RNA-Seq和基因表达芯片相比，哪种方法更有优势？关键看适用不适用。那么RNA-Seq适用哪些研究方向？是否适合您的研究？来跟随本文了解一下RNA测序相对基因表达芯片有什么优势吧~~&无假设的研究设计和更高的发现能力RNA-Seq是一种基于测序的强大方法，让研究人员能够打破传统技术的低效和花费，如实时定量PCR（RT-PCR）和芯片。无论是将RNA-Seq添加到现有的研究方法中，还是从一种方法彻底转换到另一种，RNA-Seq都带来了许多显而易见的优势。这种方法不需要预先设计的探针，因此数据集是无偏倚的，实现了无假设的实验设计【2,3】。这种类型的NGS分析对转录本和变异发现研究而言是一种有力工具，而传统的芯片方法无法实现。更宽的动态范围和更高的灵敏度芯片测定连续探针强度，而RNA-Seq不同，它对与参考序列比对的单条序列进行定量，产生了离散的（数字）读数【2】。此外，通过增加或减少测序读数（覆盖水平或覆盖深度），研究人员可以微调实验的灵敏度，以适应不同的研究目标。这个过程的数字化属性以及控制覆盖水平的能力支持一个非常宽的动态范围，提供绝对而不是相对的表达值【1-3】。假设有万条定位读数，则RNA-Seq的动态范围可跨越5个数量级（&105），这通常比大多数芯片技术（103）高出几个数量级【2,4】。因此，研究表明，RNA-Seq可检测的差异表达基因比例比表达芯片更高，特别是低丰度的基因【4,5】。检测选择性剪接位点和新型异构体以及非编码RNA的能力除了基因表达谱分析，RNA-Seq还能鉴定选择性剪接异构体、剪接位点和等位基因特异的表达–所有这些都在单个实验中完成【1,2】。此外，RNA-Seq还能测序极短的片段，且文库制备方法可包含或排除mRNA提取，这样它就能检测并测序小RNA及多种形式的非编码RNA，如小干扰RNA（siRNA）、microRNA（miRNA ）、核仁小RNA（snoRNA）及转运RNA（tRNA）【1,2】。测序小片段的能力也让降解的RNA样品产生高质量的数据，如福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）样品【6】。随着转录组的新特征被不断发现，测序数据还可以重新分析。对于芯片，假设原始样品仍然可用，样品也必须重新走完整个芯片流程，从探针设计到实验室工作【7】。总之，RNA-Seq相对于芯片而言具有很多优势（表1）。它带来转录组范围的覆盖、宽的动态范围以及高灵敏度的独特组合，让研究人员能够研究和了解正常发育和疾病的分子机制。表1 RNA-Seq技术与表达芯片的比较&总结RNA-Seq相对基因表达芯片的优势在转录本水平提供灵敏且准确的基因表达测定产生定性且定量的数据&捕获剪接点、融合、编码及多种形式的非编码RNA，如siRNA、miRNA、snoRNA和tRNA覆盖非常宽的动态范围在降解RNA上表现出色，如FFPE组织样品在数据中维持和追踪链特异的信息为发现型的应用带来一种更强大的方法在大型研究和大量样品时可扩展有了这些优势，RNA-Seq正在推动研究的步伐，在多个领域催生高影响力的论文，包括癌症研究、复杂疾病和病毒学RNA-Seq适用哪些研究方向？&转化医学--癌症研究通过RNA测序 (RNA-Seq)来监控癌症基因表达和转录组改变，能帮助回答疾病分类和进展等研究问题。癌症积累了大量的遗传改变，但通常只有少数改变能真正推动肿瘤发展。&转化医学--复杂疾病研究基因表达的差异与个体间的表型变异相关联。表达数量性状位点 (eQTL) 调控mRNA表达水平，让研究人员能有效地将表达水平定位到个体之间基因组中的差异。基础研究--农业基因组学RNA测序正在彻底改变动植物中基因表达的探索，为发育、疾病和压力状态下的表达水平改变提供新的见解。它可用于阐明基因和蛋白的功能及相互作用，鉴定动物或植物基因组所产生的组织特异的RNA转录本列表（mRNA、非编码RNA和小RNA），以及SNP发现。基础研究--细胞生物学估计蛋白质丰度和翻译调控，在基因组学/转录组与蛋白质组学之间架起桥梁，从而增加了从RNA-Seq中获得的mRNA丰度信息。参考文献【1】 Ozsolak F, Milos PM. RNA-Sequencing: advances, challenges and opportunities. Nat Rev Genet. -98.【2】Wang Z, Gerstein M, Snyder M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. -63.【3】 Wilhelm BT, Landry JR. RNA-Seq—quantitative measurement of expression through massively parallel&RNA-Sequencing. Methods. -57.【4】 Zhao S, Fung-Leung WP, Bittner A, Ngo K, Liu X. Comparison of RNA-Seq and microarray in transcriptome profiling of activated T cells. PLoS One. (1):e78644.【5】 Wang C, Gong B, Bushel PR, et al. The concordance between RNA-Seq and microarray data depends on&chemical treatment and transcript abundance. Nat Biotechnol. -932.【6】&Illumina (2014) TruSeq RNA Access Library Prep Kit Data Sheet (/content/dam/illumina-marketing /documents/products/datasheets/datasheet-truseq-rnaaccess.pdf).【7】 Illumina (2011) RNA-Seq Data Comparison with Gene Expression Microarrays White Paper (www./wp-content/uploads/Illumina _whitepaper.pdf).【8】 Grant award data obtained from the NIH website (projectreporter.nih.gov). Accessed March 2016.来源：生物通美吉生物(Majorbio)
　文章为作者独立观点，不代表大不六文章网立场
Majorbio拥有世界一流的测序平台，在ABI3730xl常规测序平台的基础上，先后引进了Roche 454高通量测序平台和Illumina HiSeq 2000高通量测序平台，专业提供动植物基因组测序、微生物基因组测序、宏基因组测序、转录组测序、小RNA测序、基因表达谱分析等技术服务。热门文章最新文章Majorbio拥有世界一流的测序平台，在ABI3730xl常规测序平台的基础上，先后引进了Roche 454高通量测序平台和Illumina HiSeq 2000高通量测序平台，专业提供动植物基因组测序、微生物基因组测序、宏基因组测序、转录组测序、小RNA测序、基因表达谱分析等技术服务。&&&&违法和不良信息举报电话：183-
举报邮箱：Copyright(C)2017 大不六文章网&&科学家&·&科研服务：7
&&医&&&生&·&精准医疗：0
&&大&&&众&·&健康检测：8
当前所在位置
>RNA-seq在作图群体中的妙用
RNA-seq在作图群体中的妙用
Think Different & Do Different With Us
作图群体对于传统遗传图谱绘制和QTL分析，是必不可少的；
但你懂得，它的用途并不仅仅局限于”作图”，表型背后的基因调控研究是作图群体的另一个妙用!
项目周期：50个工作日
测序策略：PE91
适用范围：适用于所有作图群体（F1，F2，DH, RIL等）
策略一：基于混合分组分析（BSA）的基因调控研究
『沙梨果皮颜色性状背后的基因调控』
果皮颜色是一个复杂性状。研究人员将两个不同果皮颜色的亲本杂交获得F1作图群体，从中分别挑选了10个红褐色和绿色果皮个体，混合后进行RNA-seq，鉴定出显著表达差异基因206个，揭示CCR、CAD和POD基因是参与沙梨红褐色果皮生成的候选基因，并进行qRT-PCR验证[1]。
图1. F1代中沙梨的两种果皮颜色表型及不同样品间GDSL基因的系统发生关系部分显示
策略二：表达数量性状（eQTL）分析
『玉米籽粒中玉米油生物合成的遗传机制』
高油玉米是一种高附加值玉米类型，利用368个玉米近交系（RIL群体），结合RNA-seq及Illumina MaizeSNP50 BeadChip分型技术，发现了74个基因与籽粒总油分及组分显著相关，其中三分之一是编码油脂代谢的关键酶基因[2]。
表1 与玉米油浓度显著相关的SNPs及候选基因
参考文献：
1 Exploring candidate genes for pericarp russet pigmentation of sand pear (Pyrus pyrifolia) via RNA-Seq. PLoS One. 2014
2 Genome-wide association study dissects the genetic architecture of oil biosynthesis in maize kernels. Nat Genet. 2013
壹基因-科研服务/精准医疗壹基因医学OK-1gene
壹基因-基因健康官方微信壹基因MALL-1gene
(工作日：8:30-17:30)当前位置： >>
RNA-Seq技术的优缺点
RNA-Seq 技术的优缺点 一直以来，研究人员都很有兴趣了解细胞在各种不同状态下的基因表达差异，并开发出 多种方法，来不断提高灵敏度和增加通量。基因表达芯片是近年来较多采用的方法，但它如 今却碰上了一个强劲对手――RNA-Seq. RNA-Seq 可进行全基因组水平的基因表达差异研究，具有定量更准确、可重复性更高、 检测范围更广、分析更可靠等特点。除了分析基因表达水平，RNA-
Seq 还能发现新的转录 本、SNP、剪接变体，并提供等位基因特异的基因表达。 RNA-Seq 的动态范围更广，且假阳性可能更小，这意味着 RNA-Seq 的数据重复性应当 比芯片要高。RNA-Seq 能够检测样品中的所有 RNA，这对 于鉴定细胞的新颖转录本来说 是个优点，但同时缺点在于，它检测了总的 RNA，而细胞中很大一部分 RNA 都来自核糖体 和线粒体。 这限制了其他 RNA 的读取数 量以及这些 RNA 表达水平的准确性。 因此， polyA RNA 选择和核糖体 RNA 去除等方法被开发出来，以便解决这个问题。 然而，这些分离方法有可能会引入潜在误差，影响实验结果。因此，第三代测序公司 Helicos BioSciences 的研究人员对操作方法修改后可能发生哪些差异进行了研究，文章发 表在最近一期的 PloS ONE 上。 他们认为，对于研究人员来说，必须了解以下几点：技术差异如何影响结果的质量和可 解释性，操作方法如何引入潜在误差，RNA 的来源如何影响转录检测，以及所有这些差异 如何影响得到的结论。 Helicos BioSciences 公司的研究人员使用了多个人 RNA 样品，来评估 RNA 片段化、 RNA 分离、cDNA 合成，单个以及多个标签计算。尽管采用 polyA RNA 选择的操作方法得 到了最多的非核糖体读取， 并能够最精确测定编码转录本， 但研究人员发现这种方法只能检 测人细胞中的一部分非核糖体 RNA. polyA RNA 排除了数千个注释的转录本以及更多未注释的转录本，使得转录组查看不完 全。而核糖体去除的 RNA 则提供了一个更经济的方法，来生成完整的转录组覆盖。与多个 标签相比，利用单个标签的表达测定具有评估基因表达和检测短 RNA 的优势。 这项工作有望帮助研究人员在分析基因表达时选择适当的产品。
浅谈基因治疗的优势和缺陷_基础医学_医药卫生_专业资料。浅谈基因治疗的优势和缺陷...近年来又有反基 因策略、肽核酸、DNA 去除和 RNA 干扰技术。 目前基因治疗的...转录组测序技术的应用及发展综述摘要:转录组测序(RNA-Seq)作为一种新的高效、...2.1、种主要的转录组研究方法的比较 见表 2,其中 RNA 一 Seq 具有以下优势...转录组分析随着高通量测序技术的进步,RNA-seq 技术逐渐得到发展与成熟,使我们可...同时,相比较传统的芯片技术,也有很多独特的优势, 比 如它不需要设计探针, 使...RNA-Seq 的核心是二代 DNA 测序技术, 它应该是迄今为止应用最为广泛的 高...相对与传统的转录组信息挖掘方法,RNA-Seq 具有如下优点:1.测序对象不 局限于...RNA-seq数据差异表达分析方法的比较_生物学_自然科学_专业资料。RNA-seq技术的...正如很多文章已经提到的那些,RNA-seq 比起微阵列有三大优点: 1、更大的动态...基因编辑技术优缺点: 1)ZFN 的基因打靶效率能够达到 30%左右,已经可以做到针对...而且 CRISPR/Cas9 的构建仅仅需要设计与靶序列互补的 RNA 即可, 过程相对于 ...此外,RNA-seq 具有很低的背景噪音和很高的灵敏度,所需 RNA 样本更少,正随着技术的快 速进步变得更划算。RNA-seq 的这些优点使我们能更全面地说明转录组的复杂...低运行成本等优点,堪称测序技术发展历程的一个里程碑,该技术可以对数百万个 DNA...RNA-Seq 技术,又称转录组测序技术,就是近几年 发展起来的应用新一代高通量...测序技术被越来越多的用户 所认可, 表达谱测序技术 (RNA-seq) 取代表达谱芯片是大势所趋, 因为表达谱芯片和 RNA-seq 想比较,除了价格便宜外,没有任何技术优势...整个过程主要包括:从细胞 或组织中提取 RNA 分子、文库的构建以及后继的生物信息学数据分析。RNA-Seq 技术具有 许多早期研究方法(如:微阵列)所不具备的优点,如:...
All rights reserved Powered by
copyright &copyright 。文档资料库内容来自网络，如有侵犯请联系客服。　　生物通报道：如果说DNA是建筑师的设计图，那么RNA就是决定在一个细胞中真正要建造什么的承包商。通过在RNA水平进行基因表达分析，能够揭示为什么遗传学上相似的两个物种，例如黑猩猩和人类存在如此大的差别。在一个个体中，基因表达决定了一个小拇指是在哪里形成的，与大拇指相对应。很多年来，在已经完成基因组测序的模式生物中，生物学家们已经能够评估其RNA水平，而那些不关注模式生物的研究者们还被蒙在鼓里。研究非模式生物的生物学家们不是去追问“它们基因组中哪个基因在一个特定的时间或者在响应特定的环境变化时表达？”，而是被迫去寻找已经在模式动物中被鉴定的基因。例如，一位蜈蚣研究者只能确定无疑地回答“是否多腿动物在其触角生长时激活与果蝇（D. melanogaster）相同的基因？”。随着高通量的新一代RNA测序（也称为RNA-seq）技术的出现，这个障碍已经被克服。通过建立一个转录组（Transcriptome）――其包含生物体在所有组织和主要生活期所产生的所有RNA分子，这项技术允许动物学家们经济、有效地分析基因组没有被测序的生物中的基因活性。在RNA准备过程中，RNA被打碎成小片段，每个被测定片段就像一片拼图，组成了完整图像的转录组。使得转录组学对于研究非模式生物的研究者们产生如此大的吸引力的是，它们的构建成本比基因组更低。更重要的是，当工作被正确完成时，产生的结果可能会比测定一个基因组更加可靠，因为一些动物具有庞大的基因组，那是几乎不可能被精确组装的。在过去，研究者们局限于研究“大约一千万中个物种中的20个”，美国布朗大学的进化生物学家Casey Dunn说，“现在我们能够在某种程度上了解以前不能了解的各种各样生物的特性。”但是，像任何新的强大工具一样，转录组学也带来了误用和曲解。“对于一个动物学家来说，这真的是一个令人兴奋的阶段，”，Dunn说，“但是，它仍然像扩荒之前的美国西部一样有待我们探索。”科学家与专家就如何构建信息最丰富的转录组展开讨论，寻找如何使实验更有意义的技巧。
以新鲜为目标当开始做RNA实验时，新鲜组织是最好的。如果样本必须被保存，将其快速冻结在液氮中，或者迅速放置于含RNA提取缓冲液（例如Invitrogen的RNA纯化试剂盒）的EP管中。或者，一些研究者将组织保存在稳定剂RNAlater（包括Qiagen和Invitrogen的很多供应商都有销售）中，保存在―80℃。但是没有哪种试剂盒能够弥补RNA的大量损失，因为RNA比DNA更加容易降解。“我曾经在许多研究中看到，人们说他们在室温条件下将组织寄送给合作者，这意味着很有可能他们的工作是以一种透光不均匀样本为基础，”Dunn说。“如果你正遇见转录组构建的所有麻烦，从好的样本材料开始是非常值得的。”
早期设置对照RNA纯化的商品化试剂盒为如何将一份RNA样本转换成能够被测序的cDNA提供了一步一步的用法说明。在这个最初的阶段，增加一个对照样本是不可缺少的。利用贯穿实验过程中的这个对照，以便于测序结束后检查污染性序列。
质量的检测瑞典斯德哥尔摩大学的进化生物学家Christopher Wheat在 RNA纯化后，采用生物分析仪（来自美国加利福尼亚州圣克拉拉的安捷伦科技公司的2100 Bioanalyzer）检测了每个样本的质量。他寻找超过500~2000个碱基范围的片段大小的正态分布，这能表明RNA没有降解成低质量的小片段。“你不想看到的是100bp周围的一个峰值，因为这表示降解RNA的一个积累，”他说。
整合在一起
得到更多的序列为了产生一个转录组，研究者将成千上万的RNA序列组装成重叠的连续片段――称为contigs，以正确的方向排列。第一步是收集提取RNA的序列。RNA-seq两种常见的下一代测序平台是Illumina和Roche 454。当前，很多生物学家倾向于使用Illumina进行转录组组装，因为每一美元它能产生更多的序列，像组装一个包含不同版本各种图书的、藏书丰富的图书馆一样，你想要在转录组中得到尽可能多的RNAs。然而，很多片段来自高度表达的所谓管家基因，这些基因指导新陈代谢和其它基础生命持续过程，所以为了捕获在更低水平表达的序列，你需要很多的读长（reads）。“你得到的读长中，有一半会碰上50个管家基因，”Wheat解释说。因此，如果你收集到一百万个序列，你会更加可能重新获得在其它500000个基因中不明显的基因。
决定什么时候停止当哈佛大学的进化发育遗传学家Cassandra Extavour构建一种海边很常见的甲壳动物――片脚类动物明钩虾（Parhyale hawaiensis）的转录组时，她尽可能积累了足够多的序列。什么时候才是足够？Extavour通过寻找一个饱和点，回答了这个问题。在她分析了一百万个读长后，如果单一序列继续大量出现，她将测定其它一百万个。“理想的是你想要尽可能得到所有来自每个阶段和每个组织中的RNA，”她说，“记住，这就是你的代理基因组。”
估计软件大小大多数研究者一致认为，你不应依赖于基因组-组装软件来构建转录组，但是除了这个规则之外，没有任何其它一种方式，而且软件也经常发生变化。就在现在，很多研究者使用一个由美国布罗德研究所和耶路撒冷希伯来大学开发的、叫做Trinity的免费程序。Trinity利用一个三步过程组装转录组，包括构造来自片段的全长转录本，根据相似性分组这些转录本，然后将它们分成结构上相似但不相同的平行同源基因。对于需要被组装的每一百万的读长来说，Trinity需要大约1G的内存。另外一个常用的（免费的）组装软件是Velvet/Oases。Velvet是一个基因组组装程序，但是当它与Oases相结合时，程序就能够处理RNA-seq数据，过滤掉降解片段，重建属于基因的转录本。
简化流程在利用Trinity这样的软件组装你的转录组之前和之后，对你的数据进行加工，能够提高效率。例如，Agalma是由Dunn实验室开发的一个免费的流水线程序，其获取准备组装的数据，通过不同的分析步骤队对数据进行自动分析。在这个程序利用Trinity组装转录组之前，其通过剔除低质量的序列对数据进行清理，也将易于大量表达的核糖体RNA剔除掉。在噪音片段剔除后，Trinity运行的更快，也只需要很少的电脑内存。一旦转录组被构建，研究者想要利用新数据构建一个进化树，Agalma也能够进行这些处理。
确保你获得高质量的序列Wheat建议研究者，在转录组被构建后，采用BLAST评估其质量。你输入的contig序列的长度应该近似等于相应的基因序列或者来自近缘种的contig。抽查其它不同的contigs。
从你的转录组中获得最大信息
一旦转录组被组装完成，短的RNA读长能够被定位在上面，这些短RNA读长来自从蜈蚣建立它们触角的RNA到跳跃蛙类中发现的基因的实验。这里，各种各样开放获取的RNA-seq组装软件能够帮助完成任务。常用的选择包括Bowtie和Cufflinks，这两种都可以免费下载。大多数RNA-seq组装软件也能估算转录本的相对丰度，这对于比较基因表达水平的实验非常有用。
非常规程序的出现许多现有的程序，例如Bowtie，由想要将RNA-seq数据中收集到的短RNA片段匹配到一个基因组而非转录组的研究者们开发，这也产生了一些问题。Extavour说，当她在其片脚类甲壳动物的研究中使用这些程序时，发现其三分之一的RNA-seq数据与她以前得到的片脚类动物转录组没有匹配。她没有舍弃这些数据，而是请她实验室的生物信息学技术人员开发出一个新的组装软件。利用这个软件，团队发现了90%的RNA-seq读长。“相比较现成的程序，我们自己开发的程序更好的完成了任务，”Extavour说。（她的技术人员，Victor Zeng，已经开始创建了自己的公司，为处理大片段数据的生物学家提供生物信息学分析。）
做同类型的比较一个可怕的错误是，比较两个物种之间的基因表达水平，或者两个不同基因的表达水平。这样的一个实验的问题是，一些基因和一些生物体更容易被测序，什么看起来像一个明显的生物学差异是这项技术的一个真正的神器。“可能在一些年之后，我们将理解测序偏差，”Dunn说，“但是现在我们不能。”记住：相同的基因，相同的物种。
面对现实避免在非常低水平表达的基因之间的比较。即使你设法捕获你的转录组中的稀有基因，它们的稀缺性将很难定量评估。
首先设置标准当研究一个基因的表达水平时，Extavour建议研究者――如果可能的话――利用已发表的研究来决定，一个差异在实验开始之前有多少的意义。而大多数模式生物在经过多年分析后，已经有基准标准，这项基准可能不会应用到未被研究的生物中，所以你必须找到你自己的。“考虑到你会预先对什么满意，”她说。“一个5倍的差异是否足够？为什么？”。例如，如果以前的调查研究发现，阻塞树蛙皮肤斑点的一个基因的表达并不会改变斑点模式，直到仅有20%的表达蛋白保留，在基因表达中的2倍差异，将会太低以至于不具有信息性，但是一个10倍的差异能够做到。
复制，复制，还是复制不要仅仅一次将一个样本与另外一个进行比较，要重复进行。例如，在2011年，Dunn和他的合作者评估了在一种与水母近缘的独特海洋动物――管水母目动物不同组织中的基因表达差异。特别的是，为了重复三次实验，他们采集了专门喂养的管水母动物的部分样本，和从三个不同管水母中采集了帮助它们游泳的部分样本（PLOS ONE 6: e2）。“想象这些实验就像选举投票一样：仅仅调查小团体的人群，可能无法揭示整个群体是如何感受的，所以你需要投票给若干个小团体，”Dunn解释道。（生物通：王英）
我来说两句(0)
[Ctrl+Enter]
知名企业招聘
医药/产业</
相关文章：
加载相关文章......
今日文章：
加载今日文章......
版权所有 生物通
Copyright&
, All Rights Reserved
联系信箱：}