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如何建立高效液相色谱法测定含量的方法
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色谱条件的确定专属性是色谱条件建立的关键通常是采用在被测物对照品(或供试品)中加入适量的杂质或辅料以验证所选色谱条件能否将各杂质与被测物分离检出[2].应按1(w/w)被测物浓度的各杂质量添加至被测物中模拟被测物中可能存在杂质的状态即有少量(约1)杂质存在时能否与被测物达到完全分离(分离度大于1.5)以验证系统适用性.只有这样才能较为客观、科学地反映被测物的实际情况.而不应将被测物与各杂质配制成相同浓度的溶液因为实际检测中不可能存在这种情况且该浓度也不易确定.在实际检测时由于被测物浓度较大很易将相邻杂质峰包含其中.另外还需测定溶剂和辅料(检测制剂时)是否有干扰.目前美国药典(USP)、英国药典(BP)及许多进口产品的质量标准中有关物质测定方法学的专属性验证均采用此法.还须说明的是杂质与杂质峰间的分离度达1.2即可而被测物与其相邻杂质峰的分离度必须大于1.5.2
检测波长的选择有关物质检测的研究对象是杂质而非被测物.但测定则是通过各自的峰面积来表达故波长的选择必须考虑被测物和各杂质在检测波长下的校正因子(f)是否相同.应分别制备相同浓度的被测物与各杂质溶液经紫外扫描后以吸光度相近的波长为检测波长.在该检测波长下分别进样测定由各峰面积计算校正因子.若f为0.8&#则表明被测物与各杂质的f相同可消除f的影响.若f≤0.8或f ≥1.2则应在计算时加入f.目前通常以被测物的最大吸收波长为检测波长、不加校正因子的计算方法而未综合考虑各杂质的f.3
供试品溶液浓度的确定供试品溶液浓度的确定也非常重要.虽然浓度越高越能反映被测物中杂质存在的情况但若设定过高会产生主峰严重拖尾、裂峰、柱超载和检测器超载等情况若设定过低则灵敏度不够无法检测杂质及其含量变化.最低检出浓度的测定可分为信噪比法和直接评价法两种[3].后法是目前较为科学的做法即将仪器的灵敏度调至较适宜的值(仅对灵敏度可调节的仪器而言目前市场上主流品牌的液相色谱仪均已设定了一个恒定、较为灵敏的值)然后将被测物溶液不断稀释后进样测定直至被测物峰面积无法检出为止此时的浓度即为最低检出浓度.最大进样量则是采用不断增加被测物溶液浓度直至峰严重拖尾、裂峰、柱超载和检测器超载等情况出现.根据最低检出浓度采用“上推法”来确定供试品溶液浓度如一般设定杂质总量小于1.0对照液对照溶液的浓度至少应为最低检出浓度的2050倍供试品溶液浓度则应是最低检出浓度的;5000倍.同时还应考虑仪器、色谱柱等因素对最低检出浓度和最大进样浓度的影响(即耐用性因素)所以供试品溶液的浓度应在保证小于最大进样量的情况下适当设定得高些以保证该浓度在任何试验条件下均有足够的检测灵敏度.表1为最低检出浓度、最大进样量、供试品溶液和对照溶液间的比例关系(进样量10µl规定杂质限度1.0).4
线性试验在稳定性考察中如某杂质含量不断增加则说明被测物降解的途径稳定、可循则有必要对该杂质进行针对性地监控即采用该杂质对照品(经确证结构后由人工合成获得)以外标法准确测定.此时与含量测定相似应进行线性试验.通常将杂质限度设定为该杂质的100浓度线性验证范围10&#(即相当于被测物测定浓度表1
最低检出量、最大进样量、供试品溶液和对照溶液间的比例关系参数浓度/µg·ml–1绝对量/ng相当于供试品溶液浓度/与最低检出浓度的倍数最大进样量3000最低检出浓度0.110.02供
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扫描下载二维码简介/高效液相色谱
高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）是指流动相为液体的技术。早期的液相色谱（经典液相色谱）是将小体积的试液注入色谱柱上部，然后用洗脱液（流动相）洗脱。这种经典色谱法，流动相依靠自身的重力穿过色谱柱，差(固定相颗粒不能太小)，分离时间很长。70年代初期发展起来的高效液相色谱法，克服了经典液相色谱法柱效低，分离时间很长的缺点。成为一种高效、快速的分离技术。高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9?107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。 高压泵将贮液罐的流动相经进样器送入色谱柱中，然后从检测器的出口流出，这时整个系统就被流动相充满。当欲分离样品从进样器进入时，流经进样器的流动相将其带入色谱柱中进行分离，分离后不同组分依先后顺序进入检测器，记录仪将进入检测器的信号记录下来，得到液相色谱图。 HPLC流程示意
发展历史/高效液相色谱
1960年代，由于气相色谱对高有机物分析的局限性，为了分离蛋白质、核酸等不易气化的大分子物质，气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。1960年代末科克兰（Kirkland）、哈伯、荷瓦斯(Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱的时代。高效液相色谱使用粒径更细的固定相填充色谱柱，提高色谱柱的塔板数，以高压驱动流动相，使得经典液相色谱需要数日乃至数月完成的分离工作得以在几个小时甚至几十分钟内完成。1971年等人出版了一书，标志着高效液相色谱法 (HPLC)正式建立。在此后的时间里，高效液相色谱成为最为常用的分离和检测手段，在、、医学、药物开发与检测、化工、食品科学、环境监测、商检和法检等方面都有广泛的应用。高效液相色谱同时还极大的刺激了固定相材料、检测技术、数据处理技术以及色谱理论的发展。1960年代前，使用的大于100μm，提高柱效面临着困境，后来的研究人员便采用微粒固定相来突破着一瓶颈。、制备成功薄壳型，这种在固定相在玻璃微球表面具有多孔薄壳，实现了高速传质，为高效液相色谱技术的发展奠定了稳固的基础。随着填料粒径的降低，更高的柱效也得以实现。1960年代研制出、注射泵及低流量往复式柱塞泵，但后者的脉冲信号很大，难以满足高效液相色谱的要求。1970年代，往复式双柱塞恒流泵，解决了这一问题。1970年代后科克兰制备出全多孔球形硅胶，平均粒径只有7μm，具有极好的柱效，并逐渐取代了无定形微粒硅胶。之后又制造出的键合固定相使柱的稳定性大为提高，多次使用成为可能。1970年后，适合分离生物大分子的填料又成为研究的热点。1980年后，改善分离的选择性成为工作者的主要问题，人们越来越认识到改变流动相的组成事提高选择性的关键。
特点/高效液相色谱
1．高压：液相色谱法以液体为（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～350×105Pa。2. 高速：流动相在柱内的流速较经典快得多，一般可达1～10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于1h。3. 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。5.适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于 400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的 75% ～ 80% ）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。 据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。
主要类型/高效液相色谱
1、（Adsorption Chromatography）2、（Partition Chromatography）&3、（Ion Chromatography）&4、（Size Exclusion Chromatography）&5、（Affinity Chromatography）特点比较&吸附色谱分配色谱离子色谱亲和色谱固定相全多孔固体吸附剂固定液载带在固相基体上 高效微粒离子交换剂 具有不同孔径的多孔性凝胶多种不同性能的配位体键联在固相基体上流动相不同极性有机溶剂不同极性有机溶剂和水不同pH值的缓冲溶液有机溶剂或一定pH值的缓冲溶液不同pH值的缓冲溶液，可加入改性剂分离原理吸附与解吸溶解与挥发 可逆性的离子交换多孔凝胶的渗透或过滤具有锁匙结构络合物的可逆性离解
分离原理/高效液相色谱
根据分离机制的不同，高效液相色谱法可分为下述几种主要类型：1 ．液—液分配色谱法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及色谱(Chemically Bonded Phase Chromatography)流动相和固定相都是液体。流动相与固定相之间应互不相溶（极性不同，避免固定液流失），有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。达到平衡时，服从于下式：式中，cs—溶质在固定相中浓度；cm--溶质在流动相中的浓度； Vs—固定相的体积；Vm—流动相的体积。LLPC与GPC有相似之处，即分离的顺序取决于K，K大的组分保留值大；但也有不同之处，GPC中，流动相对K影响不大，LLPC流动相对K影响较大。a.
— 液分配色谱法(Normal Phase liquid Chromatography): 流动相的极性小于固定液的极性。b.
— 液分配色谱法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流动相的极性大于固定液的极性。c. 的缺点：尽管流动相与固定相的极性要求完全不同，但固定液在流动相中仍有微量溶解；流动相通过色谱柱时的机械冲击力，会造成固定液流失。上世纪70年代末发展的（见后），可克服上述缺点。现在应用很广泛（70~80%）。2 ．液—固色谱法流动相为液体，固定相为吸附剂（如、等）。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。其作用机制是：当试样进入色谱柱时，溶质分子 (X) 和溶剂分子(S)对吸附剂表面活性中心发生（未进样时，所有的吸附剂活性中心吸附的是S），可表示如下：Xm nSa ====== Xa nSm式中：Xm--流动相中的溶质分子；Sa--固定相中的溶剂分子；Xa--固定相中的溶质分子；Sm--流动相中的溶剂分子。当吸附竞争反应达时：K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]式中：K为吸附平衡常数。[讨论：K越大，保留值越大。]3 ．离子交换色谱法(Ion-exchange Chromatography)IEC是以离子交换剂作为固定相。IEC是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子以交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。以交换剂为例，其交换过程可表示如下：X-(溶剂中) (-R4N Cl-)=== (树脂-R4N X-) Cl- (溶剂中)当交换达平衡时：KX=[-R4N X-][ Cl-]/[-R4N Cl-][ X-]为：DX=[-R4N X-]/[X-]= KX [-R4N Cl-]/[Cl-][讨论：DX与保留值的关系]凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离。4 ．(Ion Pair Chromatography)是将一种 ( 或多种 ) 与溶质分子电荷相反的离子 ( 称为对离子或反离子 ) 加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。其原理可用下式表示：X
Y-水相 === X Y-式中：X 水相--流动相中待分离的有机离子（也可是阳离子）；Y-水相--流动相中带相反电荷的离子对（如氢氧化四丁基铵、氢氧化十六烷基三甲铵等）；X Y---形成的离子对化合物。当达平衡时：KXY = [X Y-]有机相/[ X ]水相[Y-]水相
根据定义，分配系数为：DX= [X Y-]有机相/[ X ]水相= KXY [Y-]水相[讨论：DX与保留值的关系]离子对色谱法(特别是反相)发解决了以往难以分离的混合物的分离问题，诸如酸、碱和离子、非离子混合物，特别是一些生化试样如核酸、核苷、生物碱以及药物等分离。5．色谱法(Ion Chromatography)用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相。以电导检测器为通用检测器，为消除流动相中强电解质背景离子对电导检测器的干扰，设置了抑制柱。试样组分在分离柱和抑制柱上的反应原理与离子交换色谱法相同。以交换树脂（R-OH）作固定相，分离阴离子（如Br-）为例。当待测阴离子Br-随流动相（NaOH）进入色谱柱时，发生如下交换反应（洗脱反应为交换反应的逆过程）：抑制柱上发生的反应：R-H Na OH- === R-Na H2OR-H Na Br- === R-Na H Br- 可见，通过抑制柱将洗脱液转变成了电导值很小的水，消除了本底电导的影响；试样阴离子Br-则被转化成了相应的酸H Br-，可用电导法灵敏的检测。离子色谱法是溶液中阴离子分析的最佳方法。也可用于阳离子分析。6．空间色谱法(Steric Exclusion Chromatography)以 (gel) 为固定相。它类似于分子筛的作用，但凝胶的孔径比分子筛要大得多，一般为数纳米到数百纳米。溶质在两相之间不是靠其相互作用力的不同来进行分离，而是按分子大小进行分离。分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流动力学体积或分子大小有关。试样进入色谱柱后，随流动相在凝胶外部间隙以及孔穴旁流过。在试样中一些太大的分子不能进入胶孔而受到排阻，因此就直接通过柱子，首先在色谱图上出现，一些很小的分子可以进入所有胶孔并渗透到颗粒中，这些组分在柱上的保留值最大，在色谱图上最后出现。
固定相/高效液相色谱
一、液—液色谱法及离子对色谱法固定相与GLC类似，LLC的固定相也是在担体上涂渍一层固定液构成，或使用化学键合相。1．担体所用的担体可分为如下几类：(1) 全多孔型担体：a. HPLC早期使用的担体与GC类似，是颗粒均匀的多孔球体，如有氧化铝、氧化硅、硅藻土等制成的Φ>>100 μm全多孔型担体。其缺点是：填料的不规则性和较宽的粒度范围会导致填充不易均匀，柱效低；填料孔径分布不一，并存在“裂隙”在中形成滞留液体（液坑），溶质分子在深孔中扩散和传质慢，使色谱峰变宽，柱效下降。b. HPLC在20世纪70年代初开始使用Φ〈10 μm全多孔型担体，它是由nm级的硅胶微粒堆积而成Φ为5 μm或稍大的全多孔小球。其优点是：颗粒小而均匀，传质快（距离短），柱效高。(2) 表层多孔型（薄壳型微珠担体）：它是直径为 30 ～ 40 μm 的实心核 ( 玻璃微珠 ) ，表层上附有一层厚度约为 1～ 2μm 多孔表面 ( 多孔硅胶 ) 。 其优点是：孔穴浅（固定相仅为表面的一薄层），传质速度快，易于填充均匀，柱效高。其缺点是：柱子容量低、需要配用高灵敏检测器。这种担体目前应用较为普遍。2．固定液液—液色谱流动相和固定相都是液体，因此要求两相要互不相溶。在液-液色谱中常用的固定也只有极性不同的几种，如β，β'-氧二丙腈、聚已二醇-400和角鲨烷等。3．化学键合固定相：将固定液机械的涂在担体表面上构成的这种固定相，在实际使用时存在不少缺点，20世纪60年末发展起来了一种新型的固定相---化学键合固定相。即用化学反应的方法通过化学键把有机分子结合到担体表面。根据在硅胶表面 (具有≡Si－OH基团) 的化学反应不同，键合固定相可分为： ( ≡ Si－O－C ) ； (≡Si－O－Si－C ) （≡Si－C）和硅氮键型（≡Si－N）四种类型。化学键合固定相反应&化学键合固定相具有如下一些特点：ⅰ.表面没有液坑，比一般液体固定相传质快得多；ⅱ.无固定液流失，增加了色谱柱的稳定性和寿命；ⅲ.可以键合不同官能团，能灵活地改变选择性，应用于多种色谱类型及样品的分析；ⅳ.有利于，也有利于配用灵敏的检测器和馏分的收集。化学键合固定相应用二、液－固吸附色谱法固定相　采用的吸附剂有硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等，仍可分为全多孔性和薄壳型两种，其特点如前所述。三、离子交换色谱法固定相1.薄膜型离子交换树脂:即以薄壳玻璃珠为担体，在它的表面涂约 1% 的离子交换树脂而成。2. 离子交换键合固定相:用化学反应将离子交换基团键合在惰性担体（如微粒硅胶）表面。树脂类别：（1）阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）；（2）阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）。四、排阻色谱法固定相1.软质凝胶：如、凝胶等，适用于水为流动相，在常压下使用。2.半硬质凝胶：如苯乙烯－二乙烯基苯交联共聚凝胶（），是应用最多的有机凝胶，适用于非极性有机溶剂。3.硬质凝胶：如多孔硅胶、等，多孔硅胶是用得较多的。化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。近年来发展起来的可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。用它固定相，色谱柱易填充均匀；柱压、流动相流速、pH值或离子强度对分离的影响小，适用于较高流速下操作。
流动相/高效液相色谱
在气相色谱中，载气是的（与组分分子之间的作用力可忽略不计），常用的只有三四种，他们的性质差异也不大，所以要提高柱子的选择性，只要选择合适的固定相即可。但在液相色谱中，当固定相选定后，流动相的种类、配比能显著的影响分离效果，因此，流动相的选择也非常重要。选择流动相（又称为：淋洗液，洗脱剂）时应注意下列几个因素。(1) 纯度：防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。　(2) 避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如在液-液色谱中，流动相应与固定液互不相溶，否则，会使固定液溶解流失；破坏氧化铝固定相等。(3) 对试样要有适宜的溶解度：试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。(4) 溶剂的粘度小些为好：否则，会降低试样组分的扩散系数，造成传质速率缓慢，柱效下降。(5) 应与检测器相匹配：例如，当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。例如，采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。常用溶剂的极性顺序：水(最大) & & & 甲醇& 乙醇& 丙醇& 丙酮&&&二氧六环& 四氢呋喃& 甲乙酮& 正丁醇& 乙酸乙酯& 乙醚& 异丙醚& 二氯甲烷&氯仿&溴乙烷&苯&四氯化碳&二硫化碳&环己烷&己烷&煤油(最小)。除此之外，在选择溶剂时，溶剂的极性是最重要的依据，有时还需要采用二元或多元组合溶剂作为流动相，以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。选择时要参阅有关手册，并通过实验确定。
高效液相色谱仪/高效液相色谱
HPLC的出现不过三十多年的时间，但这种分离分析技术的发展十分迅猛，目前应用也十分广泛。其仪器结构和流程也多种多样。典型的高效液相色谱仪结构和流程可用下列方框图表示（See Fig.3-4）。高效液相色谱仪一般都具备贮液器、高压泵、梯度洗提装置（用双泵）、进样器、色谱柱、检测器、恒温器、记录仪等主要部件。1、高压泵HPLC使用的色谱柱是很细的（1~6 mm），所用固定相的粒度也非常小（几μm到几十μm），所以流动相在柱中流动受到的阻力很大，在常压下，流动相流速十分缓慢，柱效低且费时。为了达到快速、高效分离，必须给流动相施加很大的压力，以加快其在柱中的流动速度。为此，须用高压泵进行高压输液。高压、高速是高效液相色谱的特点之一。HPLC使用的高压泵应满足下列条件：a.流量恒定，无脉动，并有较大的调节范围（一般为1~10 mL/min）；b.能抗溶剂腐蚀；
往复式柱塞泵c.有较高的输液压力；对一般分离，60×105Pa的压力就满足了，对高效分离，要求达到150~300×105Pa。(1). 当柱塞推入缸体时，泵头出口（上部）的单向阀打开，同时，流动相进入的单向阀（下部）关闭，这时就输出少量的流体。反之，当柱塞向外拉时，流动相入口的单向阀打开，出口的单向阀同时关闭，一定量的流动相就由其储液器吸入缸体中。这种泵的特点是不受整个色谱体系中其余部分阻力稍有变化的影响，连续供给恒定体积的流动相。（2）其工作原理是：压力为 p1 的低压气体推动大面积（ SA ） A ，则在小面积（ SB ）活塞 B 输出压力增大至 p2 的液体。压力增大的倍数取决于 A 和 B 两活塞的面积比，如果 A 与 B 的面积之比为 50 : 1 ，则压力为 5 × Pa 的气体就可得到压力为 250×Pa 的输出液体。这是一种恒压泵。2、洗提类似于GC中的程序升温。已成为现代高效液相色谱中部缺少的部分。梯度洗提，就是中含有两种（或更多）不同极性的溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变载液中溶剂的配比和极性，通过载液中极性的变化来改变被分离组分的，以提高分离效果。梯度洗提可以分为两种：a.梯度（也叫外梯度）：在常压下，预先按一定程序将两种或多种不同极性的溶剂混合后，再用一台高压泵输入色谱柱。b.梯度 ( 或称内梯度系统 ) ：利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按设定的比例送入梯度混合室，混合后，进入色谱柱。3、进样装置(1).注射器进样装置：进样所用微量注射器及进样方式与 GC法一样。进样压力150×105Pa时，必须采用停流进样。(2).高压定量进样阀：与GC法用的流通法相似，能在高压下进样。4、色谱柱色谱柱是色谱仪最重要的部件（心脏）。通常用后壁玻璃管或内壁抛光的不锈钢管制作的，对于一些有腐蚀性的样品且要求耐高压时，可用铜管、铝管或聚四氟乙烯管。柱子内径一般为1～6 mm。常用的标准柱型是内径为 4.6 或 3.9mm ，长度为 15 ～ 30cm 的直形不锈钢柱。填料颗粒度 5 ～ 10μm ，柱效以理论塔板数计大约 7000 ～ 10000 。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。5、检测器(1).它的作用原理是基于被分析试样组分对特定波长紫外光的选择性吸收，组分浓度与吸光度的关系遵守比尔定律。最常用的检测器，应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：a.灵敏度高：其最小检测量10-9g·mL-1，故即使对紫外光吸收很弱的物质，也可以检测；b.线性范围宽；(比尔定律)c.流通池可做的很小（1mm × 10mm ，容积 8μL）；d.对流动相的流速和温度变化不敏感,可用于梯度洗脱；e.波长可选，易于操作:如，使用装有流通池的可见紫外分光光度计（可变波长检测器）。缺点：对紫外光完全不吸收的试样不能检测；同时溶剂的选择受到限制。(2). 紫外检测器的重要进展；阵列由1024个光电二极管阵列，每个光电二极管宽仅50μm，各检测一窄段波长。如图所示，在检测器中，光源发出的紫外或可见光通过液相色谱流通池，在此流动相中的各个组分进行特征吸收，然后通过狭缝，进入单色其进行分光，最后由光电二极管阵列检测，得到各个组分的吸收信号。经计算机快速处理，得三维立体谱图。(3).荧光检测器是一种高灵敏度、高选择性检测器。对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。荧光检测器的结构及工作原理和荧光光度计相似。(4).除紫外检测器之外应用最多的检测器。差示折光检测器是借连续测定流通池中溶液折射率的方法来测定试样浓度的检测器。溶液的折射率是纯溶剂（流动相）和纯溶质（试样）折射率乘以各物质的浓度之和。因此溶有试样的流动相和纯流动相之间折射率之差表示试样在流动相中的浓度。(5).电导其作用原理是根据物质在某些介质中电离后所产生电导变化来测定电离物质含量。
设备选型/高效液相色谱
要正确地选择色谱分离方法，首先必须尽可能多的 了解样品的有关性质，其次必须熟悉各种色谱方法的主要特点及其应用范围。选择色谱分离方法的主要根据是样品的相对分子质量的大小，在水中和有机溶剂中的溶解度，极性和稳定程度以及化学结构等物理、化学性质。选型常用参照表1、相对分子质量对于相对分子质量较低（一般在200以下），挥发性比较好，加热又不易分解的样品，可以选择气相色谱法进行分析。相对分子质量在200 ~ 2000的化合物，可用液固吸附、液-液分配和离子交换色谱法。相对分子质量高于2000，则可用空间排阻色谱法。2、溶解度水溶性样品最好用离子交换色谱法和液液分配色谱法；微溶于水，但在酸或碱存在下能很好电离的化合物，也可用；油溶性样品或相对非极性的混合物，可用液-固色谱法。3、化学结构若样品中包含离子型或可离子化的化合物，或者能与离子型化合物相互作用的化合物（例如配位体及有机螯合剂），可首先考虑用离子交换色谱，但空间排阻和液液分配色谱也都能顺利地应用于离子化合物；异构体的分离可用；具有不同官能团的化合物、同系物可用液液分配色谱法；对于高分子聚合物，可用空间排阻色谱法。
HPLC分析方法/高效液相色谱
通常在确定被分析的样品以后，要建立一种高效液相色谱分析方法必须解决以下问题：①根据被分析样品的特性选择适用于样品分析的一种高效液相色谱分析方法。②选择一根适用的色谱柱，确定柱的规格（柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔径）。③选择适当的或优化的分离操作条件，确定的组成、流速及方式。④由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。
应用实例/高效液相色谱
气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于400以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的75%～80%）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。&实时监测图1、环境中有机氯固定相：薄壳型硅胶(37 ～50mm)流动相：正己烷流速：1.5 mL/min色谱柱：50cm?2.5mm(内径)检测器：可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析&&实时监测图2.、稠环芳烃的分析稠环芳烃多为致癌物质。：十八烷基硅烷化键合相：20%甲醇-水 ～100%甲醇；线性梯度淋洗，2%/min流速：1mL/min柱温：50 ?C柱压：70 ?104 Pa检测器：紫外检测器3、阴离子分析双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3×250mm),流动相：0.003mol·L-1 NaHCO3 / 0.0024 mol·L-1& Na2CO3，流量138 mL/hr。七种阴离子在20分钟内基本上得到完全分离，各组分含量在3～50 ppm。
操作方法/高效液相色谱
下列优良常规操作能够最大限度降低维修费用：1、使用HPLC级试剂和流动相2、清洁的仪器、流动相和样品3、如果必要，进行过滤4、保证溶剂的相溶性5、如果必要，冲洗整个系统，去掉盐，防止污染6、对仪器的使用、维护和保养进行记录
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