【图文】细胞凋亡、周期检测_百度文库
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细胞凋亡、周期检测
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& 钙荧光探针 Fluo 3-AM
别名 : 钙荧光探针 钙离子探针
英文名称 : Fluo 3-AM
分子式 : C51H50Cl2N2O23
分子量 : 1129.85
储存条件 : -20°C干燥避光保存，有效期12个月
纯度 : ≥90%(HPLC)
外观（性状） : 红色粉末
商品货号：
商品品牌：
基本售价：
Fluo-3，AM ester是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fluo-3，AM ester进入细胞后可以被细胞内源性酯酶剪切形成Fluo-3，从而被滞留在细胞内。Fluo-3可以和钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光，最大激发波长为506 nm，最大发射波长为526 nm。Fluo-3，AM ester的一个重要作用是其在高通量药物筛选中的应用。
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疑问：以前拿回细胞后，传代、冻存后复苏过几次都没什么问题，最近因实验室孵箱污染，清洁消毒细胞室后，重新复苏，结果连续复苏6支，细胞均未贴壁，今晚复苏6小时后观察有一瓶相对贴壁细胞数较之前复苏失败瓶多，但贴壁细胞状态不好，形态不佳，透光度亦不好!急求各位大侠会诊指导!
分析1:复苏过程没有问题，是否是从液氮拿出直接放入温水，还有培养箱，二氧化碳浓度，培养基、PH值等环节。要么加高浓度FBS 15-20%，看看能否帮助贴壁，当然也需要考虑问题，还有确信拿来的细胞没问题。
分析2:首先应该怀疑冻存，实际上复苏出问题的可能非常小，因为操作简单，而且死板。
1、你冻存的时候是不是消化的时间过长，这是一般人所注意不到的，即使书上也不讲这个问题，但我因为这个问题就两种肺癌细胞和一种肝癌细胞专门做过试验，这个绝对是绝大部分人细胞复不活的一个原因。太长的消化时间会让细胞复苏时失去贴壁能力，表现为先贴后死，原因是在你复苏的时候细胞已进入凋亡程序，不可逆转的死亡。
2、你的冻存液好不好，是什么，甘油还是DMSO，质量非常重要，否则也会死亡。
3、你的冻存液的量加的是不是太多，ATCC推荐是不超过7%，大于5%，太多也不好。
4、你在冻存的时候是不是把DMSO混均匀，这个有一些影响，但不算太大。
5、你的冻存是否按部就班，就是所温度梯度是不是把握严格，很多人容易忘却这个事情，因为这个东西流程长。
6、如果你细胞污染，你是否能很快看到，我比我的导师能早一天看到污染。从这个角度讲建议去除离心这步。
7、你的细胞在冻存前是否过密。
还有，不赞成孵箱污染这个概念的，所有在一个孵箱里的细胞都污染一个细菌的话，这个细菌是源于孵箱的，但这不代表孵箱污染，因为孵箱无论你如何处理都有大量的细菌，问题在操作。我们的细胞房不换拖鞋，非常脏，别人的细胞都污染，很多细胞都污染到绝种，但我的只污染一次(两年内只有两瓶)，那次是因为别人给我动了，我每次细胞摆放顺序都是记住的。如果你老怀疑孵箱污染，那说明你在养细胞这方面很差。
每次污染的原因都要尽可能的找，以后就不犯同样的问题，这个很重要，不能靠猜，否则你就有可能细胞养绝最后换课题，这个见得太多了，别不当会事。
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等你回答的问题：Fluo-3,AM-荧光钙探针
发布时间：
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　Fluo-3, AM
　　CAS#：-5
　　中文名：钙荧光探针Fluo-3, AM
　　英文名：1-[2-Amino-5-(2,7-dichloro-6-hydroxy-3-oxo-9-xanthenyl)phenoxy]-2-(2- amino-5-methylphenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid, pentaacetoxymethyl ester
　　结构式：
　　分子式：C51H50Cl2N2O23
　　分子量：1129.85
　　性质：
　　1. 外观：红色粉末
　　2. 纯度：≥90%(HPLC)
　　3. 产品描述：
　　Fluo-3, AM是最常用的检测细胞内钙离子浓度的荧光探针之一。它穿透细胞膜进入细胞后被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而被滞留在细胞内，Fluo-3若以游离配体形式存在时几乎是非荧光性的，但是当它与细胞内钙离子结合后可以产生较强的荧光，最大激发波长为506nm，最大发射波长为526nm。实际检测时推荐使用的激发波长为488nm左右，发射波长为525～530nm。可以使用激光共聚焦显微镜或流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度的变化。
　　4. 操作说明(for Human T cells)*
　　(1) 试剂
　　2 mM的Fluo-3, AM/DMSO(将1mg Fluo-3, AM溶于442&L DMSO)
　　Pluronic F127
　　Hanks&#8226;balanced salt solution(HBSS)
　　HEPES buffer saline(10mM HEPES，1mM Na2HPO4，137mM NaCl，5mM KCl，1mM CaCl2，0.5mM MgCl2，5mM glucose，0.1% BSA，pH 7.4)
　　(2) 操作
　　①. 向Fluo-3, AM/DMSO溶液中加入16.5mg Pluronic F127，Pluronic F127可以 防止Fluo-3, AM在HBSS中聚合并能帮助其进入细胞。
　　②. 用HBSS稀释Fluo-3, AM溶液，制备4&M的Fluo-3, AM工作液。
　　③. 将Fluo-3, AM工作液加入细胞，在37℃培养20分钟。
　　④. 加入5倍体积的含有1%胎牛血清的HBSS，再继续培养40分钟。
　　⑤. 用HEPES buffer saline洗涤细胞3次，然后用HEPES buffer saline使细胞重悬浮，制成1×105 cells/mL的溶液。
　　⑥. 37℃下培养10分钟，然后用该细胞进行荧光钙离子检测。激发波长506nm，发射波长526nm。
　　*标记的条件因细胞种类而异，在每次实验前，请先确定最佳条件。以上方法仅供参考。
　　储存条件：-20℃干燥避光保存，有效期一年。
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