本文转载自“奇点网”。肿瘤药物研发的历史再次被改写！在举世瞩目的「2017年美国临床肿瘤学会年会」（ASCO）上，纪念斯隆-凯特琳癌症中心的David Hyman博士公布了由Loxo Oncology研发的抗癌药物larotrectinib（LOXO-101）的三个早期临床试验（1个I期，1个II期，1个I/II期）数据（1）。国外媒体争相报道，引起了各界的极大关注。David Hyman博士这三个临床研究并不大，一共涉及到55名晚期癌症患者（43例成人，12例儿童）。不过，让人惊喜的地方在于，与以往的新药临床研究不同，这些患者患的不是一种癌症，他们分布在肾癌、膀胱癌、胃癌和肺癌等17种癌症中，但是所有的患者也有个共性，他们都是原肌球蛋白受体激酶（ tropomyosin receptor kinase，TRK）融合基因突变携带者。参与临床试验患者的癌种和所占比例在这55名患者中，有50名患者接受治疗的时间达到了统计分析的要求。其中有38名（76%）患者的病情得到客观缓解，肿瘤缩小了。其中6名（12%）患者病情完全缓解，用现有的手段检测不到肿瘤存在；32名（64%）患者病情部分缓解。在这些患者中，有30名患者的病情缓解时间超过一年。以上的数据使这家只有不到50名员工的小公司一夜爆红。Loxo成为本届ASCO最亮眼的新星。“基因魔剪”专利之争，张峰团队赢了！
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近年来，有“基因魔剪”之称的CRISPR-Cas9（以下简写为CRISPR）基因编辑技术席卷全球，短短几年内迅速应用于世界各地的实验室，催生了多篇文章的发表和多家公司成立。但俗话说，“人红是非多”，这一技术专利究竟“花落谁家”，有关争议一直未曾停歇。
　　据英国《自然》杂志网站报道，美国专利和商标局（USPTO）15日裁定，麻省理工学院（MIT）和哈佛大学博德研究所（Broad Institute）的专利，与加州大学伯克利分校的发现并不“冲突”，博德研究所可以保留其CRISPR的专利权。
　　裁决一出，这场天价专利争夺战目前以博德研究所的胜利结束，不过也激起一些涟漪。
　　CRISPR是在大多数细菌和古细菌中发现的一种天然免疫系统，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA（脱氧核糖核酸）。2012年，加州大学伯克利分校的詹妮弗·杜德娜与法国微生物学家埃马纽埃尔·卡彭蒂耶在《科学》杂志上率先报道称，CRISPR能在试管中精确切割DNA；接下来，科学家需要证明这种充满魔法的编辑工具能否运用到人类细胞的基因组上。2013年2月，博德研究所张峰领导的科研团队在《科学》杂志刊文称，他们将这一方法用在了真核细胞上——包括利用小鼠和人类细胞进行了试验。
　　至此，科学家们开始意识到CRISPR的重要性。2012年5月，伯克利分校向美国专利和商标局提交了与CRISPR相关的专利申请；同年12月12日，博德研究所也提交了有关CRISPR基因编辑技术的专利申请。
　　由于诸多原因，日，博德研究所获得了关于CRISPR的第一个专利授权。专利权限包括在真核细胞或任何有细胞核的物种中使用CRISPR，这意味着博德研究所拥有在老鼠、猪和人身上使用CRISPR的权利。
　　CRISPR系统具有搜索和替换DNA的双重功能，可以通过替换碱基，轻松改变DNA的功能，因此被认为是本世纪最重要的基因工程技术之一。
　　科学家们也已证实，利用CRISPR可以治疗小鼠的肌肉萎缩、罕见肝脏疾病；去年11月，中国科学家首次在人类身上试用CRISPR治疗肺癌；还有一些研究显示，CRISPR技术可用来治疗艾滋病，拯救濒危物种等。
　　鉴于这一技术的意义重大，利润丰厚，双方对其专利权的归属展开了争夺。
　　争夺的核心是，谁应该获得在植物与动物中使用CRISPR的专利权。伯克利分校认为，博德研究所只是杜德娜论文诸多跟进者之一，将CRISPR运用到老鼠和人类细胞上只需要常规技术；但博德研究所的理由是：杜德娜只是预测CRISPR会在人类细胞上有效，并没有指出如何将这一技术应用于老鼠或人体细胞等真核细胞，是他们最先将CRISPR运用到人类细胞中的。
　　2016年起，伯克利分校向美国专利和商标局提请宣判“专利冲突”，但在2月15日的裁决中，法官们断定，在博德研究所之前，没有研究人员能够绝对确认CRISPR能用于真核细胞，博德研究所的发明并非简单扩展。因此他们裁定，博德研究所可以保留其专利。
　　从博德研究所获得专利许可权的生物技术初创企业爱迪塔斯医药公司首席执行官卡特琳·博斯利在声明中说：“这个重要的决定证实了博得研究所研究工作的创造性。”该公司股价在裁决出来后一路飙升。
　　来自英国约克的专利律师凯瑟琳·库姆斯表示：“我认为这个裁决很公正。加州大学伯克利分校发现了CRISPR基因编辑中的关键步骤，但让这一系统在真核细胞中起作用是额外的创造性步骤。”
　　尽管裁决已出，但法律挑战可能仍然存在。加州大学的官员表示，他们将继续自己的专利申请，这项专利将覆盖所有细胞——包括真核细胞和其他细胞，而博德研究所的专利只针对真核细胞。正如杜德娜所说的：“他们（博德研究所）只为绿色网球申请了专利，而我们将为所有网球申请专利。”迄今为止，美国专利和商标局已经授予了50项与CRISPR有关的专利，博德研究所拥有15项。
　　在新闻发布会上，加州大学的律师林恩·帕萨浩说，目前他们还未决定是否就这一裁决上诉。而芝加哥一家律师事务所合伙人凯文·努南则认为，这两个团队最终可能会达成和解。
　　努南也指出，美国专利和商标局的决定让很多想要在真核细胞中使用CRISPR的公司骑虎难下，他们不知道是否需要从双方获得许可，如果真是如此，CRISPR基因编辑技术商业化的成本可能会增加很多。而杜德娜则表示，专利纷争并不会遏制科学研究，因为从事这项技术研发的人越来越多，而且试图将其商业化的公司也很多。
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“CRISPR-Cas9魔剪”失灵了？谷峰：三大操作问题或为脱靶“元凶”
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近日，Nature Methods刊登一篇论文，研究人员通过WGS全基因组测序技术，检测到使用CRISPR技术治疗的小鼠产生上千个意外的基因突变，发生大量基因脱靶现象。
文/张楠近日，Nature Methods刊登一篇，来自哥伦比亚大学、斯坦福大学、艾奥瓦大学的研究人员通过WGS全基因组测序技术，检测到使用CRISPR技术治疗的小鼠产生上千个意外的基因突变，发生大量基因脱靶现象。该爆炸性文章立即引起业界高度关注和热烈讨论，也让备受推崇的CRISPR技术陷入短暂的“滑铁卢”。为此，邀请了国家重点研发计划和国家自然科学基金项目评审专家，国内最早进行基因组编辑研究的科学家之一的谷峰博士作客线上沙龙，独家解读事件始末和真相缘由。基因编辑技术发展历程基因编辑，最早起源于荣获2007年诺贝尔生理医学奖的基因打靶技术。美国犹他大学医学院的马里奥-R-卡佩奇(Mario R.Capecchiand)、英国卡迪夫大学医学院的马丁-J-伊文思(Martin J.Evans)和北卡罗莱纳大学医学院的奥利弗-史密西斯(Oliver Smithies)三位科学家的一系列重大研究突破，让小鼠中的基因打靶技术得以问世。小鼠基因打靶，是将一段外源序列插入小鼠胚胎干细胞中，替换小鼠胚胎干细胞的特定基因。由于该技术能实现基因定点改造，因而具有巨大应用潜力，对整个生命科学与医疗研究价值重大。但经典的基因打靶效率非常低，阳性概率是10-5~10-6，只有百万分之一，让学科发展受到严重阻碍。后来发现新的基因编辑工具，锌指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFN)，是一种人工改造的核酸内切酶。锌指结构存在于大部分的转录因子蛋白中，能特异结合到基因启动子区，所以ZFN是锌指蛋白与核酸内切酶Fok1的融合产物，能在各种复杂基因组的特定位置切割形成双链切口。该酶出现意义非凡，美国Sigma-Aldrich公司将ZFN技术商业化，推动了科研应用与发展。但由于ZFN仍有不少缺陷，比如结合DNA存在很强不确定性，5年后又诞生新一代基因编辑工具TALEN，它具有结构简单，特异性更高、成本低廉的优点，很大程度上替代了ZFN。TALEN技术灵感起源于抗病水稻，发现植物细菌蛋白TAL的氨基酸序列与靶位点的核酸序列具有一一对应关系，由此构建出能靶向定位的重组核酸酶TALEN。2013年初，最新一代的人工核酸内切酶横空出世，它就是CRISPR/Cas9技术。当时美国两个实验室，MIT的华人科学家张峰和哈佛医学院的George Church的研究团队同时在Science上发文，证明CRISPR编辑能在真核细胞中发挥作用，由此奠定重要的应用研究基础。文章发表后引起业内轰动，CRISPR-Cas9结构更简单，只需两个组件，Cas9蛋白和sgRNA序列，打靶的sgRNA引导Cas9核酸酶在基因组（包括iPS基因组）的特定位点上进行切割与修饰。DNA双链断裂后，自身会修复，如果有意人为引入修复模板，就能纠正特定基因。因为操作简单，花费更少，CRISPR技术很快普及开来，在此基础上，全球实验室做了大量工作，分别从细胞系、动物水平以及iPS水平进行基因组的特定编辑，科研成果也相继发表在Science，Nature biology和Cells等知名期刊上。现在，CRISPR/Cas9技术已分别在患有杜氏肌营养不良、B型血友病和PRKAG2心脏综合征的小鼠模型中成功发挥疗效，并在感染的哺乳动物乙肝细胞中删除了病毒DNA，这些实验的成功表明“CRISPR魔剪”有望治疗人类相关疾病。实验操作细节或致小鼠上千基因突变至于近期报道的基因编辑引发上千突变的热议文章，谷峰博士解释，该实验方法是为基因缺陷小鼠进行基因治疗，将疾病小鼠的受精卵取出来，注射Cas9蛋白，sgRNA是以质粒形式注射进去，外加修复模板。修复后采用全基因组测序方法进行检测，在两个小鼠体内发现1736个单碱基突变和1696个碱基突变。这样操作有几个问题，一是行业公认做法是将纯化的Cas9和体外表达的sgRNA显微注射至受精卵，得到转基因动物模型，但该实验是注射质粒形式的sgRNA，对此操作产生一点疑问；第二是注射受精卵后，因为受精卵会分裂很容易产生嵌合体，也容易产生错误结果。在遗传病治疗方面，一般很少用受精卵，受精卵仅用于科研，实际治疗中几乎无用。最后，靶点选择问题，如果不使用经典的PAM（NGG），敲除效率也会降低，而且注射剂量，如酶的过量使用都会造成脱靶。所以对于引发上千个的实验结果，研究人员应该认真分析实验设计与操作。谷峰博士认为，降低脱靶率的策略还有寻找长序列PAM，提高保真力，选择高保真的Cas9并采用双缺口酶策略是目前解决脱靶的最好方案。以上根据谷峰博士演讲整理部分精华。
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从魔剪到六脉神剑，CRISPR多重编辑时代到来？
时间： 21:17
导读 : 2015年，《科学》杂志把CRISPR-Cas9基因编辑技术评为最重要的“突破性发现”，众多科学家普遍认为CRISPR/Cas9是上个世纪70年代生物技术（biotechnology）时代以来出现的最为重要的基因工程技术之一。
2015年，《科学》杂志把CRISPR-Cas9基因编辑技术评为最重要的“突破性发现”，众多科学家普遍认为CRISPR/Cas9是上个世纪70年代生物技术（biotechnology）时代以来出现的最为重要的基因工程技术之一。▲CRISPR-Cas9系统是微生物对付外来DNA的防御系统之一（图片来源：Wikipedia）其实，CRISPR-Cas9系统只是进化过程中细菌微生物演化出的一种对付外来DNA（诸如病毒）的防御系统之一。微生物的适应性免疫系统CRISPR通过两类不同的RNA引导的核酸酶效应系统来介导对针对外源遗传元件的防御。第1类（Class 1 ）效应分子系统利用多蛋白复合物，而第2类（Class 2）效应分子系统依赖于单组分效应蛋白，例如上述的的Cas9蛋白。 2015年9月，以张锋教授研究团队为主的科学人员报告新的一个2类CRISPR效应分子Cpf1：以“Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System”为标题发表在2015年九月的《细胞》杂志上。他们证明Cpf1具备介导强大的DNA干扰并且不同于Cas9的功能。Cpf1是不需要tracrRNA的单一RNA指导的内切核酸酶，并且利用富含T碱基的间隔物相邻基序（PAM）。此外，Cpf1通过交错方式切割DNA双链。在16个Cpf1家庭蛋白质中，他们首先从酶酸性氨球菌和螺旋藻科确定了两个候选物，可以在人类细胞中展示有效的基因编辑活性。▲CRISPR-Cpf1系统可有效介导基因编辑（图片来源：《细胞》）发现这个新的基因编辑效应分子后，科学家们认为可以弥补CRISPR-Cas9技术平台的部分限制和“先天不足”：Cas9核酸酶通过识别染色体上的PAM序列来锁定目标。Cas9所需的PAM往往是鸟嘌呤富集（Guanine-rich) 的部位，于是大大限制了目标切点的可选择性。Cas9核酸酶切割双链DNA是会产生平端(Blunt end) ，再通过细胞自身的同源重组修复系统（HR）或非同源粘合系统（NHEJ)的方式修复DNA，同时也可人为得到基因编辑的目的。但是平末端修复进行基因编辑较为随机和低效。那么Cpf1的蛋白有哪些特征可以克服CRISPR-Cas9系统应用中的一些不足呢？Cpf1酶比目前广泛使用的标准Cas9酶要小，更容易进入细胞内部。Cas9剪切DNA需要crRNA和tracrRNA两个RNA小分子，而Cpf1只需要crRNA，不需要tracrRNA。于是，Cpf1系统更加简单。Cas9是在同一个位置同时剪切DNA分子的双链，最后形成的是平末端；而Cpf1酶剪切后形成是两个不同长度的DNA链，即我们通常熟知的粘性末端（sticky-end）。平末端通常不容易进行下游处理，而粘性末端让DNA插入更好控制。Cpf1复合物可识别的PAM序列比Cas9的选择范围更多。基于上述种种Cpf1介导的基因编辑的优势和特征，以张锋教授研究团队为主的科学人员假设Cpf1可能足以用于pre-crRNA成熟——这对基因组编辑有重要的意义，因为它将提供一个多重靶向基因编辑的的简便途径。过去一直用Cas9靶标多个基因组位点的时候，研究人员需要构建多个或者碱基数很大的表达载体，使得多重基因编辑受到很大局限。本周在《Nature Biotechnology》杂志上发表的“Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 through autonomous processing of a single crRNA array”论文里面，他们的结果显示：Cpf1可以成功加工自身所需的crRNA；不再需要其他分子的支持；Cpf1介导的pre-crRNA加工而且独立于DNA剪切的。利用这些原理，研究人员成功设计了一个单CRISPR阵列表达载体，该载体同时在哺乳动物细胞编辑修改了四个基因，在小鼠大脑组织编辑了三个基因——也就是说在细胞品系和动物体内简单有效完成了多重基因编辑的目的。▲Cpf1系统更加简便（图片来源：《Nature Biotechnology》）有效进行多重基因编辑不仅仅在遗传学、发育学和细胞学等基础领域有极其重大的意义，在临床医学研究上也逐渐被应用和重视。比如说，在CAR-T肿瘤免疫疗法的设计层面上，研究人员希望可以使用异体的CAR-T细胞来治疗多个患者。但前提是必须必须保证其安全性，确保供体细胞不会攻击患者受体，同时降低避免宿主细胞的攻击。为了达成这些目的，科研人员已经开始使用CRISPR编辑技术将TCR基因从异体的CAR-T细胞中敲除，避免移植物抗宿主病（GVHD）的发生；同时也尝试将人类白细胞抗原（HLA）基因敲除，来降低自身免疫原性。另外，科学人员也认为有必要在CAR-T细胞中敲除了PD-1（肿瘤免疫逃逸相关的T细胞表面抑制因子）基因来阻断PD-1信号通路。举例来说，两篇近期发表的论文就是使用了CRISPR-Cas9介导的DNA核酸酶系统进行了尝试性的多重基因同时编辑，来推动异体CAR-T细胞制备的需要。一篇是发表在《Clinical Cancer Research》上面的论文，题为“ Multiplex genome editing to generate universal CAR T cells resistant to PD1 inhibition”，通讯作者之一为CAR-T领域的领军人物Carl June教授。另外一篇是发表在《自然》旗下《Cell Research》杂志上，题为 “CRISPR-Cas9 mediated multiplex gene editing in CAR-T cells”的，该文由中国科学院动物研究所王皓毅研究组等众多中国科学家协力完成。▲医学研究人员已经开始尝试使用CRISPR基因编辑技术来制备安全通用型的CAR-T细胞（图片来源：《Cancer Research》和《Clinical Cancer Research》）这些初步研究结果表明，经过多重基因编辑的CAR-T细胞与普通CAR-T细胞相比，可呈现更强的肿瘤细胞杀伤功能，可望成为安全型的效应细胞，在临床得以应用。基于上面所综述的一系列研究结果和原理，我们期望涉及Cpf1多重基因编辑的研究应用会在CAR-T细胞治疗领域大显身手，为异体通用型CAR-T的制备提供更加完善、高效且简便的基因编辑技术平台。参考资料：[1] Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1through autonomous processing of a single crRNA array[2] Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System转载自药明康德欢迎您积极投稿或建言献策/image.php?url=0F9drd9mGd
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