孕妇及新生儿巨细胞病毒荧光定量聚合酶链反应检测的意义
先天性疾病是新生儿死亡的重要原因,而其中巨细胞病毒感染在全世界范围内是最常见的一种原因,在发达国家活产儿巨细胞病毒的感染率为0.3%～2.2%[1]。病毒可以通过孕妇原发或继发性感染传播给胎儿,其中通过孕妇原发感染传播给胎儿的概率是30%～40%,孕妇继发感染病毒传播给胎儿的概率很小。因此针对孕妇及新生儿进行巨细胞病毒的检测具有一定的临床意义。本院于2008年开始进行巨细胞病毒(CMV)的检测,主要采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)的方法,现报道如下。1资料与方法1.1一般资料2008年1月至2011年12月在本中心遗传室进行巨细胞病毒检测的孕妇及新生儿。孕妇33 823例,新生儿3 757例。标本主要以尿液和乳汁为主。1.2仪器与试剂ABI7300PCR仪,人类巨细胞病毒DNA定量检测试剂盒(达安基因股份有限公司)。1.3方法1.3.1标本处理取标本1～1.5mL于离心管中,12 000r/min离心5min。1.3.2样本D...&
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近年来,巨细胞病毒(CMV)感染引发胚胎发育异常,造成流产、早产、宫内发育迟缓、出生缺陷及生后持续感染等问题受到人们广泛重视[1]。积极开展先天性CMV感染的产前诊断是预防巨细胞病毒儿出生的重要措施之一。我们应用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)对孕妇CMV感染进行了检测分析,并对部分感染者产前诊断。资料与方法1.对象:2000年11月~2003年7月,本院妇产科门诊产前检查和优生咨询的孕妇1016例,年龄22~42岁,其中孕早期85例,孕中期931例。初诊时留尿液1.5m l,用FQ-PCR检测CMV-DNA,同时抽取肘静脉血3m l,用ELISA检测CMVIgG和CMV IgM。对CMV-DNA和/或CMV IgM阳性的孕妇,在B超引导下经宫颈取绒毛4例,经腹取羊水16例,用FQ-PCR法检测CMV-DNA。16例出生时取新生儿尿液和脐血复查CMV-DNA和CMV-IgM。临床上观察孕妇的妊...&
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巨细胞病毒感染是发病率很高的疾病,我国孕妇中巨细胞病毒感染率高达80%~100%,多数人病变呈静止的潜伏状态,临床上也无症状。但孕妇在妊娠期新感染巨细胞病毒或以前潜在感染病变活动时,对胎儿和新生儿的危害极大。巨细胞病毒通过胎盘途径、产道分泌物、乳汁和飞沫进行传染,引起儿童发病。一般根据患儿获得感染的时间,将儿童巨细胞病毒感染分为三类:1先天性感染,指巨细胞病毒感染的母亲所生育的子女在出生后14天内证实有巨细胞病毒感染,为宫内感染所致。2围产期感染,指巨细胞病毒感染的母亲所生育的子女出生14天内没有巨细胞病毒感染,而于出生后第3—12周内证实巨细...&
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巨细胞病毒在无...&
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为探讨巨细胞病毒（ｃｙ?ｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ，ＣＭＶ）感染或潜伏病毒激活与复发性阿弗他溃疡（ｒｅｃｕｒｅｎｔａｐｈｔ?ｈｏｕｓｕｌｃｅｒ，ＲＡＵ）复发的关系，我们采用ＥＬＩＳＡ法对不同时期、不同类型及不同性别、不同年龄的ＲＡＵ患者ＣＭＶＩｇＭ、ＩｇＧ进行检测和对比研究。１?材料和方法：溃疡期ＲＡＵ患者３９例，间歇期１２例。正常对照组２１例，取自健康献血员。ＣＭＶ抗原液（１∶１５００）包被ＥＬＩＳＡ反应板、加待检血清（１∶３００），３７℃孵育后，加酶结合物（１∶３０００，μ链特异性），孵育后加底物，显色后在ＥＬＩＳＡ测定仪上读取Ａ值。２?结果：①溃疡期ＣＭＶＩｇＧ、ＩｇＭ阳性率分别为８４?６２％和２０?５１％，间歇期ＩｇＧ阳性率为９１?６７％，ＩｇＭ均为阴性。两期比较，ＩｇＧ阳性率差异无显著性（Ｐ＞０．０５），溃疡期ＩｇＭ阳性率高于间作者单位：４３００７０湖北医科大学口腔医学院歇期，差异有显著性（Ｐ＜０．０１）。对照组ＩｇＧ...&
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巨细胞病毒(cjt二legl。侧rus.CMV)属疤疹病毒科,是引起人类先天性畸形和婴幼儿感染的重要病原之一。近平反现在艾滋病、放射损伤、器官移梢和恶性琳烧等免疫·100·抑制病人中,CMV常可引起严重的并发感染(1),因而受到人们的重视。本文就近年有关CMV和抗CMV药物研究的一些进展综述如下。 一、巨细胞病毒研究进展 随着现代细胞培养技术和分子生物学技术的发展,有关CMV分子结构与生物学功能、临床病理和流行病学研究己取得较大的进展。 1.巨细胞病毒的分子生物学 CMV为DNA病毒。病毒粒子直径为80~2。如m。双股线状DNA和少量蛋白质构成病毒的拟核心,外被以二十面体蛋白衣壳,最外层则为类脂质套膜。套膜与蛋白质衣壳之间还有一蛋自质构成的不定形颗粒层。 已知CMV的DNA分子量为1.50、1.55x10s道尔顿,由两部分组成,即L片段(10二gsegmont)和S片段(shortsegm-ent),两者共价连接。有趣的是两片段...&
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巨细胞病毒(C Mv)可感染人和多种动物,引起许多疾病,近几年由于体外培养、分子生物学、免疫学技术约发展,对人的CMv的生物学及发病机理有了较清楚的认识,对动物CMv的研究也逐渐增多,鉴于目前国内这方面的文献较少,木文试对鼠、豚鼠、大鼠、牛、马的CMv子乍一简要综述。1分类与所致疾病 从形态学角度考虑,CMV属于泡疹病毒科,由于其复制周期较长,形成以巨大细胞为特征的细胞病变及相对较窄的宿主范围,可将其进一步归属于乙型瘤疹病毒亚科,但有的文献将马的cMv列入甲型疤疹病毒亚科。另外,根据分离出CMv的动物品种,病毒子抗原的交叉反应、病毒DNA的存列及与标准基因组DNA的同源性,又可将CMv分为不同的属和种。儿种动物CMv引起的疾病见下表。 几种动物CMV所致疾病肺炎.内耳感染(迷路周炎).眼内感染,心脏感染(心包心肌炎、营养不良性心脏钙化,皮肤感染疙疹)子宫内感染(死胎、畸形、子宫颈炎等),叫质性肺炎毒立狠厂.创V胞n细口巨M鼠( ...&
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葡萄胎是一种与妊娠有关的良性病变，发病率为1／100-1／500，部分葡萄胎可发展为侵蚀性葡萄胎，再进一步发展成绒癌。因此葡萄胎仍是一种严重危害育龄妇女生育健康及身心健康的重要疾病。葡萄胎的发生与恶性转化机制仍不明确，
目前有如下几方面的学说：
1、流行病学调查结果表明文化因素和葡萄胎的发生有统计学关联。提示较高的文化程度可以降低葡萄胎发病的可能性。
2、葡萄胎的遗传学说：葡萄胎的发生多是异常受精所致。
3、研究结果显示妊娠次数与葡萄胎的发病也是有相关关系，较多的妊娠次数可能是葡萄胎发病的一种危险因素。
4、另外多次接受刮、吸宫术也是葡萄胎发生的一项重要危险因素。
5、癌基因及肿瘤抑制基因和凋亡调节基因也参与葡萄胎的发生。
而目前的大量研究提示葡萄胎的基因组中可能存在遗传易感基因，迄今为止国内外还未获得葡萄胎的遗传易感基因。为明确葡萄胎的基因学发病机制，前期我们从基因克隆方面入手，在早孕的绒毛组织和正常的葡萄胎组织进行抑制性消减杂交，分离和鉴定出一种功能未明的在葡萄胎中高表达的基因F10，F10是一个新基因从未在任何组织或疾病中有过研究报道。
第一部分：F10基因转染细胞表达谱分析
F10基因是我们在探讨葡萄胎发病机理时发现的未知功能的新基因。
1、F10低表达细胞株的筛选：选取Be17402、HIC、HepG2、PC、A549、MGC、16HBE、293八种细胞，利用细胞免疫组化技术和荧光定量PCR技术筛选出F10低表达的细胞株；
2、F10基因转染其低表达的细胞株后观察其基因表达谱的变化：利用差异显示技术粗筛F10基因对细胞基因表达谱的影响，实验分四组：质粒pRc-CMV2／F10+、pRc-CMV2、pRc-CMV2／F10-分别瞬时转染A549细胞组及空白细胞对照组。
1、荧光定量PCR、细胞免疫组化结果表明：新基因F10在人的8种细胞中呈不同程度的表达。其中F10基因在MGC、PC、Be17402中高表达，在HepG2、HIC中表达次之，在293中表达量较低，在16HBE、A549中表达量最低。
2、质粒pRc-CMV2／F10+、pRc-CMV2、pRc-CMV2／F10-分别瞬时转染A549细胞组及空白细胞对照组四个实验组间差异显示的条带扩增后测序获得
1、利用细胞免疫组化技术和荧光定量PCR技术检测到F10在Be17402、HIC、HepG2、PC、A549、MGC、16HBE、293八种细胞中呈不同水平的表达。其中F10基因在MGC、PC、Be17402中高表达，在HepG2、HIC中表达次之，在293中表达量较低，在16HBE、A549中表达量最低。
2、利用差异显示技术粗筛F10基因转染对细胞基因表达谱的影响，获得的各组之间有统计学意义差异表达的5个基因：annexinI、IPLA2、DATF1、STAT1、BASP1，根据差异表达基因的功能提示F10基因参与细胞的增殖和凋亡过程。
第二部分：F10基因对转录因子活性影响
我们通过抑制性消减杂交和差异筛选法，克隆到一个新的在葡萄胎中表达上调的基因片断：F10ESTcDNA(Genbank登陆号：AB196290)，利用细胞免疫组化和荧光定量PCR技术在Be17402、HIC、Hepc2、PC、A549、MGC、16HBE、293八种细胞中筛选出F10低表达的细胞株后利用差异显示技术粗筛F10基因转染对细胞基因表达谱的影响，根据获得差异表达基因的功能，提示F10基因可能与细胞的增殖和凋亡有关。
1、F10基因对重要的信号传导通路的影响：质粒pRc-CMV2／F10+(pRc-CMV2、pRc-CMV2／F10-)和报道系统AP1-Luc(NF-κB-Luc、pHSE-luc、pCRE-luc、pSRE-luc、pGRE-luc)共转染A549细胞，通过测定荧火虫荧光素酶活性，利用荧光素酶报道系统分析F10对细胞重要传导通路的作用。
2、EMSA实验检测AP1和NF-κB和DNA的结合活性。
1、pRc-CMV2／F10+组、pRc-CMV2组与pRc-CMV2／F10-组细胞在F10和API-Luc质粒共转染24h即可检测荧光素酶的活性，并逐渐增高至转染后48h，pRc-CMV2／F10+组较pRc-CMV2组与pRc-CMV2／F10-组之间的荧光素酶活性高且差别有统计学意义，P=0.000。pRc-CMV2组与pRc-CMV2／F10-组荧光素酶活性无统计学意义，转染72h后各组荧光素酶活性开始下降，各组之间无统计学意义。
2、pRc-CMV2／F10+组、pRc-CMV2组与pRc-CMV2／F10-组细胞在F10和NF-κB-Luc质粒共转染24h即可检测荧光素酶的活性，48小时达到最高，pRc-CMV2／F10+组较其它二组荧光素酶活性低且差别有统计学意义，P=0.000。
3、pRc-CMV2／F10+组、pRc-CMV2组与pRc-CMV2／F10一组细胞在F10分别和pHSE一1uc、pCRE-luc、pSRE-luc、pGRE-luc质粒共转染后的荧光素酶活性差异无统计学意义。
1、利用质粒pRc-CMV2／F10+(pRc-CMV2、pRc-CMV2／F10-)分别和报道系统AP1-Luc共转染A549细胞，通过测定荧火虫荧光素酶活性，利用荧光素酶报道系统分析F10对细胞重要传导通路的作用。
第三部分：F10基因对细胞增殖和细胞周期的影响
综合前二部分的研究，提示F10基因参与促进细胞增殖、抑制细胞凋亡的过程，导致细胞生长发育异常。
1、F10对细胞增殖的影响：转染pRc-CMV2／F10和pRc-CMV2质粒于肺癌细胞系A549，通过MTT实验检测二组细胞生长增殖情况；
2、F10对细胞周期的影响：转染pRc-CMV2／F10和pRc-CMV2质粒于肺癌细胞系A549，通过流式细胞技术检测二组细胞各个细胞周期的变化情况；
3、利用免疫组化方法检测上述二组细胞中增殖核抗原(PCNA)和细胞周期素D1(cyclinD1)的表达变化。
1、根据酶标仪连续6天测定的570nm波长吸光值绘制出肺癌细胞A549的生长曲线，在保证培养条件、接种细胞量、观察时间一致的情况下，二组细胞之间总体生长趋势差异有统计学意义(P=0.000)。pRc-CMV2／F10组其促进细胞增殖作用比对照组明显。
2、流式细胞技术检测结果：pRc／CMV2／F10基因转染细胞48小时较对照组细胞中G2／M期细胞比例升高1.2倍、S期升高2.1倍。二组相比差异有显著性意义，P&0.05。
3、免疫组化显示：PCNA在A549／F10组细胞中强阳性表达，在A549／空载体组细胞中呈中度阳性表达。
1、转染pRc-CMV2-F10和pRc-CMV2质粒于肺癌细胞系A549，通过MTT实验得出二组细胞连续6天的总体生长趋势差异有显著性意义(P=0.000)。pRc-CMV2／F10+组其促进细胞增殖作用较对照组明显。提示F10基因有促进细胞增殖的作用。
2、转染pRc-CMV2-F10和pRc-CMV2质粒于肺癌细胞系A549，采用流式细胞技术检测F10对细胞生长周期的影响，pRc／cMV2／F10基因转染细胞48小时较对照组细胞中G2／M期细胞比例升高1.2倍，S期升高2.1倍。
3、利用免疫组化方法检测细胞中增殖核抗原(PCNA)和细胞周期素D1(eyelinD1)的表达变化。
第四部分：稳定转染F10基因A549细胞株的构建
研究探讨基因的功能利用基因转导技术将外源基因转入某一细胞，通过观察细胞生物学行为的变化来认识基因的功能，这是目前使用最广泛、技术最成熟的基因功能研究方法，而建立稳定表达外源基因的细胞模型是这一研究不可或缺的关键一步。
F10基因真核细胞稳定表达系统构建与鉴定：
1.质粒pRc-CMV2／F10和pRc／CMV2提取、鉴定后转染A549细胞系。用G418筛选并扩大培养，建立阳性单克隆细胞株。
2.荧光定量PCR技术鉴定获得的阳性克隆细胞株。
1.质粒pRc-CMV2／F10、pRc-CMV2转染A549细胞系后细胞经过大约三个月的筛选，得到2株稳定表达pRc／cMV2-F10基因的A549细胞和1株稳定表达pRc／CMV2基因的A549细胞。
2.荧光定量PCR结果表明：pRc-CMV2／F10+细胞株F10表达水平较pRc-CMV2高，结果有统计学意义。P&0.05。
1.质粒pRc-CMV2／F10和pRc／CMV2提取和鉴定后转染A549细胞系。经过G418大约三个月的筛选，得到2株稳定表达pRc／CMV2-F10+基因的A549细胞和1株稳定表达pRc／CMV2基因A549细胞。
2.阳性单克隆细胞株经过荧光定量PCR鉴定结果表明：pRc-CMV2／F10细胞株F10表达水平较pRc-CMV2细胞株高。
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CMV感染病儿实时荧光定量PCR检测及意义
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&作者：刘薇&蒋玉红，孙佰秀，李海峰，罗兵 【摘要】&&目的&探讨实时荧光定量PCR法检测病儿尿液中巨细胞病毒(CMV）?DNA含量在诊断和动态监测CMV感染中的意义。方法&应用PE&5700全自动PCR扩增分析仪，检测35例临床高度怀疑有CMV感染病儿（病儿组）尿液中的CMV?DNA拷贝数,随机选择45例同年龄段患非感染性疾病病儿作为对照组,比较两组CMV阳性标本中CMV?DNA含量，并测定治疗后的病毒载量。同时与血清CMV?IgM抗体检测结果进行比较。对部分病儿进行临床观察和随访。结果&病儿组CMV感染27例,阳性检出率为77.14%;对照组CMV感染12例,阳性检出率为26.67%。治疗后两组病儿尿液中CMV?DNA拷贝数下降幅度均较大,与治疗前比较,&差异有显著性（t=4.159、5.438，P&0.01）。实时荧光定量PCR法CMV阳性检出率高于血清CMV?IgM检测方法。9&例病儿随访2年,1例胆管闭锁病儿手术后CMV病毒载量仍在较高水平,1年后发展为肝硬化；4例CMV&肝炎经治疗后,&1&例CMV?DNA转阴，3例仍阳性；4例无症状性感染病儿CMV?DNA转阴或降至低水平。结论&实时荧光定量PCR技术检测CMV感染具有快捷、灵敏度高、特异度高等优点，量化结果便于对治疗过程进行连续监测，为病儿治疗和随访提供有效帮助。& 【关键词】&&巨细胞病毒感染；荧光免疫测定；聚合酶链反应 巨细胞病毒(CMV)是已知病原微生物中最易引起小儿急、慢性感染的病毒之一，早期准确诊断CMV感染具有重要的意义[1]。CMV感染的临床表现多样,&以往多通过检测血清特异性IgM以及定性PCR检测病毒DNA进行诊断，但易出现假阴性和假阳性结果。本文采用实时荧光定量PCR法检测可疑CMV感染病儿尿标本中CMV?DNA含量,&以评价其在CMV感染病儿诊断、治疗及动态监测中的价值。 　　1&&资料与方法 　　1.1&&一般资料 &&&& 　　2005年5月～2006年5月，选择青岛市儿童医院收治临床高度怀疑有CMV感染病儿（病儿组）35例，男20例，女15例；年龄2&d～1岁。根据CMV感染诊断方案[2]，当病儿出现与CMV感染相关的症状、体征时,诊断为症状性感染;当病儿无相关症状，无或有受损器官的体征和(或)实验室检查异常,诊断为无症状性感染。并选取同期45例同年龄段患非感染性疾病住院病儿作为对照组,&其中男23例，女22例。 　　1.2&&检测方法 　　1.2.1&&尿CMV?DNA测定&&采用实时荧光定量PCR方法。清洁小儿外阴,&留取新鲜尿液2&mL送检。试剂由深圳匹基生物有限公司提供,&仪器为美国PE公司PE&5700基因扩增仪，扩增结束后拷贝数小于106/L为阴性，拷贝数大于106/L为阳性，并由仪器根据标准曲线自动计算出定量结果。 　　1.2.2&&血清CMV?IgM抗体检测&&采集小儿非抗凝静脉血2&mL，分离血清置4&℃保存，采用美国HOPE公司生产ELISA试剂盒检测血清CMV?IgM抗体。 　　1.3&&治疗方法 &&&& 　　症状性感染组病儿一经确诊有CMV感染，立即给予更昔洛韦10&mg／（kg?d）加入50&g/L葡萄糖注射液100～200&mL中静脉滴注，连用10&d为1个疗程，同时辅以保肝药物如维生素C、肝复肽等治疗。根据病情和肝功能、CMV病毒载量的复查结果决定治疗疗程。无症状性感染组病儿用更昔洛韦抗病毒治疗1个疗程。 　　1.4&&随访 &&&& 　　症状性感染组和无症状性感染组病儿分别于治疗后半年、1年和2年监测肝功能和CMV病毒载量，并应用无创性超声观察小儿的肝脏形态学、血流动力学相关指标改变及肝脏是否有纤维化。 　　1.5&&统计学方法 &&&& 　　用SPSS&11.5统计软件进行数据处理，CMV?DNA拷贝数以指数表示（log10）x。计量资料组间比较采用t检验，计数资料比较用χ2检验。 　　2&&结果& 　　2.1&&实时荧光定量PCR法检测 &&&& 　　病儿组CMV阳性者（症状性感染）27例,占77.14%；对照组CMV阳性者（无症状性感染）12例,占26.67%。与治疗前比较，两组治疗后CMV?DNA拷贝数指数下降幅度均较大,差异有显著性（t=4.159、5.438，P&0.01）。治疗前、治疗后两组间CMV?DNA拷贝数指数比较，差异均有显著性（t=2.454、2.432，P&0.05）。见表1。 　　2.2&&两种方法的检测结果比较 &&&& 　　实时荧光定量PCR法CMV阳性检出率为48.75%(39/80),&血清CMV?IgM检测方法CMV阳性检出率为13.75%(11/80)，前者阳性检出率高于后者。 　　2.3&&随访结果 &&&& 　　9例病儿随访2年,1例胆管闭锁病儿手术后CMV病毒载量仍在较高水平,1年后发展为肝硬化；4例CMV肝炎病儿治疗后,&1例CMV?DNA转阴，3例CMV?DNA仍阳性，其中1例预后不良，3例预后良好；4例无症状性感染病儿CMV?DNA转阴或降至低拷贝水平。 　　表1&&症状性感染组与无症状性感染组治疗前后CMV?DNA拷贝数指数比较（略） 　　与治疗前比较，t=4.159、5.438，P&0.01；与无症状性感染组比较，#t=2.454、2.432，P&0.053&&讨论 &&&& 　　CMV属疱疹病毒类,具有潜伏?活动的生物学特征。CMV感染的流行病学研究表明,约有3%的新生儿在出生时就已感染CMV,表明该病毒可经胎盘感染胎儿[3]，造成胎儿严重疾病的感染通常发生在妊娠的最初12周内[4]。CMV感染在我国流行广泛,胎儿及免疫力低下的小病儿易受侵害,临床表现与年龄有关,年龄大者感染CMV后临床症状轻,可表现为无症状性感染；胎儿期和围生期发生的CMV感染临床症状较重,&表现复杂，可造成先天性脑白质发育不良,某些病例预后差,有致残、致死的可能[5]。本文中5例临床表现严重的病儿均在出生后2月内发病,3例为早产儿,&1例胆管闭锁病儿最终发展为肝硬化。因此，及早诊断CMV感染并系统性治疗能减少并发症的发生，病儿预后良好。 &&&& 　　本文对CMV感染病儿随访2年，有9例资料完整，其中1例胆管闭锁病儿于出生后2周发病，总胆红素和直接胆红素明显升高，10周时手术治疗后肝功能明显好转，CMV载量一直维持较高拷贝数，治疗后1年随访时已发展为肝硬化，预后不良。4例无症状的CMV&感染病儿,在治疗后2例CMV?DNA转阴，2例降至低水平的阳性，随访2年预后较好，肝功能正常，超声检查肝脏正常。4例CMV肝炎病儿中1例治疗后CMV?DNA转阴，3例治疗后病毒载量下降，其中1例于出生后2周发病病儿治疗后病毒载量下降不明显，随访2年中一直在较高水平，肝功能在治疗后半年时又出现异常，谷丙转氨酶升高1倍，抗病毒和保肝治疗后肝功能正常，超声检测提示肝脏轻度纤维化。肝纤维化是肝硬化的早期阶段，是可逆性的，一旦发展至肝硬化则难以恢复[6]。所以，对CMV感染病儿要在治疗后几年中监测CMV病毒载量和肝功能水平，发现异常后及时治疗，防止肝脏纤维化的发生。先天性胆管闭锁过去认为是一种先天畸形，由发育障碍引起，近年来提出炎症学说。本文有1例肝外胆管闭锁病儿经血清学及尿标本CMV?DNA检测均证明有CMV感染，临床上表现为黄疸颜色深,大便白色,肝脏进行性增大、质硬，手术后1年出现肝硬化,预后不良，从病毒学角度证明CMV肝炎可能发展为胆管闭锁。该病儿可能在出生前由母亲胎盘感染CMV，引起胆管炎症，进而出现胆管闭锁。
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