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2蛋白表达及磷酸化的影响
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磷酸化蛋白之western_blot检测操作细节和注意事项
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【求助】请教western用PBS和TBS会有什么影响吗？
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这个帖子发布于9年零314天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
就是配封闭液和洗膜的时候似乎有些资料写的用PBS/PBST，有些写得TBS/TBST
不知道邀请谁？试试他们
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提供PBS与TBS的优缺点： ⑴ 磷酸盐缓冲液
磷酸盐是生物化学研究中使用最广泛的一种缓冲剂，由於它们是二级解离，有二个pKa值，所以用它们配制的缓冲液，pH范围最宽：
pKa1＝2.12，
pKa2＝7.21
pKa1＝7.21，
pKa2＝12.32
配酸性缓冲液： 用
NaH2PO4，pH＝1～4，
配中性缓冲液： 用混合的两种磷酸盐，pH＝6～8，
配碱性缓冲液： 用
Na2HPO4，pH＝10～12。
用钾盐比钠盐好，因为低温时钠盐难溶，钾盐易溶，但若配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的缓冲液时，只能用磷酸钠而不能用磷酸钾，因为SDS（十二烷基硫酸钠）会与钾盐生成难溶的十二烷基硫酸钾。
磷酸盐缓冲液的优点为：①容易配制成各种浓度的缓冲液；②适用的pH范围宽；③pH受温度的影响小；④缓冲液稀释后pH变化小，如稀释十倍后pH的变化小于0.1。
其缺点为：①易与常见的钙Ca++离子、镁Mg++离子以及重金属离子缔合生成沉淀；②会抑制某些生物化学过程，如对某些酶的催化作用会产生某种程度的抑制作用。
⑵Tris（三羟甲基氨基甲烷，N-Tris(hydroxymethyl)aminomethane）缓冲液
Tris缓冲液在生物化学研究中使用的越来越多，有超过磷酸盐缓冲液的趋势，如在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中已都使用Tris缓冲液，而很少再用磷酸盐。
Tris缓冲液的常用有效pH范围是在“中性”范围，例如：
Tris-HCl缓冲液：
pH＝7.5～8.5
Tris-磷酸盐缓冲液：
pH＝5.0～9.0
配制常用的缓冲液的方法有两种：①按一般书后附录中所列该缓冲液表中的方法，分别配制0.05mol/L Tris和0.05mol/L HCl溶液，然后按表中所列体积混合。由于标准浓度的稀盐酸不易配制，所以常用另一种方法；②若配1L
0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液：先称12.11g Tris碱溶于950mL～970mL 无离子水中，边搅拌边滴加4N HCl，用pH计测定溶液pH值至所需的pH值，然后再加水补足到1L。
Tris-HCl缓冲液的优点是：
①因为Tris碱的碱性较强，所以可以只用这一种缓冲体系配制pH范围由酸性到碱性的大范围pH值的缓冲液；②对生物化学过程干扰很小，不与钙、镁离子及重金属离子发生沉淀。
其缺点是：①缓冲液的pH值受溶液浓度影响较大，缓冲液稀释十倍，pH值的变化大于0.1；②温度效应大，温度变化对缓冲液pH值的影响很大，即：
△pKa／℃＝－0.031
，例如：4℃时缓冲液的pH＝8.4，则37℃时的pH＝7.4，所以一定要在使用温度下进行配制，室温下配制的Tris-HCl缓冲液不能用于0℃～4℃。
③易吸收空气中的CO2，所以配制的缓冲液要盖严密封。 ④此缓冲液对某些pH电极发生一定的干扰作用，所以要使用与Tris溶液具有兼容性的电极。
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哦，多谢阿不过看起来似乎不会影响抗体免疫实验？
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PBS不适合AP系列,PBS/TBSS适合AP和HRP体系;另外,做磷酸化蛋白的WB,PBS不合适.
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如果用碱性磷酸酶来催化底物显色，那么就不能用PBS或者PBST。
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哦，这样，多谢两位
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这样，多谢两位
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Tris大一接触的，现在用到PBS,TBS再回来重新认识，谢啦！
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关于丁香园甲基硝基亚硝胍处理的vero细胞中 磷酸化蛋白的差异显示-医学教育网-青年人
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甲基硝基亚硝胍处理的vero细胞中&磷酸化蛋白的差异显示
来源：青年人()&更新时间： 18:20:35 &【字体： 】
摘　要　目的：初步了解哺乳类细胞非定标性突变形成是否与以蛋白质磷酸化级联反应为主要形式的细胞信号传导通路有关；方法：采用［32P］体内预标记及凝胶双向电泳方法差异显示甲基硝基亚硝胍(MNNG)处理组和对照组磷酸化蛋白，蛋白质免疫印迹杂交试验初步鉴定差异显示蛋白斑点性质；结果：在处理组发现两个与对照组不同的蛋白斑点，分子量分别在68×103和43×103附近，与抗酪氨酸磷酸化蛋白抗体未发生阳性反应；结论：根据差异显示蛋白斑点的分子量和印迹杂交试验结果，初步认为所见蛋白斑点可能为丝/苏氨酸磷酸化蛋白，且可能为丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)成员。　　主题词　甲硝基亚硝胍；突变； 蛋白质类； 信号传递
Differential display of phosphorylated protein in MNNG treated vero cells
SUN Xue-Min, YU Ying-Nian, CHEN Xing-RuoDepartment of Pathophysiology and Laboratory of Medical Molecular Biology, Hangzhou (310031)
　　Abstract AIM：To explore the potential relationship between nontargeted mutagenesis and the cascades of protein phosphorylation of signal transduction pathways in cells. METHOD：Differential display of phosphorylated protein in cells treated with MNNG (methylnitronitrosoguanidine) and those with dimethyl sulfoxide (control) were performed with ［32P］ i Western blotting test was employed to identify the property of the protein. RESULTS：There are two differential displayed phosphorylated proteins reacted negatively with antiphosphotyrosine in MNNG treatment cells. CONCLUSION：The molecular weight of two proteins and the results of Western blot suggested that the two differential displayed phosphorylated proteins may be Ser/Thr phosphoproteins and probably members of the MAPK.　　MeSH　Methylnitronitrosoguanidine；M P Signal transduction
　　非定标性突变是发生在DNA损伤剂攻击部位之外的突变。在其特征和机制的研究方面，我们已经获得一些重要的线索，如突变的DNA序列特异性，提示与定标性突变有着不同的生成机制［1］；突变发生的时相关系，提示突变的形成需要有新合成蛋白质的参与［2］。最使我们感兴趣的是在哺乳类细胞基因转录或翻译被阻断的情况下，突变率的变化截然不同［3］。这一方面可以肯定非定标性突变形成过程中存在基因表达的改变，另一方面也说明了这种改变的复杂性。　　近年来对DNA损伤反应的深入研究为探索非定标性突变形成机制提供了丰富的信息和广阔的思维空间。已知DNA损伤剂可引起多达几十种基因的表达改变或其产物修饰改变，最终细胞或者因获得修复而生存，或者走向程序性死亡。但是生存的细胞内仍可留有DNA损伤剂作用的烙印，即各种突变的存在。从最初的基因表达改变到最后的结局之间由细胞内一系列信号传导系统串联，其中蛋白质磷酸化级联反应是最主要的方式。有的蛋白激酶可直接由DNA损伤激活，如DNA依赖性蛋白激酶(DNA-activated protein kinase, DNA-PK)［4］，有的间接通过细胞膜上的酪氨酸激酶激活，如丝裂原激活的蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase, MAPK)［5］。　　由于非定标性突变不是DNA直接受攻击的结果，那么在损伤部位到突变部位之间必然存在特定的联系。这种联系是否属于蛋白质磷酸化级联反应?是何种类型的磷酸化反应?我们试图通过比较甲基硝基亚硝胍(N-methyl-N’nitro－N-nitrosoguanidine, MNNG)处理和非处理细胞磷酸化蛋白的差异显示来初步回答这个问题。
材料与方法　　(一)细胞分组：非洲绿猴肾vero细胞用含10%小牛血清的DMEM(Gibco)常规培养，实验时将细胞分为3组：　　A组：MNNG(Fluka)处理组，0.2μmol/L MNNG处理2.5h；　　B组：MNNG+Chm(cycloheximide, S蛋白质合成抑制剂)处理组，MNNG处理结束后，用含1 mg/L Chm的培养基继续处理12h；　　C组：DMSO(二甲基亚砜，MNNG的溶剂)对照组，0.2% DMSO处理2.5h。　　(二)细胞预处理和同位素预标记：3组细胞用全培养基培养24h，无磷酸盐的DMEM(Sigma)培养基作磷饥饿处理12h，在分别以含MNNG(A、B组)和DMSO(C组)的无磷培养基处理2.5h后，用含［32P］正磷酸盐(DupontTM,比活度3.7×1010Bq/mmol，放射强度3.7×1011Bq/L;在细胞培养基中的浓度为3.3μmol/L，放射强度为2.442×1010Bq／L)的无磷培养基预标记12h，其中B组培养基中同时含有1mg/L Chm。　　(三)制备细胞蛋白样品：标记后的细胞用胰蛋白酶消化，将细胞悬液移于1.5mL Eppendorf管，用PBS清洗3次，吸净残液，每管加样品溶液(10% SDS，0.15mol/L DTT)30μL，煮沸5min，冷却后加120μL抑蛋白酶溶液，20μL　DNase-RNase,混匀，室温放置5min，12000r/min，离心5min，上清液煮沸3min，冷却后上样电泳。　　(四)蛋白质双向凝胶电泳：按Bio-Rad仪器说明书提供的方法配制等电聚焦凝胶柱，每种蛋白质样品上样30μL，连续电泳20h(电压200V 2h，500V 2h,800V 16h)后，将柱胶放置到12% SDS凝胶板上缘，在柱胶一端加5μL蛋白质分子量标准(Gibco,high range),25mA/板电泳1h，40mA/板电泳6.5h。　　(五)蛋白质印迹电转移：电泳结束后，取下凝胶，用去离子水略事漂洗后将凝胶放入电转移夹，在LKB 2005 Transphor Electroblotting Unit上将凝胶蛋白转移至硝酸纤维素膜(NC膜)。电转移条件：电压50%，电流0.6～1.2Am,时间2.5h。　　(六)压片、读片：NC膜用去离子水略漂洗后以保鲜膜封闭，放入暗盒，-70℃曝光12～36h后显影。　　(七)蛋白质免疫印迹杂交(Western blotting):分别用购自Boehringer Mannheim公司的抗磷酸酪氨酸蛋白检测试剂盒(antiphosphotyrosine-POD,抗体1)和Immunotech公司的抗磷酸酪氨酸抗体(phosphotyrosine-KLH,抗体2)对差异显示的磷酸化蛋白进行Western blotting实验。抗体1操作按试剂盒说明书。NC膜在Stripping buffer中50℃缓摇1h，TBS洗膜10min×3次，封闭液室温处理1h，抗体1室温处理2h，TBS洗膜5min×6次，化学发光液反应60s，暗盒曝光5min；抗体2在膜用封闭液处理后室温温育2h，碱性磷酸酶酶联二抗处理1 h，继之生色反应。阳性对照(phosphotyrosine-BSA)试验均同步进行。
结　果　　在总共3次实验中，第一次实验将细胞分为A和C两组，第二和第三次分为A、B和C三组，三次A组和两次B组照片均在相似位置上发现两个蛋白斑点，分子量分别在68×103和43×103附近，而C组在相应位置无明显斑点。见图1(A、B：第一次实验；C：第三次实验)。　　Western blotting实验中，NC膜上磷酸化蛋白相应位点未出现明显的印迹斑点。阳性对照膜也无斑点显现。为检验阳性对照的质量，我们做了两方面的工作：1)将抗体1(anti-phosphotyrosine-POD)直接点膜后与化学发光剂反应，发光强烈，证明抗体的发光反应正常；2)将phosphotyrosine-BSA直接点膜，分别用抗体1和抗体2与之反应，继之化学发光或酶联显色，均未见明显蛋白斑点。提示试剂盒标准抗原可能存在质量问题。
Fig 1 Differential display of phospho proteins in vero cells pretreated with MNNG or DMSOA: DMSO；　B:MNNG；　C：MNNG+Chm； →:Phospho protein图1　MNNG或DMSO预处理的vero细胞磷酸化蛋白的差异显示
讨　论　　在DNA损伤反应研究中发现，紫外线、离子辐射、烷化剂、抗肿瘤药物和过氧化氢等DNA损伤剂可诱导细胞内多种基因快速或持续表达，尤其在对紫外线的研究中有证据表明它可与生长因子共用膜上受体及其它信号传导组成成分［5］。此外，已有实验证实烷化剂甲基磺酸甲酯、肿瘤坏死因子和白介素1也通过细胞膜src蛋白(src癌基因产物，具有酪氨酸激酶活性)经生长因子通路影响核内基因表达［6］。虽然对DNA损伤剂引起细胞内信号传导的初始信号出自何处(即由核内DNA损伤部位发出信号返回到膜上还是直接由膜上发出信号)尚存争议［5］，但它们肯定动用了细胞内信号通路而产生对细胞的各种效应，如DNA损伤、DNA修复、突变形成以及细胞凋亡。已有的研究结果也提示MNNG通过影响基因表达而最终导致非定标性突变频率的变化［3］。　　蛋白质磷酸化反应是细胞信号传导的主要方式。大多数生长因子受体具有酪氨酸激酶活性，可使下游蛋白分子中酪氨酸磷酸化；Ras通路中Raf及其后续分子则以丝/苏氨酸激酶为主，其中MAPK是细胞内外各种来源信号的汇集点，它有三种激酶类型，分别为：细胞外信号调节激酶(ERKs,extracellular signal regulated kinases, 44/42×103),c-Jun氨基末端激酶激(JNK，c-Jun N-terminal kinase, 46/55×103)/应激激活的蛋白激酶(SAPK，stress activated protein kinase, 54×103)和再激活激酶(p38/RK,reactivated kinase, 38×103)，这三种激酶分别联系生长因子、紫外线、渗透压、细胞因子和生理应激等信号，既有分工，又有联系［7．8］。不仅如此，近年的研究还发现MAPK是Ras通路与细胞内另一通路JAKs-STAT(Just another kinases-signal transducers and activators of transcrition)通路的交汇点。因此，MAPK在调节基因转录时就可能通过两种不同的途径：激活Ras通路中的下游成员或激活STAT［9］。　　本研究结果可见在MNNG单独处理和MNNG+Chm处理后，细胞蛋白中出现两个明显的不同于对照的蛋白斑点，其泳动位置在相对于蛋白质分子量标准68×103和43×103附近，与MAPK的分子量十分接近。根据已发表论文中Chm使MNNG引起的非定标性突变率显著增高的结果［3］，联系文献所见几乎所有的蛋白质合成抑制剂均可延长MAPK系统激活时间而使后续反应增强［8］，结合本文中MNNG与MNNG+CHM的相似表现，我们推测所见蛋白斑点可能为丝/苏氨酸磷酸化蛋白，并且可能为MAPK成员。且两次抗磷酸酪氨酸抗体的印迹反应结果均为阴性。虽然由于阳性对照的质量问题使得此结果不甚明朗，但3次蛋白质双向电泳重复实验显示出的分子量均在MAPK附近，这一提示非常强烈。本实验室正在进行的相关实验，有可能明确证明这一问题。
*国家和浙江省自然科学基金资助 No.；No.396054
作者单位：孙雪敏　△杭州医学高等专科学校预防医学教研室(杭州 310012)　　　　　余应年　陈星若　浙江医科大学病理生理学教研室及医学分子生物学实验室(杭州 310031)
参考文献1　Zhang X, Yu Y, Chen X. Evidence for nontargeted mutagenesis in a monkey kidney cell line and analysis of its sequence specificity using a shuttle-vector plasmid. Mutar Res, 5.2　孙雪敏，余应年，张小山，等.MNNG所致哺乳类细胞非定标性突变的时相分析.中国药理学与毒理学杂志，.3　孙雪敏，余应年，张小山，等.转录和翻译抑制对哺乳类细胞非定标性突变形成的影响.癌变、畸变、突变，6.4　孙雪敏，余应年.DNA-PK研究进展.国外医学遗传学分册，3.5　孙雪敏，余应年.UV反应不一定等同于DNA损伤反应.生物化学与生物物理进展，4.6　Canman CE, Kastan MB. Three paths to stress relief. Nature, 3.7　Cano E, Mahadevan LC. Parallel signal processing among mammalian MAPKs. Trends Biochem Sci, .8　Kyriakis JM, Banerjee P, Nikolakaki E, et al. The stress-activated protein kinase subfamily of c-Jun kinases. Nature. 6.9　Barinaga M. Two major signaling pathways meet at MAP-kinase. Science, 73.
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