454高通量测序方法
取适量污泥发酵混合液在10000rpm条件下离心5min， 然后使用OMEGA 公司 E.Z.N.A Soil DNA试剂盒抽提基因组DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA合格后，利用引物27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和533R(5’-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’) 对细菌的16S rRNA的V1-V3区域扩增。
PCR 采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20μl反应体系包括：4 mL
5× FastPfu Buffer, 2.0 mL 2.5 mM dNTPs, 0.4 mL 前引物, 0.4 mL 反向引物，10.0 ng DNA 模板以及0.4 mL FastPfu Polymerase (TransStart FastPfu DNA Polymerase,TransGen).
PCR扩增程序如下：先在95℃反应2min，然后进入扩增循环，每一次扩增循环分别在95℃，55 ℃和72℃温度下保持30s，共进行循环25次，最后在72℃保持5min，最后在10℃条件下5min褪火结束反应。每个样品3个重复，将同一样品混合后用2%琼脂糖凝胶电泳，使用AXYGEN 公司的AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物，Tris_HCL洗脱；将已构建好的PCR产物文库参照电泳初步定量结果，，借助Promega公司的QuantiFluor(TM) -ST荧光定量系统，用PicoGreen(R) dsDNA 定量试剂盒(PicoGreen(R) dsDNA
Quantitation Reagent) 进行检测；获得标准曲线并对PCR产物文库定量，然后按每个样品的测序量比例混合，并使用Roche 指定的 （Roche emPCRAmp-Lib_L Kit）制备EmPCR产物，在Roche Genome Sequencer FLX + 进行上机测序。最后对数据进行分析优化，丢弃长度短于200bp、模糊碱基数大于0、序列平均质量低于25的序列，获得优化序列数据。使用Furthest neighbor 方法
（http://www.mothur.org/wiki/Cluster）聚类生成OTU(按相似度97%)并进行生物信息统计分析。
数据分析结果如下：
Shannon 7.12 6.74
Shannon 6.85 6.47
Control nZVI
Chao：是用chao1算法估计样品中所含OTU数目的指数，chao1在生态学中常用来估计物种总数，
Ace：用来估计群落中OTU数目的指数，由Chao提出，是生态学中估计物种总数的常用指数之一， Shannon：用来估算样品中微生物多样性指数之一。它与Simpson多样性指数常用于反映alpha多样性指数。Shannon值越大，说明群落多样性越高。
微生物结果分析：
空白和nZVI反应器中微生物文氏图 (97%相似度)
目前，454高通量测序方法作为一种分析微生物种群结构优选方法已广泛应用于环境样品中，如污泥和土壤样品。本课题采用454高通量测序方法研究nZVI的加入对厌氧发酵产酸系统中的微生物种群结构和丰度进行深入分析。实验结果表明nZVI加入改变了发酵系统中的微生物种类和丰度，与空白反应器相比仅有748个OTUs（占总OTUs的13.5%）相同（图1），充分说明厌氧发酵系统的微生物结构已经发生变化。图2（A）heatmap图显示了加入nZVI和空白反应中，微生物在门类水平的分布情况，由图可以看出每个反应中都有21个门的微生物
种类被检出，而主要的微生物门类包括Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Chloroflexi 和 Actinobacteria, 分别占总数的的88.2% （空白反应器）和88.8% (nZVI反应器) 。这些门类的微生物在厌氧发酵过程中的有机物的降解以及短链脂肪酸的形成起着重大作用。如Firmicutes 门类的细菌是厌氧第1 阶段的主要菌群，能够在水解酸化过程中产生纤维素酶、蛋白酶和各种胞外水解酶，并通过新陈代谢来降解纤维素、蛋白、多糖和氨基酸等有机物，是纤维素等复杂大分子的主要降解菌；Bacteroidetes 门类的细菌是污泥中温消化的主要降解菌，能够降解多糖等有机物，同时还能够产生氢气、二氧化碳、纤维二糖、葡萄糖和乙酸；Proteobacteria 门类的细菌也是污泥水解和产酸的主要菌。图2（B）进一步在纲类水平揭示了微生物结构在两个反应器（空白和加入nZVI）的变化情况，反应器中的微生物总共分为45个纲。空白反应中的微生物主要有Beta-, Alpha-, Gamma-, Delata-proteobacteria, Sphingobacteriia和Clostridia组成，而加入nZVI的反应器中主要由Beta-, Alpha- Gamma-, Delata-proteobacteria, Bacteroidia, Sphingobacteriia, Clostridia, Caldilineae 及 Actinobacteria构成。 其中Bacteroidia 和 Clostridia两类与有机物降解以及有机酸的生产密切相关的微生物的比例在nZVI的反应中得到大幅提高，这与厌氧发酵过程中nZVI加入加快污泥的溶解和水解速度，提高短链脂肪酸的浓度结果一致。
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MABR 微生物群落结构演变
结合无泡曝气膜生物反应器处理生活污水的工艺，利用先进的分子生物学检测手段，如实时荧光定量PCR、454焦磷酸测序技术以及电泳技术等对微生物的种类和数量进行分析。以期获得在一个完整的操作周期内，微生物群落的动态变化规律以及外界条件的改变对微生物种类及数量的影响，从根本上寻找影响处理效果的因素。这对系统的优化运行，提高无泡曝气膜生物反应器的处理效果都具有重要的理论意义，为MABR的商业推广奠定坚实的基础。具体研究成果
（1） MABR污水处理系统在不同阶段、不同操作条件下的生物多样性值均在5.0上下波动，说明MABR系统具有较高的生物多样性。这说明微生物系统对外界操作条件的改变具有良好的适应性，从而保证了MABR系统对于污染物质，如COD、氨氮、硝酸根、亚硝酸根等具有良好地处理效果。
（2） 在MABR的不同阶段，既有相同的微生物种属，也有各自特异的微生物种属，各自特异的种属是由于外界条件的变化逐渐演变而来的。在不同阶段，既存在一直占据优势地位的种属，也有经过条件的变化逐渐丧失优势地位为逐渐消亡的种属，也有一些经过长期的演变而成为优势种属的次级种群。
（3） MABR污水处理系统中，总细菌的拷贝数一直保持在107以上，使得MABR对于COD具有良好的去除效果。NirS对于外界条件的变化，经历了一个先减少后增大的过程，拷贝数保持在106以上。AOB对于外界条件的变化，反应较为剧烈，条件的改变会显著影响AOB拷贝数的变化，变化范围为104-106之间。微生物拷贝数的变化会直接影响到污染物质的处理效果，这与我们宏观监测的处理效果相一致。
MABR污水处理系统在不同阶段、不同操作条件下的生物多样性值均在5.0上下波动，说明MABR系统具有较高的生物多样性。这说明微生物系统对外界操作条件的改变具有良好的适应性，从而保证了MABR系统对于污染物质，如COD、氨氮、硝酸根、亚硝酸根等具有良好地处理效果。
在MABR的不同阶段，既有相同的微生物种属，也有各自特异的微生物种属，各自特异的种属是由于外界条件的变化逐渐演变而来的。在不同阶段，既存在一直占据优势地位的种属如proteobacteria、acidobacteria，也有 经过条件的变化逐渐丧失优势地位为逐渐消亡的种属如Verrucomicrobia，也有一些经过长期的演变而成为优势种属的次级种群。
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1)&&Microbial community structure and function
微生物群落结构与功能
2)&&Microbial community and function
微生物群落结构和功能
3)&&community structure and function
群落结构与功能
4)&&functions of microbial communities
微生物群落功能
5)&&bacterial community structure
微生物群落结构
To enhance the efficiency of A/O process for petrochemical wastewater treatment,the relationship between bacterial community structure and the pollutants loading/degrading rates are analyzed by the polymerase chain reaction and denaturing gradient gel electrophoresis(PCR-DGGE) technique.
为提高石油化工污水厂厌氧—好氧(A/O)工艺净化效能,应用聚合酶链式反应—变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)与常规技术相结合的方法分析了石化废水处理系统生化池中微生物群落结构变化与污染负荷和主要污染物降解效果变化的关系。
6)&&microbial community structure
微生物群落结构
Research progresses on analytical technologies used in microbial community structure
微生物群落结构和多样性解析技术研究进展
Remediation of chromium-contaminated sediments by zero-valent iron and its effects on microbial community structure
零价铁对铬污染底泥的修复及其对微生物群落结构的影响
In order to examine the influence of lead (Pb) contamination on microbial biomass, two ecophysiological parameters and microbial community structure in soil during the growth of Chinese Cabbage (Brassica chinensis), a 60 days-growth experiment of the plant was conducted in two different soils, namely, marine sediment silty loam (S1) and yellowish red soil (S2).
对21种磷脂脂肪酸(PLFA)的图谱进行分析,结果表明,受铅污染土壤的微生物群落结构组成伴随着功能参数的变化而发生了改变;随着铅污染程度的增强,指示真菌和放线菌类的脂肪酸增加,而革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌脂肪酸比值下降。
补充资料：水生生物群落结构
&&&&　　一定水域中各种生物的聚合称为水生生物群落。示意如图。一个群落中的各种生物之间，生物与环境之间都存在着复杂的相互关系，由这些相互关系决定的各种生物在时间上和空间上的配置状况，称为群落结构。　　　　　　群落结构的特征主要表现在种类组成、群落外貌、垂直结构和水平结构方面。群落的生物种类是群落结构的基础；群落的外貌和结构是群落中生物之间、生物与环境之间相互关系的标志。群落中的各种生物对周围的生态环境都有一定的要求，周围环境起了变化，它们就会产生相应的反应，表现为群落中生物的种类和数量的增减；群落外貌、垂直结构和水平结构也随之发生变化。因此，水体污染必然引起水生生物群落结构的变化。研究这些变化，就可以评价水体的质量状况。　　　　丹麦学者E.弗耶丁斯塔在年根据污水中的优势群落把水体分成9个生物带,用以评价水体的污染状况。他提出可用裸藻群落表示甲型多污带，即溶解氧甚至可以低到零并含有硫化氢(H2S)的污染水体。在这种水体中,优势种是耐低溶解氧的绿色裸藻(Euglenaviri-dis)、静裸藻(E.deses)、华丽裸藻 (E.phaecodies)等。而主要由羽枝竹枝藻(Draparnaldia plumosa)和河生胭脂藻 (Hildenbrandia rivularis)等不耐污种类组成的绿藻群落，则可表示清水带。　　　　70年代英国人根据大型底栖无脊椎动物和鱼类群落结构的变化提出了评价河流水质的四级标准。近年来，北美和欧洲大多利用底栖无脊椎动物的群落结构变化，作为生物监测手段，因为这些动物个体较大（成体长度最小为3～5毫米），活动力较差，寿命较长，易于采集和识别。　　　　60年代初，中国一些单位调查了第二松花江污染引起的水生生物群落结构变化。70年代，又广泛开展了长江、湘江、官厅水库、鸭儿湖等水体的生物群落研究，利用底栖动物群落结构变化来评价这些水域所受的有机农药或重金属污染，并根据寡毛类、水生昆虫幼虫、软体动物的比例，划分评价标准的等级。　　　　应用群落结构评价环境质量，不需要贵重的仪器就可综合反映污染对生物的直接危害和发展趋势，但是不能说明污染物的性质和含量。因此，群落结构的生物学评价只有与化学、物理学评价结合起来，才能取得准确的监测结果。鉴于影响群落结构的因素并不仅是来自污染，因此，广泛调查不同类型污染水体的生物群落，开展正常生态和污染生态的群落结构研究，以及运用数学模型，以信息论原理来概述群落结构等，都是目前较重要的研究课题。　　　　参考书目　　　J.Cairns，Jr.，K.L.Dickson,Biological Methods for the Assessment of Water Quality,ASTM-STP-528,pp.148～162, American　Society of　Testing Materials,1973.　　
说明：补充资料仅用于学习参考，请勿用于其它任何用途。上传用户：rdlnxczgiw资料价格：5财富值&&『』文档下载 ：『』&&『』学位专业：&关 键 词 ：&&&&权力声明：若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请点击。摘要:（摘要内容经过系统自动伪原创处理以避免复制，下载原文正常，内容请直接查看目录。）泥土生物结皮在荒野化泥土改进中具有主要感化,其发育平日可分为微生物结皮、地衣结皮和苔藓结皮三个阶段。本论文经由过程野外收集微生物结皮样品,对微生物结皮的发育进程停止研讨,并对分歧发育阶段微生物结皮的微生物群落构成停止剖析,研讨成果以下：(1)在微生物结皮发育进程中,结皮的厚度、叶绿素a的含量和微生物量呈明显地正相。跟着微生物结皮的发育,结皮层泥土的无机质、全氮含量增长,持水性增年夜,渗水性减小；(2)微生物结皮的发育进程呈显著阶段性,其发育进程可以划分为构成期、早期、中期和成熟期4个阶段；(3)高通量测序成果注解,4个阶段中独有的16S rDNA序列OTU各有21、30、18、33个,共有的OTU有157个,独有的18S rDNA序列OTU各有1个,共有的OTU有39个。微生物结皮发育进程华夏核微生物的多样性、平均度呈降低趋向,成熟期品貌到达最年夜,真核微生物的多样性、平均度根本稳固；(4)微生物结皮中重要细菌、放线菌类群散布于31个纲,个中Bacillus、Cyanobacteria在各个阶段中均有显著优势,Cyanobacteria绝对品貌在高等阶段和成熟阶段比例增长,与其亲缘关系较近的Actinobacteria、Chloroplast、Alphaproteobacteria、Bacilli在各个阶段绝对品貌均较高；重要真菌类群散布于16个纲,个中Dothideomycetes、Pezizomycetes在各个阶段品貌均较高,Phomopsis、Blyttiomyces在后两个发育阶段缺掉。Abstract:The soil biological crust has a major effect on the improvement of the wilderness soil, which can be divided into three stages: microbial crust, lichen crust and moss crust. In this paper, the development progress of microbial crusts was studied, and the microbial community structure was analyzed, and the results were as follows: (1) in the process of microbial growth, the thickness of crust, the content of chlorophyll a and the microbial biomass were significantly positive. Along with the development of microbial crusts, soil organic matter, total nitrogen content increased, water retention increased, water pe (2) the development of microbial crusts was significantly different, and its development process can be divided into 4 stages, early, mid and mature. (3) high throughput sequencing, 30 rDNA 16S sequence OTU each have 21, 18, 33, 4 rDNA 18S sequence OTU each have 1, a total of 39 OTU. The development process of Chinese nuclear microbiotic crust microbial diversity and average degree are declining, mature appearance of the largest, eukaryotic microbial diversity, the aver (4) microbial crusts in the important bacteria, actinomycete populations distributed in 31 classes, the Bacillus and Cyanobacteria were all in all in the stage of significant advantages, Cyanobacteria absolute appearance in higher growth stage and mature stage proportion, close relationship with Actinobacteria, Chloroplast, genetic Alphaproteobacteria, Bacilli in various stages of absolute ap important fungal taxa were distributed in 16 classes, the Dothideomycetes and Pezizomycetes appearance in each stage were higher, Phomopsis, Blyttiomyces in the post two developmental stages of missing.目录:摘要4-5Abstract5第一章 前言8-17&&&&1.1 土地荒漠化与防治8-9&&&&1.2 土壤生物结皮9-10&&&&1.3 土壤微生物多样性研究方法10-15&&&&1.4 研究背景15-16&&&&1.5 研究内容及技术路线16-17第二章 研究材料与方法17-25&&&&2.1 材料17&&&&2.2 结皮理化性质测定17-18&&&&2.4 聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳18-20&&&&2.5 数据处理20&&&&2.6 454测序20-24&&&&2.7 微生物结皮半薄切片制作24-25第三章 结果与分析25-44&&&&3.1 微生物结皮发育阶段的量化描述25-31&&&&3.2 DGGE分析微生物群落多样性及优势群落结构31-34&&&&3.3 高通量测序分析微生物结皮微生物群落多样性34-44第四章 讨论44-47&&&&4.1 微生物结皮发育程度的判断44&&&&4.2 微生物结皮发育的阶段性44-45&&&&4.3 微生物结皮中细菌群落多样性及优势群落45-46&&&&4.4 各发育阶段微生物结皮微生物分类学信息46-47第五章 结论47-48参考文献48-52致谢52-53附录53-60个人简历60分享到：相关文献|扩增子测序常见问题1、什么是扩增子测序？扩增子测序主要通过对特定长度基因的 PCR 产物进行测序分析，针对环境样本，16S/18S/ITS 等基因扩增子测序是研究环境微生物多样性及群落组成差异的重要技术手段之一。更多详细内容参见产品资料-2.扩增子测序研究方法2、常见的扩增子测序有哪些？根据不同的研究目的和需求，罗宁生物提供5种扩增子产品：16S rDNA 测序、18S rDNA/ITS 测序、功能基因区域测序、GS-Sequencing植物内生菌测序和InDel区域测序。3、扩增子测序能应用到哪些领域？按应用领域，罗宁生物环境微生物可向以下领域提供测序分析服务：1&工业微生物酿酒、乳制品微生物，油气微生物等2&农业微生物动植物病原菌、食用菌、生物固氮菌等3&医学微生物病原微生物、肠道微生物、泌尿道微生物、消化道微生物、呼吸道微生物等4&环境微生物土壤、空气、水体微生物4、16S/18S/ITS测序目前能提供哪些分析服务？罗宁生物16S/18S/ITS测序目前针对客户样本可提供基础分析、标准分析及高级分析，具体分析内容参见产品资料-附件一分析报告模板第4页所列内容，该页未列出内容为定制分析，需按具体项目而定。环境微生物多样性分析内容总体上可分为alpha多样性分析、beta多样性分析和物种差异分析等内容。根据客户样本量，当客户样本量低于3个，仅提供alpha多样性分析。5、植物内生菌（细菌/真菌）扩增子测序和其他公司提供的扩增子测序服务有什么差别？罗宁生物多年致力于环境微生物样本多样性测序分析，现在我们更推出针对植物来源复杂样本的Green Shield Sequencing技术，从源头上消除样本中叶绿体和线粒体以及宿主基因组等序列带来的干扰，还原样本微生物的真实比例。Green Shield Sequencing技术是罗宁生物最新研发的针对植物内生菌测序的优质测序服务，测序流程与普通高通量测序无异，但重要的是可在较小的测序数据量中获得更真实的内生菌信息。根据目前测序数据，采用Green Shield Sequencing技术最多可将宿主污染降低至5%/0.03%（16S/ITS）。6、植物内生菌测序只能用于植物研究吗？罗宁生物植物内生菌测序不仅可用于植物研究，对于植食性动物肠道微生物研究具有极大的优势。Green Shield Sequencing真菌测序技术对于目前研究较多的植物菌根研究具有极大的优势。7、罗宁生物16S扩增子测序目前研究的是哪一个片段？罗宁生物16S扩增子测序目前研究的是V4高变区的515bp-806bp的片段。如果客户有其他研究需求，可定制分析方案。8、罗宁生物16S扩增子测序为何选取515-806区域进行测序？在细菌物种鉴定方面，使用位于V4区的U/E515F引物的覆盖度达到99%-99.1%，与此同时下游引物E806R的覆盖度也达到了95.10%；根据试验目的的不同，如下游引物使用U909R则会检出更大比例古菌。因此，选择U515F/U806R引物对在细菌检出率上具有绝对的优势。同时，515F/806R对扩增子平均长度为291bp，相较于使用V3-V5区引物E341F/U909R或U341F/E785R扩增子566bp和444bp来说长度更短，在短片段测序具有更大优势的Illumina测序平台来说，更小的扩增子测序引入的测序误差更低，Q值更高，测序结果更加真实可靠。因此，U515F/U806R引物对的使用更能真实反映细菌群落结构的信息。9、罗宁生物扩增子测序平台是什么？为什么不用454测序平台？罗宁生物扩增子测序采用Illumina平台。罗氏454平台目前试剂已停产且通量较低，所以目前均采用Illumina平台测序。10、罗宁生物扩增子测序使用的是Illumina原装试剂吗？罗宁生物扩增子建库测序均采用原装Illumina试剂，建库更采用Illumina TruSeq DNA PCR-Free LT Library Prep Kit建库试剂盒降低批次间误差。11、罗宁生物扩增子测序能提供多少测序量？根据客户的要求及样本不同，罗宁生物提供Tags的测序量。默认情况下，我们提供不低于10000Tags，平均30000Tags的测序量。12、扩增子测序测序量是越大越好吗？罗宁生物始终坚持够用就好的原则，并非更大的测序量会带来更好的结果。通常情况下，加大测序量是为了进行低丰度研究。通常情况下，细菌及古菌建议测序量是10000Tags-20000Tags，真菌建议测序量在5000Tags左右。13、从提供样本到获得分析数据的时间是多久？通常在样品检测合格后30-40天内完成测序分析。14、样本该如何寄送？A. 当您的样本属于温度敏感型样本，请使用低温介质（冰袋/干冰）辅助运送，包装要求如下：1&将样本放入合适大小的螺口离心管中，样本量不要超过离心管的四分之三，管上注明样品名称及制备时间，管口用Parafilm封口。建议在运输前将离心管置于离心管架/盒上，再用自封袋密实；2&将样本置于泡沫保温盒中，加入足量干冰或低温冰袋，此时您可联系物流公司封存样本后邮寄，为加固泡沫盒，您可在最外层套上一层瓦楞纸盒；3&确定样品不会松动摇晃之后可邮寄。B. 当您的样品对环境温度不敏感，包装要求如下：1&将样本放入合适大小的螺口离心管中，样本量不要超过离心管的四分之三，管上注明样品名称及制备时间，管口用Parafilm封口。建议在运输前将离心管置于离心管架/盒上，再用自封袋密实；2&将装有样本的离心管架/盒放入瓦楞纸盒，随后使用气泡膜固定后邮寄。15、样本是否要设置重复？罗宁生物提供的高级分析均需要客户提供至少三个生物学重复。为了获得更好的试验结果，建议设置6-20个重复。16、客户需要提供什么样品？客户可提供原始样本或纯化核酸样本。17、样品上样量不同及其clean data不同，会不会对多样性分析和差异比较分析有影响？首先，上机时都会对样品进行定量检测，使用Qubit荧光定量，在某一合适浓度范围内才会上机测序，两个样品间不会有很大的浓度差。其次，在做多样性分析的时候或在统计分析之前会对数据进行重抽样使样品具有相同的序列数以避免测序深度对结果的影响。所以差异表达分析和多样性分析中不用担心上样量或数据量不同对结果的影响。18、DGGE技术与Illumina平台高通量测序技术在环境微生物群落多样性研究中有什么区别？DGGE等分子指纹技术，在其实验结果中往往只含有数十条条带，只能反映出样品中的优势种群，无法得到细菌种类的全面信息。而基于Illumina平台的高通量测序技术能同时对样品中的优势种群及微量的劣势种群进行检测，获得样品中的微生物群落组成，并将其含量进行数字化。19、罗宁生物双Barcode技术优势双Barcode技术通过在扩增子两端加入不同的Barcode从而排出了样品间的序列拼接产生嵌合体的可能。20、在菌根研究中使用什么引物？在菌根的研究中我们推荐使用GS-Sequencing针对菌根的特异性引物。当然，如选择普通引物，建议使用AMV4.5NF和AMDGR引物对，如没有特殊需求，请不选择NS31引物与AM1/AM2引物的混用。21、近期有发表文章表明使用16S rRNA基因的799F-1391R和799F-1193R对植物来源线粒体和叶绿体同源基因进行了抑制，该方法是否可以替代GS-Sequencing植物内生菌高通量测序？罗宁生物GS-Sequencing植物内生菌高通量测序采用经修饰的抑制植物来源同源基因的引物混合物是目前无偏差测序的最佳选择，GS-Sequencing最终使用16S V4区（515-806bp）及ITS1/2区域（菌根采用AMVD引物）,保证最佳数据质量及可靠性。近期有发表文章表明使用16S rRNA基因的799F-1391R和799F-1193R引物对在杨树材料中进行了研究，结果显示799F-1391R扩增片段接近600bp，不能在当前主流illumina平台完成测序，另一引物799F-1193R扩增结果alpha多样性低，并不能真实反应样本真实情况。与此同时，这两对引物使用覆盖度较低的V5-V6-V7高变区，总体上看，该文章中筛选出的引物还需更进一步优化。GS-Sequencing植物内生菌测序常见问题1、预约GS-Sequencing测序对样品有哪些要求？罗宁生物GS-Sequencing测序收取的样本仅限总DNA样本及干冰储运的样品鲜样，与环境微生物测序样品一致。我们也接受DNA冻干样本，但最好将样本溶于Elution Bffer（10mM Tris-HCl, pH8.0)缓冲液寄送，具体要求如下：1&总DNA样本（GenomicDNAsample）：为获得良好数据，请确保送样体积大于30ul ，浓度介于50-100ng/ul为宜，送样前请使用nano drop、PicoGreen等测量各样本浓度，并将A260/A280、A260/A230值填写于《样品信息表》。我们不建议使用浓度低于10ng/ul的样本。2&如提供干冰保藏的鲜样，请提前7个工作日与我们联系获取物流建议（因季节不同可能有差异）。3&您的样本在获得测序数据以后我们将免费为您保存原始样本90天，您可在此期限内申请取回样本，具体信息请联系tech@获取相应支持。*样本总DNA建议您采用CTAB法纯化，2、目前已有哪些样本使用过GS-Sequencing测序？罗宁生物在环境微生物样本多样性分析中积累多年经验，目前针对植物内生菌的 GS-Sequencing测序服务对以下植物样本进行了测序：拟南芥、紫花苜蓿、苹果（叶）、杏（叶）、芥菜、芦笋、燕麦、香蕉、大麦、葫芦、仙人掌、山茶、油菜、洋甘菊、樱桃、柑橘、三叶草、菜豆、玉米、豇豆、黄瓜、蒲公英、茄子、高羊茅、亚麻、葡萄辣根、独活、麻、浮萍、扁豆、莴苣、枸杞、洋葱、兔（肠道）、矮牵牛、牛（肠道）、蜗牛（肠道）、蚱蜢（肠道）、羊（肠道）、绿豆、烟草、桃、车前草、马铃薯、萝卜、玫瑰、高粱、大豆、草莓、向日葵、柳枝稷、番茄、树番茄、柳、大叶草、牡丹、水稻。如您正在准备进行植物内生菌测序实验或环境微生物样品多样性实验，我们可提供尽可能多的试验优化方案供您选择，更多信息请联系tech@获取相应支持。3、GS-Sequencing测序服务的试验周期多长？试验周期与普通环境微生物多样性测序服务一样，为45-60天。4、GS-Sequencing内生菌测序技术与其他Meta16S测序有何差异？罗宁生物在环境微生物样本多样性测序分析领域具有多年经验，独创的GS-Sequencing内生菌测序技术从源头控制质体和线粒体的污染，还原样本微生物真实比例。在与以往Meta 16S测序的流程上没有差别，均为16S rDNA目的片段扩增-建库-测序-分析四个步骤，而对质体线粒体序列的去除过程对样品微生物信息无影响。动植物基因组重测序常见问题1、重测序需要多少覆盖度？重测序的覆盖度是由所测样品的物种及合作伙伴的具体需求决定的。例如，Illumina测序平台进行人类基因组重测序，如要获得绝大多数的变异信息，覆盖度需达30×以上。2、如何验证重测序的结果？通过全基因组重测序一般能够发现SNP、SV、CNV、InDel等多种遗传变异，不同的变异类型，其验证方法也各不相同。 1& SNPs可以通过PCR扩增包含该SNP位点的区段，并进行测序；或采用SNP分型检测的方法验证。 2& CNVs可通过Real-time PCR对存在拷贝数变异的片段进行扩增，并根据CT值估算不同个体的拷贝数变化倍数。 3& 小的SVs可通过PCR扩增和测序辨别，而大的SVs则需要通过亚显微方法发现，如FISH等。 4& 小片段的InDel，可通过PCR扩增，利用Sanger法测序进行验证。转录组测序常见问题1、研究基因差异表达分析的常用软件？对于没有生物学重复的转录组数据进行差异表达分析时常用的软件有DEGseq、Useq、Cufflinks中的Cuffdiff模块等。2、核酸平台是否会对客户样品进行 DNase处理？建议客户送样前自行对样品进行 DNase 处理，建库前的 DNase 处理只能处理痕量DNA 模板残留。3、转录组建库过程中是用随机引物进行反转录，还是用 oligo(dT)做反转录？常规建库采用随机引物进行反转录，如有特殊要求可采用 oligo(dT)或者两种都采用。4、与基因芯片相比，转录组高通量测序有什么优势？基因芯片是用已知序列的探针和样本mRNA进行杂交来获得mRNA的序列信息的，如果样本mRNA以前从来没有报道过，那么基因芯片上面就不会有相应的探针序列，也就检测不到新的mRNA；另外，核酸杂交的背景噪音很高，存在交叉杂交现象。转录组是直接对样本mRNA进行测序，能够发现很多新的mRNA；转录组测序对基因表达上调或下降的检测范围能够达到上万倍，远比基因芯片的百倍左右要灵敏,而且在有参考基因组的情况下，通过转录组测序还可以分析可变剪切、基因结构变异、全基因组水平基因表达丰度等情况。5、转录组测序后有何验证方法？转录组测序后可通过实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）技术来验证测序结果。基因组测序常见问题1、重复序列是否影响数据拼接？重复序列会对数据拼接造成一定影响。通过构建不同梯度的Paired-End文库并采用Miseq平台进行测序，可以对重复序列引起的错拼进行校正。当前的拼接软件所采用的算法在一定程度上也会减少重复序列造成的错拼。2、对于GC含量过高或过低的基因组，能否通过测序达到相应组装标准？GC含量大于65%或者小于35%时，测序和组装难度均增加，通过使用三代和二代测序相结合的方式进行测序，并根据基因序列特性选取合适组装方式对基因组序列进行拼接。以最大程度的获得序列信息。3、如何制定de novo真菌基因组测序的策略？真菌基因组的重复序列、GC含量、染色体数目等是影响基因组de novo拼装效果的关键因素，其中重复序列常常会导致基因组的错误组装。为了尽量避免重复序列的影响，在进行de novo真菌基因组测序时，可构建多种不同长度插入片段的文库，进行测序和拼接，以跨越不同长度的重复序列，在基因组拼接时，由于不同物种基因组的重复序列结构分布不同，采取的拼接策略也会略有不同。4、如何对真菌基因组重复序列结构进行估算？一般系统发育相近的物种，它们的重复序列结构也比较相近，所以可参照近缘物种基因中的重复序列结构情况对待测真菌基因组重复序列结构进行估算。
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