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基因克隆是对分离出来的目的基因进行大量扩增的过程。经过基因克隆，可以生产出大量的目的基因或在基因表达时获得大量的蛋白质。细菌质粒是基因克隆的合适载体，经研究发现，某些细菌质粒中含有两个抗生素抗性基因——氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，而且，在四环素抗性基因中存在限制酶的单一识别序列。
下图表示利用质粒进行基因克隆的过程，其中A-D表示物质，I和II表示抗性基因，①—⑦表示过程，其它数字表示菌落，据图回答下列问题：
（1）写出下列字母和编号的名称：A：&&&&&
&&&； II：&&&
&&&&&&。
（2）将A和B形成D所需的酶是&&&&&&& 。⑤过程中为提高成功率，常用&&&&&&&
溶液处理大肠杆菌。
（3）为筛选含有物质A的细菌，需进行细菌培养，先在培养基（一）中只加入氨苄青霉素，一段时间后，培养基上长出的细菌菌落具有&&&&&&& 特性。然后，用灭菌绒布从培养基（一）中蘸取菌种，再按到只含四环素的培养基（二）中培养。根据培养基（一）和（二）上的细菌生长情况，可以判断图中菌落&&&&&&& （填数字）即为筛选出的含有物质A的细菌，原因是&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&。
（1） 目的基因
氨苄青霉素抗性基因
（2） 限制酶和DNA连接酶
（3）抗氨苄青霉素
由于目的基因破坏了四环素抗性基因，使受体细胞不能在含有四环素的培养基上生长，所以该菌落就是筛选的含有目的基因的菌落（2分）
【解析】（1）如图A表示目的基因，由于在四环素抗性基因中存在限制酶的单一识别序列，所以II表示氨苄青霉素基因。
...
考点分析：
考点1：基因工程、生物技术的安全性和伦理问题
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&&&&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
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；而在培养形成完整新个体过程中，对它们的调控关键是&&&&&& &&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&。
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（1）在番茄新品种的培育过程中，将目的基因导入受体细胞的方法叫做& &&&&&&&&。
（2）从图中可见，mRNAl和mRNA2的结合直接导致了& &&&&&&&&&&&&&&&无法合成，最终使番茄获得了抗软化的性状。
（3）普通番茄细胞导入目的基因后，经③过程形成& &&&&&，然后诱导出试管苗，进一步培养成正常植株。
（4）如图甲，获得目的基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的& &&&&处，DNA连接酶作用于& &&&&&处。（填“a”或“b”）
（5）如图乙是该目的基因表达过程中的一个阶段，图中3和4的核苷酸相同否？&&&
说明理由& &&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&。
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题型：综合题
难度：简单
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满分5 学习网 . All Rights Reserved.重组DNA技术（分子克隆）技术方案中国教育装备采购网围观89次我要分享
　　DNA又称基因工程(Genetic Engineering)。这项技术是在体外按照一定的目的和方案对DNA 分子进行人工操作，将同一来源或异源的基因进行重组，然后把它们引入适当受体细胞中，随着该细胞的繁殖，DNA 重组体得到扩增，并同时得到表达。这样就可以获得大量重组DNA 的产物。重组DNA 技术又称为分子克隆(MolecularCloning)。克隆一词原意为一个个体经无性繁殖得到后代的总和。而分子克隆是将单一基因引入适当的受体细胞中，使其进行复制，从而得到重组DNA的大量拷贝。
　　(一)重组DNA常用的工具酶
　　将 DNA 在体外切割成小片段，然后再进行重组，这需要一系列酶的参加。这些酶称为工具酶。常用的工具酶有以下几种。
　　l.限制性内切酶(Restriction Endonuclease ) 能识别和切割双链DNA分子内特异核苷酸序列的酶称为限制性核酸内切酶。限制性核酸内切酶都是从原核生物中发现的，其天然生物学功能是构成细菌抵抗外源入侵DNA 的防御机制。限制性核酸内切酶常分为三种类型： I型限制性核酸内切酶对DNA链的识别位点与切割位点不同，不能产生特异性DNA 片段;II 型限制性核酸内切酶能识别与切割DNA 链上同一个特异性核苷酸序列，产生特异性的DNA片段;III型限制性核酸内切酶虽有特异性切割位点，但其有多个亚基并分别由不同的基因编码。故I和III型内切酶作为工具酶的意义不大，通常所说的限制性核酸内切酶即是II 型酶。已经从250 多种微生物中分离到约400 种限制性核酸内切酶，它们识别的DNA序列一般含4～6 个核苷酸，切割时有的产生平头末端，有的产生粘性末端。限制性核酸内切酶是基因操作中最重要的工具酶。
　　2.DNA连接酶能将两个DNA片段拼接起来的酶叫做DNA连接酶。DNA 连接酶不但在DNA复制(如冈崎片段的连接)和DNA修复中起作用，在DNA的体外重组中也用于连接两个DNA的片段。
　　3.逆转录酶逆转录酶在RNA病毒的复制中起作用。在分子克隆技术中利用这种酶的活性将mRNA 经逆转录合成互补DNA(cDNA)，cDNA 比mRNA 稳定，易于操作。
　　4.其他酶类在分子克隆技术中依据实验设计的需要，可选择各种其他催化作用不同的酶类。如末端转移酶、DNA聚合酶等。
　　(二)重组DNA中常用的载体
　　克隆载体(Cloning Vector)是另一种DNA分子，它能携带外源基因(目的基因)进入受体细胞，并在受体细胞内复制和表达。克隆载体具有某些遗传特性，如抗药性、噬菌斑等。最常用的载体为以下几种：
　　1.质粒(Plasmid) 是细菌染色体外能自主复制的小分子DNA，多为环形双链。质粒带有某些遗传性状，如对某些抗生素的抗性。可根据质粒的特性筛选携带有目的基因的受体菌。由于质粒有自我复制的能力，质粒在细胞分裂时可被保持恒定的传给子代细胞，能使携带的目的基因遗传下去。最初常用的质粒为pBR322。
　　2.噬菌体(Phage) 由于噬菌体可以感染细菌，并在细菌内复制，故它们也可以作为克隆的载体。常用的噬菌体如&DNA。
　　3.病毒病毒能感染真核生物，并在宿主细胞中进行复制。经过适当改造后可以作为载体。常用的SV40是一种猴病毒。
　　4.酵母人工染色体(YAC) 这是由酵母基因和质粒pBR322人工拼接的载体。这种载体能携带大片段DNA(102～103kb)，能在大肠杆菌中复制，同时带有酵母基因组的基本功能单位。在人类基因组研究中是很有用的工具。
　　(三)基因工程的基本过程
　　基因工程大体可分为以下几个步骤：目的基因的制备，载体DNA 的选择及制备，目的基因与载体DNA 在体外重组，重组DNA 分子导入受体细胞，筛选鉴定含有重组分子的受体细胞，扩增重组分子和目的基因的表达与鉴定。
　　1.目的基因获得目的基因的常用方法包括：①从染色体DNA经限制酶切成所需的DNA 片段; ②逆转录反应，以mRNA 为模板，在逆转录酶的作用下，从mRNA合成互补DNA即cDNA; ③较短的核苷酸序列可利用DNA自动合成仪按已知多肽链中氨基酸编码的核苷酸序列，人工合成目的基因; ④利用PCR 技术，体外扩增所需的目的基因。
　　2.载体DNA的选择及制备根据目的基因的性质选择不同的载体，并将载体纯化及用限制性内切酶处理。
　　3.目的基因与载体DNA在体外重组利用DNA连接酶将目的基因及载体DNA在体外连接成重组DNA。
　　4.重组DNA引入受体细胞通过物理与化学的方法可将重组DNA引入受体细胞，并在受体细胞内进行表达。重组质粒DNA 分子引入受体细胞的过程称为转化，重组噬菌体与病毒引入受体细胞的过程称为转染。
　　5.筛选及鉴定利用载体DNA的遗传标记与目的基因的某些特性筛选含有重组子的受体细胞及鉴定重组子。
　　6.扩增重组子及目的基因表达重组DNA分子在受体细胞中能自主复制，使目的基因得到扩增，并经转录与翻译，表达和分泌有生物活性的蛋白质，此蛋白质即为所需要的基因工程产物。
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来源：作者：责任编辑：黄磊
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&&&&&&&&&&&&&&&新基因克隆 在 生物学 分类中
的翻译结果:
查询用时：3.374秒
&在分类学科中查询
&&&&Strategy of specific gene's homologous novel gene cloning based on Internet bioinformatic resource
&&&&基于Internet网生物信息资源特定基因同源新基因克隆策略
&&&&In this paper, we will give a brief introduction of Internet bioinformatic resource and novel gene cloning strategy, including a more detailed description for cloning strategy of the novel gene which is the homologous gene of a specific gene, based on EST and genome database.
&&&&作者在简单介绍网上生物信息资源以及新基因克隆策略的同时,着重对基于EST数据库和基因组数据库特定基因的同源新基因克隆策略进行了详细阐述。
&&&&The Role of Biological Information Study in Cloning of New Gene
&&&&生物信息学在新基因克隆中的应用
&&&&Cloning of Human Novel Gene
&&&&人类新基因克隆
&&&&Cloning a Novel 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate Synthase Gene Conferring Increased Glyphosate Tolerance from Halomonas Variabilis and Its Expression in Escherichia Coli and Its Glyphosate-tolerant Mechanism
&&&&可变盐单胞菌中草甘膦抗性EPSP合酶新基因克隆、大肠杆菌表达及其抗性机制的研究
&&&&Strategy of rapidly searching ESTs homologous to cancer genes and gene cloning through bioinformatics
&&&&运用生物信息学方法快速获取与肿瘤基因同源的EST及其新基因克隆的策略
&&&&Besides, using homology among genes to clone new members of gene families becomes an efficient strategy.
&&&&利用这种基因间的同源性,有目的的克隆基因家族新成员,已经成为新基因克隆的有效策略。
查询“新基因克隆”译词为用户自定义的双语例句&&&&我想查看译文中含有：的双语例句
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目的基因亚克隆
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所谓亚克隆就是对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。亚克隆的基本过程包括：(1)目的DNA片段和载体的制备；(2)目的DNA片段和载体的连接；(3)连接产物的转化；(4)重组子筛选。
一、试剂准备1．LB液体培养基：胰化蛋白胨（细菌培养用）10g，酵母提取物（细菌培养用） 5g，NaCl 10g，加ddH2O 至1000ml，完全溶解，分装小瓶，15lbf/in2高压灭菌20min。2．1.5%琼脂LB固体培养基: 称取1.5g琼脂粉放入300ml锥形瓶,加100ml LB，15 lbf/in2 高压灭菌20min，稍冷却，制备平皿。3．IPTG、X-Gal4．0.1M MgCl2 ：15 lbf/in2高压灭菌20min，0℃冰浴备用。5．0.1M CaCl2（以20%甘油水溶液配制）：15 lbf/in2高压灭菌20min，0℃冰浴备用。6．限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶。
二、目的DNA片段和载体的制备选择适宜的限制性核酸内切酶，消化已知目的DNA和载体，获得线性DNA，用于重组。根据目的DNA和载体的具体情况，选择一种或者两种适当的限制酶切割，分别产生对称性粘性末端（用一种限制性内切酶进行消化而产生带有互补突出端）、不对称粘性末端（用两种不同的限制性内切酶进行消化而产生带有非互补突出端）、平端。在亚克隆时，首选不对称相容末端连接，次选对称性粘性相容性末端连接，由于平末端连接效率较低，通常很少采用。但有时目的片段的末端与载体不匹配 ，一般先将不匹配末端补平，然后再以平末端连接。
三、利用T4 DNA连接酶进行目的DNA片段和载体的体外连接（一）连接要求和结果
外源DNA片段末端性质
不对称粘性末端
两种限制酶消化后，需纯化载体以提高连接效率
载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；非重组克隆的背景较低；外源DNA可以定向插入到载体中。
对称性粘性末端
线形载体DNA常需磷酸酶脱磷处理
载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；外源DNA会以两个方向插入到载体中。
要求高浓度的DNA和连接酶
载体与外源DNA连接处的限制酶切位点消失；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；非重组克隆的背景较高 。
带有相同末端(平端或粘端)的外源DNA片段必须克隆到具有匹配末端的线性质粒载体中,但是在连接反应时,外源DNA和质粒都可能发生环化,也有可能形成串联寡聚物。因此，必须仔细调整连接反应中两个DNA 的浓度，以便使&正确&连接产物的数量达到最佳水平，此外还常常使用碱性磷酸酶去除5&磷酸基团以抑制载体DNA的自身环化。利用T4 DNA连接酶进行目的DNA片段和载体的体外连接反应，也就是在双链DNA 5&磷酸和相邻的3&羟基之间形成新的共价键。如载体的两条链都带有5&磷酸（未脱磷），可形成4个新的磷酸二酯键；如载体DNA已脱磷，则只能形成2个新的磷酸二酯键，此时产生的重组DNA带有两个单链缺口，在导入感受态细胞后可被修复。（二）T4 DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案1．连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。2．10&l体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为1∶1-1∶5），补足ddH2O 至8&l。3．轻轻混匀，稍加离心，56℃水浴5min后，迅速转入冰浴。4．加入含ATP的10&Buffer 1&l，T4 DNA连接酶合适单位， 用ddH2O 补至10&l，稍加离心，在适当温度（一般14-16℃水浴）连接8-14hr。
四、连接产物的转化1.感受态细胞的制备⑴ 保存于-70℃的DH5&（或其他菌种）用接种环划菌于1.5%琼脂平板上，37℃恒温倒置培养至单菌落出现（约14-16 hr）。⑵ 挑取单菌落，接种于2.0ml LB液体培养基中，37℃恒温，250g振荡培养过夜（约12hr）。⑶ 取0.5ml 过夜培养液，接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2-2.5hr，至OD600为0.4-0.5时，放置于4℃冰箱冷却1-2hr。（注：以下操作均应在冰浴中进行。）⑷ 将培养液分入两个50ml离心管中，4℃离心，4000g&10min，弃去上清，用冰浴的0.1M MgCl2 25ml悬浮30min。⑸ 4℃离心,4000g&10min，弃去上清，加入冰浴的0.1M CaCl2-甘油溶液1ml悬浮。⑹ 以100&l/管分装入1.5ml离心管中，-70℃冻存备用。注：此法制备感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒DNA产生5&106-2&107个菌落，这样的转化效率足以满足所有在质粒中进行的常规克隆的需要，制备的感受态细胞可贮存于-70℃，但保存时间过长会使转化效率在一定程度上受到影响，一般三个月以内转化效率无多大改变。2. 连接产物的转化⑴ 取100&l贮存于-70℃钙化菌，冰浴化开；⑵ 加入适量连接产物（一般不超过10&l，轻轻混匀，冰浴20min；⑶ 于42℃热休克90s，迅速转移至冰浴中，继续冰浴2-3min；⑷ 加入LB液体培养基200&l，于37℃缓摇孵育45min；⑸ 将培养物适量涂于1.5%琼脂LB平板（根据质粒性质添加抗生素或/和X-Gal/IPTG），待胶表面没有液体流动时，37℃温箱倒置培养12-16hr。
五、重组子的筛选根据载体的遗传特征筛选重组子，如&-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有&-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到&-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码&-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为&-互补。由&-互补而产生的LacZ 细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无&-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。
六、注意事项1. 目的DNA片段制备、回收、纯化时，应避免外来DNA污染。2. 不同厂家生产的T4 DNA连接酶反应条件稍有不同，但其产品说明书上均有最适反应条件，包括对不同末端性质DNA分子连接的T4 DNA连接酶的用量、作用温度、时间等。同时提供有连接酶缓冲液（10&、5&、2&），其中多已含有要求浓度的ATP，应避免高温放置和反复冻融使其分解。2. 连接产物的转化：细菌细胞经特殊试剂处理后在适当的条件下具有接收外源DNA的能力，因此可将上述连接产物通过热刺激或电脉冲转化感受态细胞，当细菌大量增殖的同时，导入的重组DNA也得到增殖。3. 制备感受态细胞所用离心管、培养瓶最好经酸碱处理或使用新的，15 lbf/in2高压灭菌20min。5. 白色菌落中重组质粒内插入片段是否是目的片段需通过鉴定。
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