植物遗传资源学报２００６，７（１）：１００～１０５
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＧｅｎｅｔｉｃＲｅｓｏｕｒｃｅｓ
植物基因功能鉴定新工具——病毒诱导基因
沉默技术的研究进展
张增艳，姚鸟兰，辛志勇
（中国农业科学院作物科学研究所／农作物基因资源与改良国家重大科学工程／农业部遗传育种重点实验室，北京１０００８１）
摘要：病毒诱导基因沉默（Ｖｉｒｕｓ—ｉｎｄｕｃｅｄｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，ＶＩＧＳ）技术是指带一段靶基因序列的ＶＩＧＳ重组病毒侵染植物、引起植物同源基因沉默与表型变异，进而通过表型变异进行基因功能分析的方法，是近年发展起来的从反向遗传学方向快速鉴定植物基因功能的技术，是转录后基因沉默机制的一种表现。①ＶＩＧＳ的分子机制，涉及基因沉默的起始、维持和信号放大、传播共３个阶段；②ＶＩＧＳ技术、载体与方法学的发展；③ＶＩＧＳ作为基因功能研究的优越性，如不必进行转基因、操作方法简便、获得结果快速等；④应用ＶＩＧＳ对植物抗病途径、代谢与发育调控中参与基因功能进行研究的概况。同时，展望了ＶＩＧＳ技术作为植物功能基因组学功能分析的高通量技术平台的美好前景。
关键词：病毒诱导基因沉默；基因功能分析；病毒载体
ＡｄｖａｎｃｅｓｏｎＶｉｒｕｓ－ｉｎｄｕｃｅｄＧｅｎｅＳｉｌｅｎｃｉｎｇｆｏｒＧｅｎｅＦｕｎｃｔｉｏｎ
ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｉｎＰｌａｎｔｓ
ＺＨＡＮＧＺｅｎｇ—ｙａｎ，ＹＡＯＷｕ—ｌａｎ，ＸＩＮＺｈｉ—ｙｏｎｇ
（ＴｈｅＳｔａｔｅＫｅｙＳｃｉｅｎｃｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆＣｒｏｐＧｅｒｍｐｌａｓｍａｎｄＧｅｎｅＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ／ＫｅｙＬａｂｏｆＣｒｏｐＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＢｒｅｅｄｉｎｇ，
ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ／ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８１）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｖｉｒｕｓ—ｉｎｄｕｃｅｄｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ（ＶＩＧＳ）ｉｓ
ｐｒｅｓｓｉｏｎｆｏｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇｇｅｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆｐｌａｎｔｓｉｎ
ｒｙｉｎｇａａｒｅｃｅｎｔｌｙｄｅｖｅｌｏｐｅｄｔｅｃｈｎｉｑｕｅｏｆｇｅｎｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓｕｐ—ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｗｈｉｃｈｉｎｖｏｌｖｅｓａａｒｅｖｅｒｓｅｖｉｒｕｓｄｅｌｉｖｅｒｙｖｅｃｔｏｒｃａｒ—ｓｈｏｒｔｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔａｒｇｅｔｅｄｇｅｎｅｔｏｉｎｆｅｃｔａｙｏｕｎｇｐｌａｎｔ，ａｎｄｉｎ
ａｆｅｗｗｅｅｋｓｎａｔｕｒａｌｄｅｆｅｎｓｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｇｅｎｅｏｆｔｈｅｐｌａｎｔｒｅｓｕｌｔｉｎｓｉｌｅｎｃｉｎｇｏｆｔｈｅｔａｒｇｅｔｅｄｇｅｎｅ．Ｉｔｉｓ
ｖｉｅｗｓｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｔｈｅｋｉｎｄｏｆｐｏｓｔ—ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．Ｔｈｅｒｅ—ｆｏｌｌｏｗｓ：①ａｐｏｓｉｔｉｖｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎＶＩＧＳ．ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｔｈｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｉｎｉｔｉａ—ｔｉｏｎ，ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ，ａｎｄｓｉｇｎａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ；②ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｏｆＶＩＧＳｔｅｃｈｎｉｑｕｅｉｎｃｌｕｄｉｎｇＶＩＧＳｖｅｃｔｏｒｓａｎｄｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ；③ａｄｖａｎｔａｇｅｓｏｆＶＩＧＳｏｖｅｒｏｔｈｅｒａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．ｓｕｃｈａｓＴ—ＤＮＡｏｒｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｔａｇｇｉｎｇ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｔｈｅｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌｓｉｍｐｌｉｃｉｔｙａｎｄｓｐｅｅｄｙｒｅｓｕｌｔｓ．④ｓｔｕｄｙｉｎｇｔｈｅｒｏｌｅｓｏｆｇｅｎｅｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｐｌａｎｔｄｅｆｅｎｓｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．ＴｈｅｒｅｖｉｅｗｐｒｏｖｉｄｅｓｔｈｅｐｒｏｓｐｅｃｔｓｆｏｒＶＩＧＳａｓａｐｏｗｅｒｆｕｌａｎｄｈｉｇｈ—ｔｈｒｏｕｇｈｔｏｏｌｆｏｒａｓｓｅｓｓｉｎｇａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｐｌａｎｔｆｕｎｃｔｉｏｎｇｅｎｏｍｉｃｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｖｉｒｕｓ—ｉｎｄｕｃｅｄｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ；Ｇｅｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ；Ｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒ
随着各种文库构建、测序和基因克隆等技术的
发展和完善，植物基因组序列与序列表达标签（Ｅｘ—
ｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅ量正在迅猛增加，为阐明这些序列及基因的生物学功能，迫切需要将序列信息转化为功能信息，对靶序列进行功能分析的快捷、高通量的工具。ｔａｇｓ，ＥＳＴ）和分离的候选基因的数
收稿日期：２００５．０８．０１修回日期：２００５—１１－０２
基金项目：国家高新计划“８６３”课题（２００４ＡＡ２２２１２０）
作者简介：张增艳（１９６３一），女。博士，研究员，博导，主要从事小麦抗病分子生物学和分子育种研究Ｔｅｌ：０１０—６８９１８７８１；Ｅ—ｍａｉｌ：Ｚｈａｎｇｚｙ＠ｍａｉｌ．ｅａａｓ．ｎｅｔ．ａｎ
万方数据　
１期张增艳等：植物基因功能鉴定新工具——病毒诱导基因沉默技术的研究进展
利用转基因获得功能（Ｇａｉｎ—ｏｆ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ）法以及Ｔ。ＤＮＡ与转座子突变等基因敲除（Ｌｏｓｓ—ｏｆ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ）方法，在候选基因功能研究方面扮演着非常重要的角色，然而它们依赖于植物转基因完善程度、稳定的转基因株系的获得或大量突变体的创造和鉴定，不仅工作量大、周期长、效率低，费时、费力，难以对大
量基因的功能进行高通量的分析。而病毒诱导基因
沉默技术则能克服上述不足，有望成为快速、高通量分析植物基因功能的技术平台。
ＶＩＧＳ技术是指携带一段靶基因表达序列的ＶＩＧＳ重组病毒侵染植物、引起植物内同源基因沉默与表型变异，进而通过表型变异进行基因功能分析的方法【１，２Ｊ。１
ＶＩＧＳ的分子机制
ＶＩＧＳ是利用植物对病毒的天然防御机制发展
的瞬时、快速鉴定植物基因功能的技术，是从基因序列到功能的反义遗传学方法，也是转录后基因沉默（Ｐｏｓｔ—ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ
ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，ＰＴＧＳ）、ＲＮＡ沉默
机制的一种表现，相似于线虫的ＲＮＡ干扰。
已在真菌、植物和动物的许多物种中发现了ＰＴＧＳ过程的同源基因和酶，因此认为ＰＴＧＳ机制在整个生物进化过程中是很保守的旧ｊ。目前关于
基因沉默的假说认为，ＰＴＧＳ包括３个阶段：起始、
维持和信号放大与传播∞，４Ｊ。双链ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）是基因沉默的起始因子。第一阶段包括ｄｓＲＮＡ形成、识别和小干扰ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡｓ）片段的产生，由ＲＮＡ病毒复制机制、源于转基因的双向克隆形成的发夹ＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）和反义ＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）克隆技术均可产生ｄｓＲＮＡ；ｄｓＲＮＡ被识别并被Ｄｉｃｅｒ酶从两端降解成２１～２３核苷酸的ｓｉＲＮＡ。在维持期，ｓｉＲ．ＮＡ与ＲＮＡ酶形成复合体即ＲＮＡ诱导沉默复合体（ＲＩＳＣ），后者具有ＲＮＡ同源性寻找活性和解旋酶活性以解旋ｄｓＲＮＡ，该复合物可被解旋的ｓｉＲＮＡ激活，鉴别单链ｓｉＲＮＡ序列和降解互补的转录产物。
在第三阶段，上述形成的ｓｉＲＮＡ作为信号被鉴别，在ＲｄＲｐ引导下，ｓｉＲＮＡ作为ｄｓＲＮＡ扩增的诱发子
并以ｓｓＲＮＡ作模板，将沉默反应放大、增强，在这个过程中，ｓｉＲＮＡ可能作为一种信号分子在植株中系
统传播，诱导更多细胞启动ＰＴＧＳ，进一步放大了
ＰＴＧＳ效应∞Ｊ。
一些研究显示ＰＴＧＳ的信号分子可以进行短距离和长距离的运动，ＰＴＧＳ在植物体内短距离的细胞间传导是通过胞间连丝进行的，而长距离的传导
方数据则是通过植物的韧皮部进行的，并且麟的信号也
可以利用植物体内ＲＮＡ的转运网络进行系统传导。
当植物病毒基因组中引入一段寄主基因片段构成重组病毒，后者侵染寄主细胞后，会激活这种植物对病毒的防御机制，表现出目标基因的功能丧失或表达活性下降的表型，进而可根据表型变化鉴定目标基因的功能。如当载体中插入片段是抗病必需基因时，ＶＩＧＳ后植物就降低了对病原的抗性、甚至丧失抗病性。
１９９５年Ｋｕｍａｇａｉ等【６。，１９９８年Ｒｕｉｚ等【７ｊ以及ｋｊｅｍｔｒｕｐ等旧Ｊ分别利用带有特定基因片段的不同病毒载体侵染本氏烟，导致了特定目标基因的沉默，开创了应用ＶＩＧＳ技术研究植物基因功能的先河。２
ＶＩＧＳ技术的发展
ＶＩＧＳ载体的发展
第一个ＶＩＧＳ载体是由模式ＲＮＡ病毒烟草花
叶病毒（ＴＭＶ）发展的。１９９５年Ｋｕｍａｇａｉ等∞ｏ在ＴＭＶ上插入了一段ＰＤＳ基因的部分序列，侵染本
氏烟后成功地诱导了ＰＤＳ基因的沉默。ＰＤＳ即八
氢番茄红素脱氢酶，是类胡卜素合成所必需的酶，具保护叶绿素免受光漂白的作用，而ＰＤＳ基因发生沉默后被侵染植物就会表现出光漂白症状。ＰＤＳ表型变异易于辨别，因此ＰＤＳ基因成为ＶＩＧＳ体系评价的参照基因。１９９８年由ＤＮＡ病毒番茄金色花叶病毒（ＴＧＭＶ）发展的ＶＩＧＳ载体，在本氏烟上成功地诱导了镁离子螯合酶的关键基因Ｓ“和转基因Ｊ，但ＴＧＭＶ载体诱导基因沉默的效率较低。１９９８年Ｒｕｉｚ等＂Ｊ以马铃薯Ｘ病毒（ＰＶＸ）作载体，实现了本氏烟ＰＤＳ基因沉默。ＰＶＸ载体的最大优点是比ＴＭＶ载体更稳定，但ＰＶＸ侵染寄主范围窄。ＴＭＶ、ＰＶＸ、ＴＧＭＶ能在接种植株上引起病症，难以解释一些精细的ＰＴ．
ＧＳ现象，而且不能侵染分生组织、影响其应用范围。
２００１年由烟草脆裂病毒（ＴＲＶ）发展的载体，诱导基因沉默的效率、持久性均优于上述载体旧Ｊ，只引起温和的病症，而且能侵染分生组织和花，已广泛用于研究烟草、番茄与马铃薯等多个基因的功能旧Ｊ。Ｇｏｓｓｅｌｅ等ｕ叫将伴随ＴＭＶＵ２的卫星病毒（ＳＴＭＶ）基因组改造、可插入外源片段，由ＴＭＶ辅助病毒提供复制和运动的蛋白，能有效地抑制ＰＤＳ等基因的表达并呈现明显的表型突变。Ｔａｏ等【１ｌＪ建立了基于中国番茄黄化衄叶病毒（ＴＹＬＣＣＮＶ）卫星ＤＮＡ８分子的ＤＮＡ卫星载体，既可以有效地抑制转基因
ｌｕｃ荧光蛋白基因发生沉默【８
植物遗传资源学报
ＧＦＰ的表达，也可高效抑制内源基因ＰＤＳ和Ｓｕ的表达。２００２年Ｔｕｒｎａｇｅ等［１２］利用大白菜曲叶病毒（ｃｂＬＣＶ）在拟南芥上建立了ＶＩＧＳ体系。Ｈｏｌｂｅｒｇ等ｕ引利用大麦条纹花叶病毒（ＢＳＭＶ）首次在单子叶植物大麦上成功抑制了ＰＤＳ基因的表达；随后Ｌａｃｏｍｍｅ等ｕ４Ｊ分别对ＢＳＭＶ病毒进行改造，以提高ＶＩＧＳ表型效应。本课题组用ＢＳＭＶ作载体在小麦上实现ＰＤＳ的ＶＩＧＳｕ５Ｉ，为快速分析小麦基因功能展示了前景。
ＶＩＧＳ必须依赖于病毒载体在寄主植物上建立有效的ＶＩＧＳ体系。迄今，ＶＩＧＳ体系在烟草上最稳定和应用得最成功。主要原因可能是烟草胞间连丝对病毒的排阻、限制要比其他植物小，也可能是多种病毒可侵染烟草、且这种植物在限制病毒积累的正常防御成分上存在一定的缺陷。
ＶＩＧＳ方法学
由于ＶＩＧＳ使用的载体是遗传修饰的病毒，
ＶＩＧＳ的应用存在一定的复杂性，必须在严格的环境条件下操作，应该考虑以下几个因素【２Ｊ。
２．２．１
ＶＩＧＳ载体的插入片段首先是长度，插入基因序列大小的上限取决于病毒在植物细胞间运动的限制，而且在病毒问与植物物种间也可能有所不同。在本氏烟中，ＰＶＸ和ＴＲＶ载体上插入的基因序列长度上限均为１．５Ｋｂ，此限以上，病毒可能不能传播而高比例地丧失插入片段，影响沉默效果；２３ｂｐ是基因沉默的下限，大于２３ｂｐ的序列会产生更有效的沉默，一般采用１５０～５００ｂｐ的片段，以保证有效沉默。二是选择靶基因的哪段序列作插入片段。默效果越好，８５％以上的同源性即可引起有效的基因沉默【６，ｌ３Ｉ。沉默的靶基因序列必须认真选择，可ｓｅａｒｃｈ等方法分析被抑制的基因是否为区域应该都可用于沉默，但如拟沉默某一家族的某Ｊ。
方数据侵染植物细胞，与体外转录法相比此法操作成本低廉，更适合进行高通量的基因鉴定【２］。根据植物的种类和实验类型，发展了用农杆菌接种的不同方法，以ＰＶＸ作ＶＩＧＳ载体，可用牙签沾取农杆菌，然后将牙签刺人烟草幼叶中，该方法适用于高通量的筛选。然而牙签法对于ＴＲＶ在番茄上传染效果不好，因此必须用注射器压滤、真空泵压滤或用农杆菌液喷雾幼苗才能获得良好的沉默效果。当ＶＩＧＳ用于其他植物时，必须选择农杆菌菌株和优化接种技术，但对于单子叶植物农杆菌介导法尚未成功。２．２．３影响ＶＩＧＳ的环境因素
成功的基因沉默
依赖于病毒传播和植物生长间相互作用的动力学，其中任一因素均受环境条件的影响，温度是病毒传播和基因有效沉默的最重要影响因素之一，ＴＲＶ在番茄上建立良好的沉默表型是在温度２１℃或２１℃以下，而ＴＲｖ在本氏烟上产生沉默的适宜温度为２５℃左右，２５～２９℃是ＢＳＭＶ在大麦上诱导基因沉默的适宜温度［１３１。生长箱可较好地保持ＶＩＧＳ实验的沉默重演性。
２．２．４
ＶＩＧＳ实验的对照与沉默效率的评价在
ＶＩＧＳ实验中设立对照非常关键。为监检沉默效率，通用的阳性对照为ＰＤＳ基因的沉默，为排除病毒载体自身可能引起的表型干扰，有必要用空载体病毒接种植物作为阴性对照，另一个内在阳性对照是用一个功能明确的内源基因序列插入病毒载体接种植物。
ＲＴ—ＰＣＲ分析可确定ＶＩＧＳ的沉默程度和特异性，半定量ＲＴ—ＰＣＲ可比较基因沉默和阴性对照中转录产物的量，明确转录产物的相对减少。３
ＶＩＧＳ技术的优越性和局限性
ＶＩＧＳ技术的优越性
ＶＩＧＳ与传统的基因功能分析方法相比，具有５
个优势点幢Ｊ。①快速：ＶＩＧＳ能够在病毒侵染植株２～３周内引起靶基因沉默、造成表型变异，从而鉴定出靶基因的功能，不必筛选巨大的群体。而基于遗传转化的功能分析方法需要产生稳定的转基因系，周期较长。②可避免植物转化和插入突变：ＶＩＧＳ只需病毒载体能侵染植物、不依赖产生转基因植物，对于转化效率低、转化困难、生长周期长的植物基因功能分析非常有利；传统的功能基因敲除、筛选过程中，对一些胚发育期必需的基因插入突变将导致致死型突变，从而得不到突变表型。但是ＶＩＧＳ在植物幼苗期和成熟期均可进行，因此利用ＶＩＧＳ对成
ＶＩＧＳ效果是基于序列同源性，同源性越高，基因沉通过Ｂｌａｓｔ基因家族的成员。对于单拷贝基因，其ＯＲＦ的任一基因，必须认真选择非保守区域或非转录区（ＵＴＲ）序列来区别具高度保守ＯＲＦｓ间基因，反之选择高度保守区可抑制基因家族的几个成员，克服可能的功能重复［２，１６２．２．２接种技术最初，以线性化的质粒ＤＮＡ为模板进行体外转录，然后以侵染性的ＲＮＡ形式，通过摩擦法接种植株幼叶，可研究少数基因功能，但该方法接种不仅费时而且结果不稳定。此后发展了农杆菌介导法，Ｔ—ＤＮＡ中插入全长的病毒ｃＤＮＡ，在ＣａＭＶ３５Ｓ启动子控制下，通过农杆菌介导法使病毒
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浙江大学硕士学位论文FunctionalofandOsBIRHlinAnalysisMgSMl，OsBIMK2DiseaseResistanceandVIGSUsingTransgenicApproachesShiYing-yingAdissertationsubmittedinfulfillmentofthepartialfortheofrequirementsdegreeMasterofPhilosophy●lnPlantPathologyatZHEJIANGUNIVERSITYSupervisor：Prof．SongFengming一一一一310058Hangzhou，ZhejiangofChinaPeople’SRepublicMay,2011本研究受《转基因生物新品种培育重大专项》资助浙江大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝婆盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解逝婆盘堂有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝姿盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：签字日期：年月日目录致{射…………………………………………………………………………………………………………·I摘要…………………………………………………………………………………………………………IIAbstract··················································································································IV第一章文献综述和研究背景……………………………………………………··11．1植物的先天免疫性………………………………………………………11．2植物的诱导抗病性………………………………………………………21．3植物的抗病信号转导途径………………………………………………·31．3．1SA信号途径………………………………………………………31．3．2JA信号途径………………………………………………………·41．3．3ET信号途径………………………………………………………51．3．4SA．JA信号途径的相互联系………………………………………51．3．5SA．ET信号途径的相互联系………………………………………61．3．6JA．ET信号途径的相互联系………………………………………61．3．7与SA．JA．ET相关的激素信号途径………………………………·71．4转基因抗病水稻研究……………………………………………………81．4．1抗真菌性病害……………………………………………………一81．4．2抗细菌性病害……………………………………………………一81．4．3抗病毒病…………………………………………………………一81．5本研究的目的意义和研究内容…………………………………………·9第二章稻瘟菌基因MgSMl的克隆和MgSMl转基因水稻的培育……………一12．1前言……………………………………………………………………………………………102．2材料与方法……………………………………………………………··112．2．1MgSMl的克隆……………………………………………………112．2．2DNA的序列测定和分析…………………………………………·122．2．4MgSMl一oe转基因水稻植株的获得………………………………·132．3结果和分析……………………………………………………………··162．3．1MgSMl．oe基因序列的克隆及序列分析…………………………·162．3．4MgSMl转基因水稻植株的获得…………………………………··182．3．4MgSMl转基因水稻植株分子鉴定………………………………··202．4讨论……………………………………………………………………………………………213．1前言……………………………………………………………………………………………·233．2材料与方法……………………………………………………………··253．2．1转OsBIMK2基因水稻的获得……………………………………253．3结果和分析………………………
正在加载中，请稍后...上传用户：qknupzjtbh资料价格：5财富值&&『』文档下载 ：『』&&『』学位专业：&关 键 词 ：&&&&&&&权力声明：若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请点击。摘要:（摘要内容经过系统自动伪原创处理以避免复制，下载原文正常，内容请直接查看目录。）植物线粒体是停止呼吸感化为细胞供给能量的主要场合，其在感知外界困境旌旗灯号，调控植物抗逆进攻反响中也饰演侧重要的脚色。植物线粒体对氧化钳制的清除机制除存在瓜代氧化酶为末尾氧化酶的瓜代电子传递链途径外，还可以经由过程线粒体解偶联卵白UCPs来削弱活性氧的发生。研讨发明，AtUCPl基因对高温、干旱等氧化钳制抗性和有用的光协作用均起着积极的感化。但是其对蔬菜作物的调理及在抗逆中的感化机制尚不清晰。是以，研讨UCPs基因在调理植物光合、呼吸感化及在抗逆反响中的感化机制无疑具有异常主要的迷信和实际意义。本文以烟草脆裂病毒(TRV)和番茄为资料，选择八氢番茄红素去饱和酶基因(PDS)作为参照基因，构建了TRV一LePDS和TRV一LeUCP重组质粒，树立了LePDS和LeUCP基因VIGS系统，LePDS基因缄默植株的叶片涌现典范的光漂白景象；LeUCP基因缄默植株其基因表达量明显下降。应用TRV一LeUCP基因缄默植株，研讨了番茄LeUCP基因对光合参数和相干酶活性、荧光参数、电子流分派的影响，剖析了LeUCP基因对线粒体呼吸、活性氧积聚、瓜代氧化酶的影响。联合三羧酸轮回中的顺乌头酸酶活性和柠檬酸含量及氧化复原状况以的变更，探明线粒体解偶联卵白对Redox状况的影响。在PQ和低温困境前提下，探明线粒体解偶联卵白在氧化钳制下能否起到掩护感化。所得重要成果以下：1、研讨了番茄LeUCP基因缄默对光协作用的影响。成果注解，TRV病毒载体侵染未惹起番茄植株发展表型差别；基因缄默植株叶片在分歧光照强度下的光合速度均低于对比植株，Pn、4sat、Vc，max值下降，气孔导度Gs进步，但对Ci无显著影响。番茄LeUCP基因缄默植株Rubisco和FBPase酶活性受克制，分离下降了23。3%和20。3%。2、研讨了番茄LeUCP基因缄默对叶绿素荧光参数的影响。LeUCP基因表达量的下降对Fv/Fm无显著影响，但下降了光化学猝灭系数(qP)和电子传递速度ETR，与Mock处置植株比拟qP值下降了54%。进步了非光化学猝灭系数NPQ，而且显著下降了Je(PSII)和分派于Je(PCR)与Je(PCO)的比例和NAD+/NADH比值。解释LeUCP基因编码的线粒体解偶联卵白对有用的光合是必须的，能够经由过程影响卡尔文轮回症结酶、从新分派PSII的电子流比例、下降电子传递速度和光呼吸而起感化。3、研讨了番茄LeUCP基因缄默对呼吸感化和Redox状况的影响。基因缄默植株线粒体总呼吸和瓜代呼吸降低显著，克制AOXl基因家族的基因表达，个中对AOXla基因表达量影响明显。LeUCP基因表达量的下降影响复原态泛醌的含量和丙酮酸含量，分离较Mock降低了54。3%和29。1%，注解线粒体瓜代氧化酶息争偶联卵白二者呈协同表达关系。三羧酸轮回中的顺乌头酸酶活性和柠檬酸含量与Mock比拟分离下降34。6%、14。4%。NADH含量增长且NAD+/NADH显著降低，注解线粒体解偶联卵白对保持Redox状况起必定感化。4、研讨了PQ和低温氧化钳制下解偶联卵白基因的呼应。与Mock和TRV组植株比拟，LeUCP基因缄默引诱了植株叶片H2O2和O2。一的积聚，而且在PQ和低温钳制处置下，ROS积聚明显增长，个中PQ处置后H2O2和O2。一分离较Mock增长44。67%和23%。PQ钳制后形成了严重的氧化钳制，Fv/Fm显著降低，MDA含量增长。CAT1、CAT2、SOD、cAPX、GR、POD基因表达量进步，但TRV一LeUCP+PQ依然低于Mock+PQ与TRV+PQ。与Mock比拟，PQ处置植株进步了AsA、GSH的含量，而且AsA/DHA、GSH+GSSG也有所增长，但TRV一LeUCP+PQ处置植株叶片AsA含量和GSH含量均低于Mock+PQ与TRV+PQ处置，进一步注解LeUCP对保持Redox旌旗灯号均衡和加强氧化钳制抗性具有主要感化。Abstract:Plant mitochondria was stopped breathing action is the main occasion of cell energy supply, the in the perception of the distress signal, in the regulation of plant stress resistance attack response plays important role. Plant mitochondria against oxidative clamp clearance mechanisms in addition to alternately oxidase exists for oxidase at the end of the alternating electron transport chain way, but also through the process of mitochondrial uncoupling proteins UCPs to weaken the occurrence of reactive oxygen species. Study found that AtUCPl gene of high temperature and drought resistant oxidation clamp and useful photosynthesis plays an active role. But it is not clear about the regulation of vegetable crops and the action mechanism in the anti reverse. In order to study the effect of UCPs gene on the photosynthesis, respiration and the effect of anti - adverse reaction in the process of regulating the plant, it is undoubtedly of important scientific and practical significance. This paper to tobacco rattle virus (TRV) and tomato as material, choose eight hydrogen tomato red element to desaturase (PDS) gene as a reference gene to construct the TRV a LePDS and TRV leucp recombinant, set LePDS and leucp gene VIGS system, LePDS gene silencing plant leaf Chung now classic l leucp gene silencing plant gene expression significantly decreased the amount. Research application of TRV a leucp gene silencing plant tomato leucp gene on photosynthetic parameters and related enzyme activity, fluorescence, electron flow distribution effect, analyzes the influence of leucp gene of mitochondrial respiration, active oxygen accumulation, alternately oxidase. Combined with the tricarboxylic acid cycle in the CIS aconitase activity and citric acid content and oxidative changes to the restoration and proven mitochondrial uncoupling protein on redox status. In the PQ and low temperature dilemma under the premise of proven mitochondrial uncoupling could play a role in protein oxidation under cover clamp. The important results are as follows: 1, the paper discusses the effect of LeUCP gene silence on tomato photosynthesis. Results annotations, TRV viral vector infection did not cause tomato plant growth
gene silencing in plant leaves in different light intensity of light velocity were lower than the contrast plants, PN, 4sat, VC, max value decreased, stomatal conductance (GS) progress, but on CI no significant effect. The Rubisco and FBPase enzyme activities of tomato LeUCP gene were restrained, and the isolation decreased by 23. 3% and 20. 3%. 2, the effects of LeUCP gene silence on chlorophyll fluorescence parameters were studied. The decrease of LeUCP gene expression had no significant effect on Fv/Fm, but decreased photochemical quenching coefficient (qP) and electron transfer rate ETR, and the qP value decreased by 54% compared with Mock treatment plants. The non photochemical quenching coefficient NPQ was improved, and the Je (PSII) and the ratio of Je (PCR) and Je (PCO) and NAD+/NADH ratio were significantly decreased. Explain leucp gene coding for the mitochondrial uncoupling protein to useful light is necessary, can through the influence of Calvin cycle the crux of the enzyme, from the new distribution of PSII electron flow ratio, decreased electron transfer speed and photorespiration and action. 3. The effects of LeUCP gene silence on respiration and Redox status were studied. Gene silencing plant mitochondrial respiration and alternant respiration decreased significantly, the restraint of the AOX1 gene family gene expression and medium gene of AOXla expression was affected obviously. The decrease of the expression of LeUCP gene affected the content of recovery and the content of pyruvate, and the separation of Mock decreased by 54. 3% and 29. 1%, note the mitochondrial oxidase and turn two protein coupling a synergistic relationship between the expression of. Three carboxylic acid in the transmigration of aconitase activity and citric acid content decreased by 34 compared with Mock separation. 6%, 14. 4%. The content of NADH and NAD+/NADH significantly decreased growth, notes on the Redox of mitochondrial uncoupling protein has certain efficiency. 4, the PQ and uncoupling protein gene with low temperature oxidation under control. Compared to the Mock and TRV groups, LeUCP gene silencing induced plant leaves H2O2 and O2. An accumulation, but also in the PQ and ROS accumulation under low temperature control treatment, significantly increased, the PQ and O2 H2O2 after treatment. A separate Mock growth of 44. 67% and 23%. PQ clamp was formed after oxidation to suppress serious, Fv/Fm decreased, MDA content increased. CAT1, CAT2, SOD, cAPX, GR, POD gene expression, but LeUCP+PQ a TRV is still lower than Mock+PQ and TRV+PQ. Compared with mock, PQ treatment plant progress the contents of ASA, GSH, and ASA / DHA, GSH+GSSG also increased, but TRV LeUCP+PQ disposal plant leaf ASA content and GSH contents were lower than the handling of Mock+PQ and TRV+PQ. Further notes leucp to maintain redox signal equalization and strengthen the clamping of the oxidation resistance plays an important role.目录:致谢5-6摘要6-8Abstract8-10缩略词表11-13目录13-171 引言17-27&&&&1.1 病毒诱导的基因沉默(VIGS)17-21&&&&&&&&1.1.1 VIGS的发现与发展18&&&&&&&&1.1.2 VIGS的作用机制18-19&&&&&&&&1.1.3 VIGS在植物基因功能研究中的原理与应用19&&&&&&&&1.1.4 影响VIGS沉默效率的因素19-21&&&&&&&&1.1.5 VIGS技术的优缺点21&&&&1.2 植物线粒体解偶联蛋白21-26&&&&&&&&1.2.1 解偶联蛋白的发现历程22&&&&&&&&1.2.2 解偶联蛋白的结构、基因表达与分布22-23&&&&&&&&1.2.3 解偶联蛋白的解偶联机制23-24&&&&&&&&1.2.4 线粒体活性氧的产生24-25&&&&&&&&1.2.5 线粒体解偶联蛋白在增强植物抵御逆境胁迫中的作用25&&&&&&&&1.2.6 植物解偶联蛋白与交替氧化酶的相互关系25-26&&&&1.3 本文的研究目的和意义26-272 番茄LePDS与LeUCP基因沉默(VIGS)体系的建立27-43&&&&2.1 材料与试剂27-29&&&&&&&&2.1.1 植物材料27&&&&&&&&2.1.2 菌株与质粒27&&&&&&&&2.1.3 酶及试剂27-28&&&&&&&&2.1.4 引物序列28&&&&&&&&2.1.5 常用试剂配制28-29&&&&2.2 实验方法29-34&&&&&&&&2.2.1 番茄叶片总RNA提取、纯化和cDNA合成29&&&&&&&&2.2.2 番茄LePDS、LeUCP cDAN片段PCR扩增29-30&&&&&&&&2.2.3 DNA片段的电泳纯化回收30-31&&&&&&&&2.2.4 回收DNA片段与pGEM-T easy载体连接31&&&&&&&&2.2.5 大肠杆菌DH5a感受态的制备及连接产物的转化31-32&&&&&&&&2.2.6 序列测定及分析32&&&&&&&&2.2.7 质粒DNA提取32-33&&&&&&&&2.2.8 质粒酶切鉴定33&&&&&&&&2.2.9 农杆菌GV3101电转化感受态细胞的制备及电转化33-34&&&&&&&&2.2.10 番茄幼苗VIGS侵染方法34&&&&2.3 结果与分析34-41&&&&&&&&2.3.1 番茄LePDS、LeUCP基因PCR扩增34-35&&&&&&&&2.3.2 目的基因片段与pGEM-T easy的连接与测序鉴定35-37&&&&&&&&2.3.3 含目的基因片段pGEM-T easy质粒酶切回收与鉴定37&&&&&&&&2.3.4 病毒载体TRV-LePDS、TRV-LeUCP构建37-40&&&&&&&&2.3.5 番茄LePDS基因沉默植株表型观察40&&&&&&&&2.3.6 番茄植株LePDS基因沉默效率40-41&&&&2.4 讨论41-433 番茄线粒体解偶联蛋白基因(LeUCP)沉默植株鉴定及其对番茄光合作用的影响43-56&&&&3.1 材料培养与试验设计43-44&&&&3.2 试验方法44-46&&&&&&&&3.2.1 总RNA提取、纯化和cDNA合成44&&&&&&&&3.2.2 生物量的测定44&&&&&&&&3.2.3 光合气体交换与叶绿素荧光测定44&&&&&&&&3.2.4 Rubisco活性的测定44-45&&&&&&&&3.2.5 FBPase活性的测定45&&&&&&&&3.2.6 PSⅡ光化学量子效率(ΦPSⅡ)和碳同化量子产量(ΦCO_2) 的测定45&&&&&&&&3.2.7 其它电子流的计算45-46&&&&&&&&3.2.8 叶绿素荧光成像分析46&&&&3.3 结果与分析46-53&&&&&&&&3.3.1 番茄LeUCP基因沉默对番茄植株的表观、地上部与根系生物量的影响46-47&&&&&&&&3.3.2 病毒TRV的分子检测47-48&&&&&&&&3.3.3 番茄LeUCP基因沉默植株的鉴定48&&&&&&&&3.3.4 番茄LeUCP基因沉默对光合作用光响应曲线的影响48-49&&&&&&&&3.3.5 番茄LeUCP基因沉默对光合参数的影响49-51&&&&&&&&3.3.6 番茄LeUCP基因沉默对Rubisco及FBPase活性的影响51&&&&&&&&3.3.7 番茄LeUCP基因沉默对叶绿素荧光参数的影响51-52&&&&&&&&3.3.8 番茄LeUCP基因沉默对电子流分配的影响52-53&&&&3.4 讨论53-564 番茄线粒体解偶联蛋白基因(LeUCP)沉默对番茄呼吸作用及抗逆性的影响56-80&&&&4.1 材料培养和试验设计56-57&&&&&&&&4.1.1 材料培养57&&&&&&&&4.1.2 试验设计57&&&&4.2 试验方法57-63&&&&&&&&4.2.1 总RNA提取、纯化和cDNA合成57-58&&&&&&&&4.2.2 呼吸速率的测定58&&&&&&&&4.2.3 细胞色素氧化酶活性的测定58-59&&&&&&&&4.2.4 丙酮酸含量的测定59&&&&&&&&4.2.5 泛醌库氧化还原状态的测定59&&&&&&&&4.2.6 线粒体顺乌头酸酶含量的测定59-60&&&&&&&&4.2.7 柠檬酸含量的测定60&&&&&&&&4.2.8 NADH及NAD~+的测定60&&&&&&&&4.2.9 H_2O_2含量测定60-61&&&&&&&&4.2.10 H_2O_2和O_2~(.-)组织化学染色61&&&&&&&&4.2.11 叶片O_2~(.-)产生速率的检测61&&&&&&&&4.2.12 叶绿素荧光成像分析61-62&&&&&&&&4.2.13 丙二醛(MDA)含量的测定62&&&&&&&&4.2.14 抗氧化酶活性的测定62-63&&&&&&&&4.2.15 AsA和DHA含量和谷胱甘肽含量的测定63&&&&4.3 结果与分析63-77&&&&&&&&4.3.1 番茄LeUCP基因沉默对呼吸作用的影响63-64&&&&&&&&4.3.2 番茄LeUCP基因沉默对细胞色素氧化酶及其基因表达的影响64-65&&&&&&&&4.3.3 番茄LeUCP基因沉默对交替氧化酶基因表达的影响65-66&&&&&&&&4.3.4 番茄LeUCP基因沉默对泛醌库和丙酮酸含量的影响66&&&&&&&&4.3.5 番茄LeUCP基因沉默对线粒体顺乌头酸酶活性和柠檬酸含量的影响66-67&&&&&&&&4.3.6 番茄LeUCP基因沉默对NADH含量及其氧化还原状态的影响67-68&&&&&&&&4.3.7 PQ对番茄LeUCP基因表达量的影响68-69&&&&&&&&4.3.8 番茄LeUCP基因介导PQ对H_2O_2含量的影响69&&&&&&&&4.3.9 番茄LeUCP基因介导PQ对O_2~(.-)含量的影响69-71&&&&&&&&4.3.10 番茄LeUCP基因介导番茄对PQ抗性的调控71&&&&&&&&4.3.11 番茄LeUCP基因介导PQ对MDA的影响71-72&&&&&&&&4.3.12 番茄LeUCP基因介导PQ对抗氧化酶活性的影响72-74&&&&&&&&4.3.13 番茄LeUCP基因介导PQ对番茄抗坏血酸和谷胱甘肽含量的影响74-75&&&&&&&&4.3.14 番茄LeUCP基因介导高温对H_2O_2和O_2~-含量的影响75-77&&&&4.4 讨论77-805 结论80-81参考文献81-91个人简历及发表文章91分享到：相关文献|}