q-pcr结果分析_百度文库 两大类热门资源免费畅读 续费一年阅读会员，立省24元！ q-pcr结果分析 上传于|0|0|暂无简介 阅读已结束，如果下载本文需要使用1下载券 想免费下载本文？ 定制HR最喜欢的简历 下载文档到电脑，查找使用更方便 还剩7页未读，继续阅读 定制HR最喜欢的简历 你可能喜欢当前位置： >> qPCR原理及应用 实时荧光定量PCR的原理和应用2010.10 雅睿生物 黄宝福目录? 实时荧光定量PCR原理PCR 荧光标记 绝对定量和相对定量? 实时荧光定量PCR应用 ? 实时荧光定量PCR发展digital PCR,qPCR Array实时荧光定量PCR原理
聚合酶链式反应 Polymerase chain reaction (PCR)1971 年， Khorana 提出：经过 DNA 变性， 与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引 物，并不断重复该过程便可克隆 tRNA 基因。聚合酶链式反应 Polymerase chain reaction (PCR)1985 年，美国 PE-Cetus 公司的 Mullis 等人发明了聚 合酶链反应（PCR） 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐 热，使这一过程耗时，费力，且易出错 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随 后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发 明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔 化学奖。PCRDNA 解旋解链5’ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC3’结合引物子链延长3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG5’PCRDNA 解旋解链5’ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC DNA GGAUCG 聚合酶 3’5‘DNA 聚合酶3’ 5‘结合引物子链延长3’AUCGCG TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’ 5’PCRDNA 解旋解链5’ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC DNA GGAUCG TAGCGCTATCGCATCGACGCT 聚合酶 3’5‘3’ 5‘结合引物DNA AUCGCG ATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 聚合酶3’ 5’子链延长3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCGPCR原理高温变性 低温退火 适温延伸12394 72 55 22重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上DNA变性 形成 2条单链（℃）温度子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性DNA双螺旋123时间（min）45模板DNA 第一轮扩增 第二轮扩增第四轮扩增第五轮扩增第三轮扩增实时荧光定量PCR在PCR反应体系中加入荧光基团，利 用荧光信号累积实时监测整个PCR进程， 最后通过标准曲线对未知模板进行定 量分析的方法。实时荧光定量PCR和常规PCR常规PCR技术： 对PCR扩增反应的终点产 物进行定量和定性分析。无 法对起始模板准确定量，无 法对扩增反应实时检测。 实时荧光定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实 时检测PCR扩增反应中每一个 循环扩增产物量的变化，通 过 Ct 值和标准曲线的分析对 起始模板进行定量分析。荧光PCR特点?灵敏度高 ?特异性强 ?全封闭PCR过程，无需后处理 ?即时反映扩增过程，摒弃终点数据，更适用于定量 ?定量范围宽，可达到10个数量级，无须稀释样品 ?可实现一管多检 ?仪器自动分析，更快获得结果实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR原理Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定 的阈值时所经过的扩增循环次数。C(t) valueCt值的重现性纵轴：荧光信号量 横轴：PCR反映循环数Ct值的特点：?相同模板进行96次扩增，终点处产物量不 恒定； ? Ct值则极具重现性实时荧光定量PCR原理-定量原理?理想的PCR反应： ? X=X0*2n ?非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n ? ? ? ? ? n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率实时荧光定量PCR原理-定量原理在扩增产物达到阈值线时: XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M 方程式(1)两边同时取对数得: lg M=lg X0 (1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得: lg X0= - Ct× lg(1+Ex) + lg M (3) Lg浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值 的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量。实时荧光定量PCR原理-定量原理Standard Curve40 39 38 37 36 35 34 33 32 31 30 29 28 27 26 25 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15 1 10 100 0C(t) ValueCopy Numbers? 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即 Ct值越小。 ? Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝 数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以 计算出样品中所含的模板量。实时荧光定量PCR原理-相对定量靶核酸： 参比内标： XCt=X0(1+Ex)Ct,x=Kx RCt=R0(1+ER)Ct,R =KR XCt RCt R0(1+ER)Ct,R KR X0 × (1+E)Ct,x-Ct,R = K R0 ?Ct= Ct,x-Ct,R： = X0(1+Ex)Ct,x = Kx =KEx=ER=E: XN= X0 R0XN × (1+E) ?Ct = KXN = K ×(1+E) -?Ct XN,q K ×(1+E) -?Ct,q - ? ? Ct (1+E) = = XN,cb K ×(1+E) -?Ct,cb ? ? Ct= ? Ct,q- ? Ct,cb样本q的XN除以 校准样本（Calibrator） cb的XN：实时荧光定量PCR原理-相对定量Livak & Schmittgen, Method,-408绝对定量和相对定量? 绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度 （DNA，RNA）C 病毒DNA或RNA的拷贝数 C 转基因的拷贝数? 相对定量：计算初始反应模板的相对含量C C C C 差异表达分析 芯片评估 转基因生物的检测 基因型检测荧光标记非特异性荧光标记：1、 SYBR Green Ⅰ 2、EvaGreen 3、LC Green特异性荧光标记：2、TaqMan 3、Molecular Beacon 4、Amplisensor RQ QSYBR GREEN I? SYBR GreenⅠ 能结合到双链DNA的小沟部位SYBR Green ? ? SYBR Green Ⅰ 只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光? 复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR GreenⅠ 发荧 光，在此阶段采集荧光信号（一般设置在复性阶段）。SYBR GREEN 熔解曲线分析-dI dTTm将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT)SYBR GREEN 熔解曲线分析融解曲线分析，单一峰 无非特异性荧光 定量准确非特异性产 物融解曲线分析，有杂峰 其他产物出现非特异性 荧光，因此定量不准确SYBR GREEN法优缺点优 点? 对DNA模板没有选择性 ----适用于任何DNA ? 使用方便 -----不必设计复杂探针 ? 非常灵敏 ? 便宜缺 点? 容易与非特异性双链DNA 结合，产生假阳性 但可以通过融解曲线的分 析，优化反应条件 ? 对引物特异性要求较高FRET当某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的吸收光谱发生重叠，且两个基 团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长 （低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移(FRET),实际相当 于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽。Taq man探针与目标序列互补? 5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 ? 3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) ? 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 （荧光共振能量转移原理，FRET） ? Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针Taq man 探针? 特异性荧光 双标记探针 ? Taq酶 5’→3’外切 酶活性Taq man 探针法优缺点优点? 对目标序列的高特异性 ------阴性结果确定 ? 设计相对简单 ------与目标序列某一区 域互补 ?重复性比较好缺点? 只适合一个特定的目标 ? 委托公司标记，价格较高 ? 不易找到本底低的探针Molecular Beacon 分子信标环?标记荧光的发夹探针茎?环与目标序列互补 ?茎由互补配对序列组成荧光素 淬灭剂Molecular Beacon 分子信标Molecular Beacon 分子信标优点?高特异性：对目标 序列 检测SNP最灵敏的试 剂之一 ?荧光背景低缺点? 只能用于一个特 定目标 ? 设计困难 ? 价格比较高高分辨率熔解曲线High resolution melting cure(HRM)Reed et al. Pharmacogenomics (), 597C608实时荧光定量PCR应用实时荧光定量PCR应用?基因扩增 ?扩增特异性分析 ?基因定量分析 ?基因检测 ?基因分型 ?SNP分析 ?RFLP多态性分析 ?单/多基因表达研究 ?高通量基因表达谱研究疾病的早期诊断? 免疫学诊断主要是抗原抗体反应，应用于临 床通常在体内产生抗体以后，而许多病原体 的免疫学检测存在较长的“窗口期”，比如 HCV的“窗口期”平均长达70天，不利于对疾 病的早期诊断；PCR方法直接检测病原体的 DNA/RNA，能大大缩短“窗口期”，其高灵敏 度的检测显然也有利于疾病的早期诊断。 ? 病原体检测：确定病原体的种类和基因型， 以利于治疗方案的确定遗传疾病的早期诊断? 荧光PCR可实现对点突变、缺失突变、插入 突变、多基因突变等的检测，对产前诊断具 有其他方法不可比拟的优势，有利于优生优 育，提高人口素质。药物研究? 任何一种抗病毒药物，以免疫标志物来评价 其疗效均不够敏感和及时，若以病毒复制的 被抑制程度，即病毒基因水平的高低和动态 变化来评价疗效，则较为直接和理想。 ? 新药筛选：药物作用靶标的研究，基因表达 的变化 ? 药效的评价：对服药后体内基因表达或病原 体载量的变化进行监控，更好的评价药效， 有助于治疗方案的改进肿瘤的诊断?可对原癌基因的突变和易位等作出检测；? 可对原癌基因的mRNA进行定量分析； ? 有利于肿瘤的早期诊断，甚至癌前诊断； ? 探索癌变发生机理的研究提供参考； ? 区别肿瘤的良性和恶性以及炎症反应。食品安全? 病原微生物检测：对食品中可能存在的病原 微生物进行定量检测，保护人民生命安全 ? 转基因食品检测 ? 动物疫病检测：为防止动物疫病的传播和人 畜共患疾病的控制提供检测方法实时荧光定量PCR发展Digital PCRqPCR ArrayqPCR array? Gene Coponiea公司的All-in-OneTM Human Whole Genome miRNA Q-PCR Array ? Origene公司的TissueScan Tissue qPCR Arrays ? SABiosciences公司的 RT2 ProfilerTM PCR Array SystemThe End Thank You!实时荧光定量PCR原理-定量原理荧光定量PCR技术服务-绝对定量-上海基屹生物科技有限公司