Illumina_百度百科
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Illumina公司创立于1998年4月，是遗传变异和生物学功能分析领域的优秀的产品、技术和服务供应商。通过帮助客户加快实现生物信息的采集、分析和应用，来改善人类健康。北京时间日上午消息，美国权威杂志《麻省理工科技评论》(MIT Technology Review)于18日评出了“2014年度全球创新企业50强”，共有8家生物科技公司上榜，Illumina更是高居榜首。[1-2]
Illumina公司资料
Illumina组建人员
Illumina是由David Walt博士、CW 集团的Larry Bock、兽医学博士John Stuelpnagel、 Anthony Czarnik博士及Mark Chee博士于1998年4月共同组建。
Illumina技术开发
在与CW 集团风险投资公司合作期间，Larry和John在Tufts大学研究出了BeadArray技术，经过商议他们取得了该技术的专属授权。
Illumina上市时间
他们把Illumina的总部设于加利福尼亚的圣地亚哥，并于2000年7月首次公开上市。
Illumina大事记
1999年，Illumina只是一家拥有25人的初创公司，主要销售微阵列芯片(microarray chip)，这种芯片可用来检测基因组上特定部位的重要变化。
2007年，Illumina宣布以6亿美元收购基因测序公司Solexa，从而进军基因测序市场。Solexa的基因测试技术较竞争对手快百倍，且价格低廉。
2013年收购了无创产前诊断公司Verinata Health。自2005年以来，Illumina在并购领域的投资已超过12亿美元。
2014年1月，Illumina发布了新款高端基因测序仪，可以准确测出全基因组序列，而成本还不到1000美元。[2]
Illumina发展时间轴
1998年4月1日:Illumina公司成立[3]
Illumina由David Walt博士（Tufts University，BeadArray技术投资者）、Larry Bock（CW Group）、John Stuelpnagel、D.V.M.、Anthony Czarnik博士及Mark Chee博士创立。
1998年11月1日: 公司总体框架形成
Illumina成立时有7名员工，启动资金为860万美元，在加州圣迭戈10,000平方英尺的厂房内开始研发核心技术和知识产权产品。
1999年10月1日: 任命Jay Flatley 为 CEO
Jay Flatley作为总裁和首席执行官加入Illumina。
2000年7月1日:股票首次公开发行
Illumina的首次公开招募筹得超过1亿美元。
2001年上半年: 推出快速基因分形服务
Illumina利用其生产级的系统和GoldenGate基因分型技术提供基因分型服务。第一个服务合同是在2001年5月与葛兰素史克（GlaxoSmithKline）签订的。
2002年年中: 推出BeadLab 系统
Illumina可立即投入使用的全集成生产SNP基因分型系统作为一个商业化的解决方案，被全世界领先的基因分型机构引入。国际HapMap计划第1阶段中超过60%的数据都是利用该平台和GoldenGate检测产生的。
2003年9月1日: 推出基因表达阵列
Illumina推出了第二个遗传分析应用 – 基因表达谱分析。Illumina的基因表达阵列特有全球首个多样品芯片形式和行业中唯一的100%阵列QC。
2004年上半年: 推出BeadStation系统
随着BeadStation系统的上市，Illumina技术在全球核心实验室及研究人员中变得普及。BeadStation系统是一个台式解决方案，能运行DNA和RNA分析应用。Illumina的BeadStation通过其模块化的形式及综合选项，为遗传分析研究人员带来了可扩展性和灵活性。
2004年1月1日: 推出DASL Assay
Illumina推出了DASL检测，这是一种强大的新方法，能让部分降解的RNA样品（如福尔马林固定、石蜡包埋的样品）生成基因表达谱。福尔马林固定、石蜡包埋是一种保存生物活检样品的常用方法。光癌症一项，美国就有大约4亿个FFPE样品存在。
2005年2月1日: 收购CyVera
Illumina收购了CyVera公司，VeraCode技术的开发商。VeraCode技术是一种互补性的低-多重技术，适用于靶点验证和分子检测开发。
2005年2月5日: 推出全基因组基因表达阵列
Illumina推出全球首个多个样品、全基因组表达芯片。Human-6和HumanRef-8 BeadChip芯片带来了行业领先的质量和价格。
2005年年中: 推出Infinium全基因组基因分型
Illumina推出了Infinium检测。这是一款革命性的基因分型检测，能提供智能的SNP选择和基因组的无限调用。第一款Infinium产品 – Human-1 Genotyping BeadChip芯片在单张BeadChip芯片上包含了超过100,000个标记物。
2005年9月1日: 推出全基因组表达阵列
Illumina推出世界上首个小鼠这种重要的模式生物的全基因组表达阵列。
2006年1月1日: 推出Infinium HumanHap300 芯片
Illumina宣布HumanHap300 Genotyping BeadChip芯片的上市，它借助标签SNP内容在单张芯片上带来300,000个标记物。
2006年3月1日: Expansion of GoldenGate panels offered
Illumina扩展了标准的GoldenGate基因分型板，推出三种新板，分别用于MHC区域、癌症和样品质量评估。
2006年3月1日: 推出Infinium HumanHap550 芯片
Illumina宣布推出Infinium全基因组基因分型方面的第二张BeadChip芯片 – HumanHap550 BeadChip芯片，在单张芯片上有超过550,000个标记物。
2006年6月1日: 推出Infinium HumanHap550+ 和 iSelect 产品
Illumina宣布推出可定制的Infinium基因分型内容 - HumanHap550+和iSelect BeadChip芯片。
2006年6月1日: 推出Infinium HumanHap650Y 芯片
Illumina宣布推出Infinium全基因组基因分型方面的第三张BeadChip芯片 – HumanHap650Y BeadChip芯片，在单张芯片上有超过650,000个标记物以及丰富的非洲群体内容。
2006年8月1日: 推出合格服务供应商活动
Illumina推出一个对全球服务实验室进行认证的活动，以便利用其BeadArray技术提供基因分型和基因表达服务。
2006年9月21日: 推出大鼠全基因组基因表达阵列
Illumina推出世界上首个大鼠这种重要的模式生物的全基因组表达阵列。
2006年11月1日: 收购Solexa
Illumina宣布收购Solexa，一家基因组规模测序技术的开发商。合并后，Illumina提供终极的遗传分析工具组。
2007年1月10日: 推出高通量DNA甲基化癌症模板
Illumina推出GoldenGate Methylation Cancer Panel，它能够同时研究最多1536个甲基化位点。
2007年1月10日: 推出Infinium Human1M and Human450S 芯片
结合全基因组和拷贝数变异分析方面前所未有的内容水平，Human1M和Human450S BeadChip芯片在单张芯片上包含了额外的独特、高价值基因组目的区域。
2007年1月29日:Illumina被福布斯评为发展最快的科技公司
Illumina公布了五年内首次盈利的12个月，因此被福布斯评为发展最快的科技公司。
2007年3月12日: 推出Infinium HumanCNV370-Duo 芯片
通过与deCODE genetics合作开发，HumanCNV370-DUO是世界上首张专为靶定基因组内表现出拷贝数变异的新区域而设计的芯片。
2007年3月21日: 推出BeadXpress系统
利用独特内置数字微珠，VeraCode技术提供了高质量数据、广泛的多重分析能力以及检测灵活性。研究人员可一次分析单个样品中的十个至数百个分析物。
2007年4月16日: 推出自定义DNA甲基化
利用定制的DNA甲基化板，研究人员现在有权选择他们感兴趣的基因或基因区域，经济高效地同时研究96个样品的最多1536个精选甲基化位点。
2007年5月1日: 推出IlluminaConnect
IlluminaConnect是一个生物信息学软件合作计划，为加速数据整合和分析而建立。此计划让Illumina的客户与高级数据分析应用程序的第三方生物信息学供应商无缝连接，以便处理Illuina的阵列数据。
2007年6月11日: 提供行业内第一个数据库控制
iControlDB是首个行业拥有的基因分型对照库，适用于开展病例-对照全基因组关联研究的研究人员。
2007年7月24日: 推出数字基因表达
新的数字基因表达（DGE）应用（包括小RNA和基因表达谱分析）使用Illumina的Genome Analyzer来产生mRNA及小RNA的全基因组测序法表达谱。
2007年8月2日: 推出Infinium HumanHap550-Duo 芯片
HumanHap550-Duo BeadChip芯片是公司推出的第四个多个样品的DNA分析方案，适合全基因组关联研究。HumanHap550-Duo BeadChip芯片提供了与HumanHap550 BeadChip芯片相同的内容，但是是以两个样品的形式，这样通量显著增加，而每个样品的成本更低。
2007年9月6日: 推出Infinium HumanLinkage-12芯片
HumanLinkage-12 BeadChip芯片是Illumina第五张多个样品的Infinium BeadChip芯片，也是公司第一个利用12个样品形式进行连锁分析的标准板。
2007年10月22: 推出使用BeadArray技术的MicroRNA 测试
MicroRNA Assay for Gene Expression profiling是目前唯一一个仅以市场上其他方法一半的价格实现快速可重复的miRNA表达谱分析的工具，每个样品的价格为95美元。
2007年10月25日: 推出Infinium DNA 甲基化芯片
新的DNA Methylation BeadChip芯片检测每个样品的27,000个CpG位点，以单个CpG的覆盖度覆盖超过14,000个注释良好的基因。
2008年1月4日: 宣布公司重组
Illumina重组了经营结构，以便进一步利用测序和基因分型业务的协同优势。
2008年1月7日: 推出高密度产品线
Infinium HD Human1M-Duo（两个样品/芯片）和Human610-Quad（四个样品/芯片）特有每张BeadChip芯片上多达230万个单核苷酸多态性（SNP），让样品通量加倍，而DNA起始量降低了70%。
2008年1月15日: 发行Infinium BovineSNP50 芯片
Infinium BovineSNP50 BeadChip芯片是一个12个样品的基因分型产品，特有54,000个SNP，能检测任何牛品种的基因变异。
2008年2月6日:Illumina测出第一个非洲人基因组的序列
Illumina的科学家利用Genome Analyzer对一名匿名的非洲男性（来自尼日利亚的约鲁巴人）的基因组进行了测序。这项成果确立了Illumina测序技术在准确测序大且复杂的基因组上的直接作用。[4]
．生物探索[引用日期]
．中国生物技术信息网[引用日期]
．纳斯达克官方网站，SEC要求的信息披露[引用日期]
．Illumina官方网站[引用日期]生物秀人才网[]
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& & 第二代测序技术的核心思想是边合成边测序（Sequencing by Synthesis)，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列，现有的技术平台主要包括Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system. 第二代测序技术作为一种重要的实验技术，在中有着广泛的应用，尤其是在（表观）基因组学，宏基因组学，功能基因组学，，分子生态，疾病诊断...中。 虽然第二代测序技术的工作一般都由专业的商业公司来完成，但是了解测序原理、操作流程等会对后续的数据分析有很重要的作用。& & & &
& & 网上关于第二代测序技术的介绍也有很多，但大多局限于文字叙述，直观性不强，难以理解！本文以图片示意为主要方式，简述以Illumina/Solexa Genome Analyzer /Roche 454测序为代表的第二代测序技术的基本原理、操作流程等相关内容，希望能对各位有所帮助！
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第三代都出来了
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是的，三代2009年理论成熟，2010年调试，但至今仍有一些问题需要改进，精确度问题还未解决，价格也相当昂贵。但是二代却依旧如日中天。长远看来，一代，二代，三代将并存，各有千秋！
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谁要做二代测序的啊，可以找我，哈哈
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逛了这许久，何不进去瞧瞧？二代测序技术及其在转录组学研究中的应用-技术前沿-新闻中心-国家标准物质网
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二代测序技术及其在转录组学研究中的应用
【来源/作者】楚汉——泸州医学院 【更新日期】
1.二代测序技术的概况
自1964年首个基因完整核苷酸序列发表以来，测序技术对分子生物学的发展起到了巨大的推动作用。 Life Sciences公司推出了大规模平行测序平台GS20后，测序技术迈入了以高通量为主要标志的新纪元。目前，二代测序技术平台主要包括Roche(454)，Illumina(Solexa)和ABI平台。新一代测序技术发展了许多研究应用领域，如全基因组测序，外显子捕获测序，DNA．蛋白互作的Chip-Seq，活性调控区域鉴定的DNase—Seq，表观标记全基因组的methyl-Seq，转录组测序，数字表达谱的IⅢA-Seq及降解组测序等。
转录组(Transcriptome)广义上指某一生理条件下，细胞内所有转录产物的集合，包括信使RNA、核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA；狭义上指所有mRNA的集合。从转录组水平上整体研究植物体mRNA的响应变化，有助于从宏观上整体把握植物超积累的主要分子机制，同时也有助于从中挑选关键基因，深入开展研究，从而更好地理解植物超积累机制。Becher等(2004)率先使用基因芯片技术对A．halleri的转录组进行研究。Talke等(2006)利用基因芯片技术对比研究了A．halleri和A．thaliana转录组表达差异，从中鉴定出HMA4，豫乃，ZIPl0等关键基因。随后，QTL的方法也表明HMA4基因所在的位点是A．halleri上与镉耐性相关的关键基因，之后转基因实验也直接证实HMA4基因是A．halleri超积累的关键基因，它介导了重金属向地上部的转运，是植物超积累特性进化过程中的关键步骤(Hanikenne et a1．，2008)。由于Ⅳcaerulescells与thaliana具有较高的亲缘关系，基于A．thalina设计的基因芯片也被用于Ⅳcaerulescens及与A．halleri的对比研究之上(Hammond et a1．，2006；vail de Mortel eta1．，2006)。但由于东南景天与A．thaliana较远的亲缘关系，其基因序列相似度较低，该技术并不能很好地应用于东南景天。相较于以杂交方法为基础的基因芯片技术(Microarray)，二代测序技术对已知转录本的检测不受限制，不依赖于基因组序列，并可进一步对变异体形式进行鉴定、描述和量化研究：可进行正确的基因功能注释，定义单个核苷酸的基因转录边界和单核苷酸多态性的表达水平；且其“背景信号”检出率低于微阵列技术，许多在表达水平之上转录本的动态变化可被检测到；数据具有很高的重要性和再现性，因而受到越来越多的关注。
DNA测序（DNA sequencing）作为一种重要的实验技术，在生物学研究中有着广泛的应用。早在DNA双螺旋结构（Watson and Crick,1953)被发现后不久就有人报道过DNA测序技术，但是当时的操作流程复杂，没能形成规模。随后在1977年Sanger发明了具有里程碑意义的末端终止测序法，同年A.M.Maxam和W.Gilbert发明了化学降解法。Sanger法因为既简便又快速，并经过后续的不断改良，成为了迄今为止DNA测序的主流。然而随着科学的发展，传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要，对模式生物进行基因组重测序以及对一些非模式生物的基因组测序，都需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术，第二代测序技术（Next-generation sequencing)应运而生。这三个技术平台各有优点，454 FLX的测序片段比较长，高质量的读长（read）能达到400bp；Solexa测序性价比最高，不仅机器的售价比其他两种低，而且运行成本也低，在数据量相同的情况下，成本只有454测序的1/10；SOLID测序的准确度高，原始碱基数据的准确度大于99.94%，而在15X覆盖率时的准确度可以达到99.999%，是目前第二代测序技术中准确度最高的。虽然第二代测序技术的工作一般都由专业的商业公司来完成，但是了解测序原理、操作流程等会对后续的数据分析有很重要的作用，下文将以Illumina/Solexa Genome Analyzer 测序为例，简述第二代测序技术的基本原理、操作流程等方面。
目前，利用二代测序技术从转录组水平开展研究已有许多成功的先例，如Gordldn等(2007)对猪35个不同组织和3个不同发育阶段的EST进行转录组分析，结果表明，在大脑和睾丸组织中特异性的表达基因数量最多；在不同组织之间，基因表达量也不同，通过对EST的组装，最终达到48000个contigs和73000个singletons。Zhang等(2010)用8种不同水稻样品的不同组织不同时期混合建库，通过转录组技术分析了栽培稻的第一张转录组图谱，结果在水稻8种组织样品中检测到大约27000个基因的表达和38000个转录单元，证实了约9000个基因发生可变剪接，同时鉴定出了234个由反式剪接产生的转录整合基因，表明整合基因比预期的更为普遍。Wu等(2010)用葡萄接种霜霉病后采集的4-8叶片混合样通过Solexa技术测序获得了15249个候选差异表达基因。但这一技术目前在超积累植物上的研究和应用还几近空白。
2.二代测序操作流程
（1）测序文库的构建（Library Construction）
首先准备基因组DNA（虽然测序公司要求样品量要达到200ng，但是Gnome Analyzer系统所需的样品量可低至100ng,能应用在很多样品有限的实验中），然后将DNA随机片段化成几百碱基或更短的小片段，并在两头加上特定的接头（Adaptor）。如果是转录组测序，则文库的构建要相对麻烦些，RNA片段化之后需反转成cDNA，然后加上接头，或者先将RNA反转成cDNA，然后再片段化并加上接头。片段的大小（Insert size）对于后面的数据分析有影响，可根据需要来选择。对于基因组测序来说，通常会选择几种不同的insert size，以便在组装（Assembly）的时候获得更多的信息。
（2）锚定桥接（Surface Attachment and Bridge Amplification）
Solexa测序的反应在叫做flow cell的玻璃管中进行，flow cell又被细分成8个Lane，每个Lane的内表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的DNA 片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。
（3）预扩增（Denaturation and Complete Amplification）
添加未标记的dNTP 和普通Taq 酶进行固相桥式PCR 扩增，单链桥型待测片段被扩增成为双链桥型片段。通过变性，释放出互补的单链，锚定到附近的固相表面。通过不断循环，将会在Flow cell 的固相表面上获得上百万条成簇分布的双链待测片段。
（4）单碱基延伸测序（Single Base Extension and Sequencing）
在测序的flow cell中加入四种荧光标记的dNTP 、DNA聚合酶以及接头引物进行扩增，在每一个测序簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的dNTP就能释放出相对应的荧光，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。从荧光信号获取待测片段的序列信息的过程叫做Base Calling，Illumina公司Base Calling所用的软件是Illumina’s Genome Analyzer Sequencing Control Software and Pipeline Analysis Software。读长会受到多个引起信号衰减的因素所影响，如荧光标记的不完全切割。随着读长的增加，错误率也会随之上升。
（5）数据分析（Data Analyzing）
这一步严格来讲不能算作测序操作流程的一部分，但是只有通过这一步前面的工作才显得有意义。测序得到的原始数据是长度只有几十个碱基的序列，要通过生物信息学工具将这些短的序列组装成长的Contigs甚至是整个基因组的框架，或者把这些序列比对到已有的基因组或者相近物种基因组序列上，并进一步分析得到有生物学意义的结果。
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【关键词】二代测序技术 转录组 分子生物学 平行测序平台
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Illumina平台测序原理及常见测序文库构建
Illumina 平台测序原理及常见几 种测序文库构建流程简介目录第一部分：测序测序原理与流程 简介文库构建(~ 6 hrs)DNA1-8 samplescBot HiSeq2500 MiSeq1-8 samplesHiSeq2000 HiSeq2500 GA IIx MiSeq HCS/RTA ICS MSR CASAVA BaseSpaceIllumina 测序流程文库构建(~ 6 hrs)DNA1-8 samplescBot HiSeq2500 MiSeq1-8 samplesHiSeq2000 HiSeq2500 GA IIx MiSeq HCS/RTA ICS MSR CASAVA BaseSpace文库构建流程片段化 DNA 末端补平 3’加A 接头连接 PCR高质量DNA文库结构Index Sequencing Primer 此单链部分与 FlowCell表面上P7接 头相同此单链部分与 FlowCell表面上P5接 头相同文库构建的目的是在目的DNA片段两端都连接上想要 的接头文库构建(~ 6 hrs)1-8 samplescBot HiSeq2500 MiSeq1-8 samplesHiSeq2000 HiSeq2500 GA IIx MiSeq HCS/RTA ICS MSR CASAVA BaseSpace测序芯片 (Flow Cell)简介在flow cell上进行cluster簇生成flow cell是有2个或8个泳道(Lane)的 玻璃片，与一元硬币的厚度相当每个泳道(Lane)内的上下两个表面 随机的布满了能够与文库两端接头 分别互补配对的寡核苷酸(oligos,P7 和P5接头)仪器简介 单条DNA 模板35个循环的桥式PCR约1000条 DNA模板的 拷贝cBotHiSeq SequencercBot 工作流程DNA文库变性：使用NaOH将双链DNA文库变性为单链 模板链杂交： 第一链合成： 将单链DNA模板杂交到Flow Cell 上 以Flow Cell 表面上的oligos为引物， 合成第一链 冲走单链DNA模板，以合成的第一链 为模板进行35循环的桥式PCR 将与P5接头连接的DNA链从Flow Cell 上去除 防止在后续测序过程中继续延伸DNA链 杂交测序引物桥式PCR： 线性化： 阻断3’COH：DNA模板杂交和一链合成接头序列单链DNA分子与FlowCell 表面的对应接头杂交 以杂交的单链DNA为模板， FlowCell上的接头为引物， 合成第一链含有P7和P5两种接头 的FlowCell表面 5’-3’ 延伸双链DNA变性新合成的链 原始模板链模板链被冲洗走丢弃原始模板链新合成的链留在FlowCell 上桥式PCR扩增单链DNA与FlowCell表面对应接头杂 交，形成“桥”以接头为引物进行扩增桥式PCR扩增变性变性双链的“桥”得到与FlowCell相连的两条互补 的单链DNA分子第二轮桥式PCR扩增完成桥式PCR扩增完成28循环的桥式PCR线性化双链“桥”变性为单链红色箭头为P5接头上的 切割位点线性化切割并冲走与P5接头相连的那 条DNA链阻断阻断3’ COH杂交Read 1 引物将测序引物杂交到文库的接头上Read1 测序引 物Illumina 测序流程文库构建(~ 6 hrs)1-8 samplescBot HiSeq2500 MiSeq1-8 samplesHiSeq2000 HiSeq2500 GA IIx MiSeq HCS/RTA ICS MSR CASAVA BaseSpaceHiSeq SBS 测序流程进行Read1 测序 杂交Index 测序引物，进行Index 测序 Paired End Turnround，合成Read1互补链 杂交Read 2 测序引物，进行Read 2 测序HiSeq SBS 测序流程13Paired End Turnaround2Sequencing By Synthesis，SBS测序原理4种 Fl-NTP’s + 聚合酶拍照，收集信号去阻断，切除荧光基团X 36 - 151可逆终止化学反应? ? ?一次加入4种修饰的dNTP(可逆终止子) 准确度高 可以得到同聚物序列下一个碱基合成? 合成 ? 照相，收集信号 ? 去阻断，切除荧 光基团Clusters100 MicronsPaired End TurnroundBlocked 3’-ends已完成测序合成的片段变性掉已完成测序合成的 片段恢复被阻断的3’ COHPaired End Turnround桥式PCR形成的 桥5’-3’延伸5’-3’延伸Paired End Turnround形成的双 链的桥Paired End Turnround等温变性，完成15轮桥式 PCR后，进行线性化，将模 板链切除，保留新合成的子 链模板链Paired End Turnround3’ -OH阻 断 Read2测序引 物线性化，3’ -OH阻断杂交Read2测序引物新合成的 链Sequencing By Synthesis 2nd Read4种 Fl-NTP’s + 聚 合酶拍照，收集信号去阻断，切除荧光基团X 36 - 151Illumina 测序流程文库构建(~ 6 hrs)1-8 samplescBot HiSeq2500 MiSeq1-8 samplesHiSeq2000 HiSeq2500 GA IIx MiSeq HCS/RTA ICS MSR CASAVA BaseSpace第二部分：常见文库构建流程简 介文库分类DNA类文库? DNA小片段文库 ? DNA大片段文库 ? Exon文库 ? PCR-Free文库? 简化基因组文库、单细胞样本 文库等RNA类文库? 转录组文库 ? 表达谱（RNA-Seq） ? Small RNADNA小片段文库? DNA小片段文库 ? 片段大小在1Kb以下的普通DNA文库 （200bp,350bp,500bp…） ? DNA小片段文库可用来进行人重测序，动植物、 微生物的de novo和重测序，16s rRNA测序， 宏基因组测序等项目类型的文库构建。DNA小片段建库流程DNA小片段建库流程DNA小片段建库流程DNA小片段建库流程DNA大片段文库? DNA大片段文库，又名末端配对（mate-paired） 文库 ? 片段长度大于1K bp。 ? 主要用于动植物，微生物的de novo 测序DNA大片段文库建库流程DNA大片段文库建库流程为什么要建大片段文库Exon文库? 人类外显子组总共约30Mb，占全 部人类基因组约1%。 ? 外显子具有高度的保守型，且大部 分疾病的致病位点位于外显子区。 ? 外显子测序是指利用序列捕获技术 将外显子区域DNA捕捉并富集后 进行高通量测序的基因组分析方法。 ? Exon文库主要用于人全外显子测 序和目标区域测序Exon文库流程外显子捕获方式? 液相杂交? 液相杂交是通过在溶液中， 利用链碱基配对的原理， 将DNA片段与探针杂交， 然后洗脱，富集目的片段。Exon测序特点? 优点：? 1、 与全基因组测序相比，外 显子测序具有测序覆盖度更深、 数据准确性更高、花费成本更 低等优势，对研究已知基因的 SNP、Indel等具有较大的优势。? 不足：? 1、与全基因组测序相比，不能 检测到基因组内较大的结构性 变异。 ? 2、与转录组测序相比，不能检 测到新的基因。PCR-Free文库? PCR-Free文库，顾名思义，就是在文库构建过 程中不需要进行PCR的文库。 ? 主要是针对一些特殊样本，比如GC含量高， PCR扩增困难的样本；PCR产物。 ? 不足： 所需的样本起始量较多。PCR-Free文库与普通文库比较简化基因组(RAD-seq )文库? RAD-seq 即基于酶切的简化基因组测序技术，是指利用 限制性内切酶对基因组进行酶切，结合一定大小的插入片 段文库，对其进行高通量测序，快速鉴定高准确性的变异 标记（SNPs）信息的技术 ? 与传统技术相比，该类技术操作简单、不受参考基因组限 制、可简化复杂基因组；另外，基于SNPs 的分子标记技 术性价比高，稳定性好，在基因组中分布更加广泛，特别 是适合大样本量的分析。简化基因组文库建库流程转录组文库转录组测序的研究对 象为特定细胞在某一 功能状态下所能转录 出来的所有mRNA。 应用： 转录本的种类和基因 定量 基因的转录结构 可变剪切 发现新的转录本总RNA 真核生物 利用Oligo (dT)富 集mRNA 原核生物 去除 rRNA将mRNA 随机打断成 ~200 nt 随机引物六聚体反转 录合成cDNA 末端修复，加A，加 接头后PCR扩增 Illumina 测序链特异性转录组建库? 使用ssRNA-seq可以确定转录本是来自正链还是负链。以 便更加准确的获得基因的结构以及基因表达信息，并且发 现新的基因。 ? 很多基因组区域具有正负链的转录本，反义转录是真核基 因的一个特征，是一种重要的调控方式。链特异性转录组建库常规转录组建库方法基 础上，在合成第二条 cDNA链时，替换dTTP 为dUTP，加上接头后降 解含dU的DNA单链。均一化（DSN）建库方法：构建常规转录组文库，库检合格后取80-100ng文库进行DSN处 理，然后PCR再次出库。目的：减低高丰度表达基因，有效富集低丰度表达基因。DSN酶：双链特异性核酸酶(Duplex-Specific Nuclease, DSN)，能够选 择性降解双链DNA和DNA-RNA杂交体中的DNA,由于高丰度的基因形 成双链的速度较快，所以降解也比较多。RNA-Seq? 是用来研究某一生 物对象在特定生物 过程中基因表达差 异的技术，具有定 量准、可重复性高 、检测范围宽、成 本低等特点。总RNA 真核生物 利用Oligo (dT)富集 mRNA 原核生物去除 rRNA将mRNA 随机打断成 ~200 nt 随机引物六聚体反转录合 成cDNA 末端修复，加A，加接头后 PCR扩增 Illumina 测序RNA-Seq 与常规转录组区别RNA-Seq 转录组应用用于基因表达丰度 用于拼接（＞1G 检测 数据量） SE： 50+8 全程磁珠纯化 PE： 91+8+91 切胶回收测序类型 建库方法 插入片段弥散（主峰250330）单一条带Small RNA 文库◆18-30nt范围内的RNA 结构上5’端主要以尿嘧啶开始 与mRNA的降解、翻译抑制（基因沉默）以及形 成异染色质有关◆◆◆调控细胞生长、发育、基因转录和翻译等生物过程 包括siRNA , microRNA和piRNA◆Small RNA 文库建库流程谢谢！欢迎一起讨论！}