RNA聚合酶ⅡI的转录发生在核质中这一结论提出了质疑，但至今尚缺乏直接的实验证据。本研究以中国仓鼠卵巢细胞株CLIO为材料，利用基因转染、荧光原位杂交结合激光共聚焦显微镜观察，对RNA聚合酶III的转录位点和转录子分布进行了研究。结果表明RNA聚合酶IH的转录位点发生在核仁及其周边区域。同时，应用这一研究方法对RNA聚合酶I的转录发生在核仁中的结论进行了确证，并进而应用双探针标记荧光原位杂交的方法对RNA聚合酶III和RNA聚合酶I转录位点的关系进行了初步探讨，结果显示两者的转录位点之间非常接近，并且有伴随发生的趋势。本实验突破了RNA聚合酶IⅡ转录发生在核质中这一传统观点，同时得出了RNA聚合酶IⅡ和RNA聚合酶I的转录位点非常接近、可能相伴发生这一结论。研究结果对于人们进一步了解RNA聚合酶nI的转录机制、加工和运输过程及RNA聚合酶之间的结构与功能关系等均具有重要的意义。关键词：RNA聚合酶llIRNA聚合酶I转录位点荧光原位杂交CHO细胞核仁RNA聚台酶III和1在CHO细胞核中转录位点及其相互关系的研究ABSTRACTTherearethreeinI，IIandIII．医学百科提醒您不要相信网上药品邮购信息！
目录1 拼音qǐ dòng zǐ2 英文参考promoter启动子是模板上专一地与RNA聚合酶结合并决定从何处起始的部位，也决定的转录效率。生物中有许多启动子，如约有2000个启动子。各启动子的效率可不相同，大肠杆菌的强启动子每2秒钟启动一次转录，而弱启动子每10分钟才启动一次，从百多个大肠杆菌启动子的，得知两个强启动子的序列的中心在转录起始部位（基因链上第一个） 5'侧约10和35个核苷酸处，弱启动子序列中往往有多处核苷酸被。许多都含有这两个重要的启动子区：
的启动子部位与原核生物不同，而且启动转录的活性，除需启动子外，还需某些外加序列。
启动子在中是指一段能使基因进行转录的去氧（DNA）序列。启动子可以被RNA聚合酶辨认，并开始转录。在核糖核酸（RNA）合成中，启动子可以和决定转录的开始的产成，继而开始生产哪一种。
完全的启动子称为规范序列。
3 启动子元件
启动子代表一些重要的元件可以与其他调节区域（如、、边界元件或）合作一致，以主导基因转录的水平。由于启动子一般都是在基因的上游，启动子所在的位置或是转录起始点会由+1开始编号。上游的位置所以都是由+1逆数的负数，例如-100就是位置100的上游对。以下是各种启动子：
核心启动子是引发转录的必要部份及转录起始点，位置约为-35。且是RNA聚合酶的结合及一般转录因子结合位点。 近端启动子是基因的近端序列上游，包括一些基本的调控元件，位置约为-250，且是特定转录因子结合位点。 远处启动子是基因的远处序列上游，包括一些额外的调控元件，影响力较近端启动子弱。它是在上游更远的位置（但不是位置性的增强子或调控区域），是特定转录因子结合位点。
启动子规范序列的用途一般都是有问题的，且可引致对启动子序列的误解。在规范序列中，转录因子结合位点在特定细胞情况下有一个单独的序列会与蛋白质牢固地结合。但是会偏向较低的结合，作为一种调节转录输出。这种最普遍的序列称为野生型序列。这纵然不是最有利的序列，最近证据显示多种基因（包括原）都有G四股结构作为潜在调控信号。
在演化的一个主要问题是修补启动子序列在演化过程中的重要性，例如人类血统从黑猩猩分开后的改变。某些演化生物学家建议启动子的演化或调节区域可能比序列编码更重要。
4 启动子序列
4.1 原核生物启动子
在原核生物中，启动子包含两个短序列位于从转录起结点起计的-10及-35上游位置。位于-10的序列称为普里布诺框或-10元件，及通常包含6个TATAAT。普里布诺框在开始转录是绝对必要的。其他位于-35的序列通常包含6个核苷TTGACA。它的出现可以帮助非常高的转录率。一些启动子含有所谓的“延伸-10元件”（同源序列5'-TGNTATAAT-3'），从这些元件开始，-35元件在转录时显得不重要。上述的启动子结构只有以原核生物RNA聚合酶的σ-70形式来辨认。原核生物RNA聚合酶复合物连同其他σ因子可以辨认不同的核心启动子序列。
以下是核苷出现的：
4.2 真核生物启动子
真核生物启动子是极端的分化及很难表现其特征。它们一般处于基因的上游及有着远离转录起始点的调控元件。转录复合物可以引起去氧核糖核酸（DNA）向自己屈曲，以容许放置调控序列。很多真核生物启动子，但不是全部，都包含一个TATA盒（序列TATAAA）会与TATA结合蛋白结合，以协助形成RNA聚合酶转录复合物。[1]TATA盒一般会处于非常接近转录起始点（通常于50个碱基对以内）。
真核生物启动子调控序列一般与转录因子结合，当中涉及形成转录复合物。一个例子是E盒（序列CACGTG），它会与碱性-螺旋-环-螺旋（bHLH）的转录因子结合。
启动子序列（P）与σ因子RNA聚合酶复合物（R）的结合涉及两个步骤：
6 与启动子功能变异有关的疾病
以下是从人类孟德尔遗传学（OMIM）证实与启动子有关，不论是因启动子序列直接或是转录因子或转录共激发因子的突变。而多种癌症都没有列下是因为从产生嵌合基因：
β 鲁宾斯坦泰比
要留意的是在病原学上大部份的疾病都是异质的，而在层面上一种疾病往往是指多种疾病，纵然它们的病征及治疗一致。疾病对治疗有不同的，是因背后分子源头的差异，这会是的范畴。
Smale , Kadonaga JT (2003). "The RNA polymerase II core promoter". Annu Rev Biochem 72: 449-479. PMID .
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Burchard, E.G.; Silverman, E.K.; Rosenwasser, L.J.; Borish, L.; Yandava, C.; Pillari, A.; Weiss, S.T.; Hasday, J.; Lilly, C.M.; Ford, J.G.; and Drazen, J.M. (1999). "Association between a sequence variant in the IL-4 gene promoter and FEV(1) in asthma". Am J Respir Crit Care Med 160 (3): 919-922 id = PMID .
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