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染色体涂染技术及其在染色体病诊断中的应用
来源：青年人()&更新时间： 20:42:44 &【字体： 】
染色体涂染(chromosome painting)技术是用染色体特异性或染色体区带特异性DNA文库作为探针池，与中期分裂相染色体(或间期核)进行荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)和染色体原位抑制(chromosome in situ suppression, CISS)杂交，从而这一特定的染色体物质从pter→qter或某个特定区域上显示出均匀恒定的荧光信号。它能够在分子水平上检测染色体数目和结构畸变，如相互易位特别是细胞遗传学水平难以确定的微小易位和复杂易位，鉴别标记染色体的来源等［1～12］。　　用某一异常染色体DNA文库作为涂染探针，杂交到正常(或异常)中期分裂相染色体上，称为反向染色体涂染；相反，用正常人染色体DNA文库作为涂染探针，杂交到患者异常的中期分裂相染色体上，称为正向染色体涂染。近年发展起来的染色体多色涂染技术，即使用不同荧光染料标记不同的探针池进行FISH杂交，在同一中期相的不同染色体和／或同一染色体不同区带上同时显示出多种颜色的技术，也称M-FISH(multiplex-FISH)或多色FISH。目前，可以利用多色涂染技术对人类24种染色体同时进行核型分析，显示出27种不同颜色的荧光［13，14］。我们就各种FISH探针及染色体涂染技术在染色体病诊断中的应用综述如下。
1　不同类型的FISH杂交探针
　　DNA克隆技术，如YAC、Cosmid、MAC和PAC克隆分子库的建立以及DNA分离技术，如电泳技术、流式细胞分离术和显微切割技术的建立及应用，得到了大量的、不同类型的用于FISH杂交的探针(附图)。
附图　各种类型的FISH探针
1.1　着丝粒探针　着丝粒探针包括在人类染色体的着丝粒及近着丝粒区域所发现的重复DNA序列。它既可以用于中期相染色体或间期核FISH杂交以检测染色体数目异常，也可以用于间期核甚至染色质纤维的高分辨FISH作图(fiber-FISH)分析。1.2　染色体特异性或染色体区带特异性探针池　整条染色体涂染(whole chro-mosome painting, WCP)探针既可以通过流式细胞分离器分离染色体，也可以用显微切割法获得［15～18］。染色体涂染技术于1988年由Pinkel和Lichter等［17，18］首创。Deng等［15］用显微切割、PCR产物进行CISS杂交，建立了染色体区带特异性涂染技术。1.3　染色体特异性单一序列探针(unique sequence probes, USP)　USP是指染色体某一位点特异性的DNA片段。它除了从探针池中分离得到单拷贝之外，还可以从YAC、PAC、Cosmid等分子克隆库中获得。由于它主要含有单一的DNA序列，所以可以用于检测经典的细胞遗传学技术不能发现的染色体微小重复和缺失，鉴定染色体易位断裂点等。1.4　端粒探针　端粒是指染色体末端所特有的帽子片段。人类的端粒包括数百次(TTAGGG)的核苷酸重复。最近人们从Cosmid、PAC和YAC文库中分离鉴定了全套代表每条染色体端粒的特异性FISH探针。端粒的变化涉及肿瘤的发生和细胞的衰老，新的全套端粒探针为我们提供了过去所不能解决的检测患者的微小易位和缺失的手段［19，20］。
2　染色体涂染技术的应用
2.1　鉴定标记染色体的来源　一些细胞遗传学技术不能确诊的标记染色体，如环状、双随体双着丝粒额外小染色体和染色体附加片段等标记染色体，可以运用染色体特异性或染色体区带特异性探针池，进行正向和／或反向染色体涂染鉴定其来源。Deng等［15］对一个来源于Y染色体的标记染色体进行显微切割和涂染；Okta 等［11］用靶染色体带涂染技术鉴定了6例细胞遗传学不能确定的异常染色体来源。我们运用染色体筛查和正向染色体涂染，简单快速地鉴定了1例智力低下患者7q+标记染色体附加片段来源于3q26→3qter［1，12］。2.2　染色体易位2.2.1　复杂易位　染色体复杂重排是一种罕见的染色体结构异常，通常涉及3个及3个以上的断裂点。Lisa等［8］报道1个具有多种先天性异常的新生儿，经诊断为1号和5号染色体的非平衡易位。用高分辨G显带染色体技术对患者父母的染色体进行检查，发现患者的母亲有一个复杂重排，包括1号和5号染色体之间的互换和同一条5号染色体长臂内的片段插入到2号染色体长臂。进一步用1号、2号和5号染色体特异性探针池对患者母亲进行染色体涂染研究，发现了一个在重排的2号和5号染色体之间G显带未能发现的插入，即异常的2号染色体长臂臂内的一个片段插入到异常的5号染色体长臂。从而鉴定了包括3条染色体5个断裂点在内的复杂易位-插入。Fuster等［9］用经典的细胞遗传学和CISS杂交，确定了一个复杂的家族性染色体易位。G显带技术分析患者绒毛标本核型为：47,XX,-2,+der(2),t(2;22),+der(22),t(2;22)。对胎儿父亲进行G显带和CISS杂交，发现他有一个复杂易位。用2号和22号染色体探针池进行染色体涂染，结果显示，远离2q13带易位到22q11.2，而远离22q11.2带并没有易位到2号染色体，而是易位到C组的一条染色体上。结合G显带结果认为它可能是11号。然后用11号染色体探针池进行杂交，结果证实这条C组染色体为11号染色体。从而确定了父子的核型。黄浩杰等［2］应用整条染色体荧光原位杂交成功地分析了1例复杂的染色体易位。我们对1例罕见复杂易位携带者进行染色体涂染研究，确定了该患者的核型［3］。2.2.2　微小易位　我们对一患儿作染色体G显带检查未见异常，进一步作高分辨染色体检查，认为母亲核型可能为46,XX,t(7;21)(p21.2;q22.3)，患者核型可能为46,XY,-21，+der(21),t(7;21)(p21.2;q22.3)mat。用7号染色体特异性探针池对患者及其母亲作染色体涂染，从而在分子水平上证实了细胞遗传学的分析结果，确定其母子的核型，显示了染色体探针池在鉴定微小异常染色体来源上的直观性和准确性［12］。2.3　重复或缺失　染色体显微切割结合涂染技术(micro-FISH)不仅可以检测染色体重复，而且可以检测染色体缺失，甚至是微缺失。Engelen等［6］运用micro-FISH精确描绘了3例患者染色体缺失。病例1经细胞遗传学分析发现3号染色体长臂有一缺失，但不能确定染色体缺失的精确区域，是3q23→q25还是3q25→q26.2，然后切割这条染色体，进行反向涂染，发现正常的3号染色体在3q23-q25无荧光信号，因而结合G显带染色体检查结果，确定其核型为46,XX,del(3)(q23q25)；病例2的非平衡易位为18q12.3带的缺失；病例3经高分辨G显带染色体检查发现是14号和15号染色体之间的罗伯逊易位和另一条15号染色体15q11→q13的缺失。反向染色体涂染显示为15q12带约6×106bp的微缺失。
3　现状和展望
　　过去，对于染色体涂染探针池的制备，需要通过限制性酶切和连接，克隆到载体中构建DNA文库的方法来获得［17，18］。1992年Melter［16］和Deng等［15］省去了用PCR产物进行克隆这一繁琐的微操作过程，直接用PCR产物作为探针池进行涂染。1993年，我们又利用新发展起来的探针标记方法——PCR标记法，直接对涂染探针进行PCR标记，即通过合适的PCR引物扩增，把生物素渗入到被扩增的DNA链中。它具有标记效率高、DNA产量高的特点。而且和随机引物标记法相比，所标记的探针中除了极微量的模板外，都带有被标记的生物素，故杂交效率高，杂交背景干净，特异性强。另外，PCR标记的好坏，可以通过简单的凝胶电泳来检测，大大提高了染色体涂染技术的稳定性。从而使整个操作过程变得快速简单，重复性好［1，3，12］。　　综上所述，染色体涂染技术已成为一种安全、经济、灵敏、快速和准确有效的分子细胞遗传学技术，是染色体高分辨显带技术的补充和发展，在遗传病诊断和产前诊断中必将发挥重要作用，同时在进化遗传学和肿瘤遗传学研究中亦具重要意义。为遗传病的基因定位和基因克隆指明了方向，提供了更多的信息。我们相信，随着探针的制备技术、标记技术、FISH杂交过程流程化、杂交结果的图像分析技术的发展及高分辨FISH作图技术和比较基因组杂交技术的问世，将使FISH技术得到不断的创新和发展。
参　考　文　献
1　傅俊江，夏家辉，龙志高，等.一例智力低下患者7q+标记染色体的来源鉴定.实验生物学报，)∶151-155.2　黄浩杰，张锡然，陈宜峰，等.应用G显带染色体荧光原位杂交(FISH)技术研究复杂的染色体易位.遗传学报，)∶388-392.3　Fu JJ, Xia JH, Long ZG, et al. Study of chromosome painting for one rare carrier with complex transoclation. Chin J Genet, )∶167-172.4　Brondum NK, Bajalica S, Wulff K, et al. Chromosome painting using FISH with chromosome-6-specific library demonstra-tes the origin of a de novo 6q+ marker chromosome. Clin Genet, )∶235-239.5　Speleman F, Van RN, Wiegant J, et al. Detections of subtle reciprocal transloca-tions by fluorescence in situ hybridization. Clin Genet, )∶169-174.6　Engelen JJM, Albrechts JCM, Loots WJG, et al. Application of micro-FISH to delineate deletions. Cytogenet Cell Genet, -3)∶167-171.7　Engelen JJM, Loots WJG, Albrechts JCM, et al. Disclosure of five breakpoints in a complex chromosome rearrangement (CCR) by microdissection and FISH. J Med Genet, )∶562-566.8　Lisa HG, James M, Teresa L. A complex chromosome rearrangement with at least five breakpoints studied by fluorescence in situ hybridization. Am J Med Genet, )∶417-420.9　Fuster C, Miguez L, Miro R, et al. Familial complex chromosome rearrange-met ascertained by in situ hybridization. J Med Genet, )∶164-166.10　Blennow E, Anneren G, Hung B, et al. Characterization of supernumerary ring marker chromosomes by fluorescence in situ hybridization (FISH). Am J Hum Genet, )∶433-442.11　Ohta T, Tohma T, Soejima H, et al. The origin of cytologically unidentifiable chromosome abnormalities: Six cases ascertained by targeted chromosome-band painting. Hum Genet, )∶1-5.12　Li LY. Construction and application of human chromosomal specific DNA probe pools. Chin Med J, )∶112-115.13　Speicher MR, Ballard SG, Ward DC. Karyotyping human chromosomes by combinatorial multi-fluor FISH. Nature Genet, )∶368-375.14　Schr　(¨)/(o)　ck E, Manoir SD, Veldman T, et al. Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes.Science,4-497.15　Deng HX, Yoshiura K, Dirks RW, et al. Chromosome-band-specific painting:Chro-mosome in situ suppression hybridization using PCR products from a microdissected chromosome band as a probe pool. Hum Genet, )∶13-17.16　Meltzer PS, Guan XY, Burgess A, et al. Rapid generation of region specific probes by chromosome microdissection and their application. Nature Genet, -28.17　Pinkel D, Landegent J, Collins C, et al.Fluorescence in situ hybridization with human chromosome-specific libraries: Detections of trisomy 21 and translocation of chromosome 4. Proc Natl Acad Sci USA, )∶.18　Lichter P, Cremer T, Borden J, et al. Delineation of individual human chromo-somes in metaphase and interphase cells by in situ suppression hybridization using recombinant DNA libraries. Hum Genet, )∶224-234.19　National Institutes of Health and Institute of Molecular Medicine Collaboration. A complete set of human telomeric probes and their clinical application. Nature Genet, )∶86-89.20　Yung JF. New FISH probes-the end in sight. Nature Genet, )∶10-12.
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DNA-Y染色体鉴定
侦破“白银案”的核心技术，是以DNA-Y染色体鉴定初步确定犯罪嫌疑人的。
女性的染色体是XX，男性的染色体是XY，Y染色体在男性父子及父系之间单向传承。在同一父系的所有男性个体中，包括兄弟，父子，叔侄，堂兄弟和祖孙等都具有同源的Y染色体。
每代都可能会有突变，但总体稳定程度高，十代之内不会有大的变异，可以用于追溯历史时代如几千年的父系渊源。甚至大而言之，现在全世界男性的Y染色体特征都可以追溯到二十多万年前的一个东非晚期智人男子（即“生物学亚当”）。
而漫长遗传过程中产生区别的，是由世代父系遗传中积累的突变造成的，主要体现为其中的特征片段，即STR(short tandem
repeat，短串联重复片段)。Y-STR基因座是位于男性Y染色体上的人类多态性STR位点,一般情况下,只有男性个体才有Y染色体,因此,Y-STR具有男性遗传,男性特异性的特点。Y-STR即可作为性别鉴定的依据,同时在法医学精斑及混合斑检验中发挥着重要作用。
Y染色体STR有着特别的家族多态与特异区分性。到目前为止，经确认的STR位点已经有200多个。
从简单概率原理可以得知，如果两个人在4个Y染色体STR位点完全匹配，就会有近95%以上的概率表明，两个人可能有一个共同的父系祖先，不是的概率很小。如果把特征检测点扩展到5个乃至9个以上，就有百分之99.99（n个9）以上的概率，两个人有一个共同的父系祖先，不是的概率非常非常小。在法律上，这个级别是可以作为法庭审判采信，排除合理怀疑的法律依据的。
但Y染色体STR位点进入科学乃至应用的视野很晚，1985年才有人提出Y染色体STR特征，1992年和1994年才最早有研究者提及Y-STR的高信息含量，科学家开始探索其在法医学鉴定中的应用。到世纪之初，随着研究和应用的迅速发展，2001年国际法医遗传学会DNA委员会才对Y-STR的报告方法、命名、标准的应用提出了一些原则与建议。自此，Y-STR才开始在国际上开始被纳入法医检验的应用当中来。
如上所知，单个Y-STR提供的区分度很有限，难以满足法医学检验鉴定的要求，所以多个Y-STR联合检测成为必须。国际上的生物科技公司迅速提高特征STR的检测能力，一次同时检测数量迅速从9个扩展到11个，又扩展到17个，乃至现在所常用的21个，以使得到的检测结果更为精确，并且推出了商品化的检测试剂盒。（如果还不能区分，可以单个补充测试其他点位）
随着分子生物学技术的发展，到现在，一次检测的试剂成本降低到200元以下，大批量运用甚至可以做到100元。而且，由于Y染色体STR检测灵敏度高，对检材要求量少，降解检材也能扩增。
更为有利的是，Y-STR方法的最大特点是，由于同父系亲属的相同性，无需拿到疑犯本人的DNA检材精确相同，只要有其父系亲属的亲缘材料检定为相同，就可以认定嫌疑人为其本人或亲属。
锁定了一个家族，再结合其他信息，就能很快摸排到具体的嫌疑人，通过抓捕和直接检测，最终确定嫌犯身份。
Y-STR方法具备极高的法医学应用价值，被誉为法医遗传检测技术的第二次飞跃。
悬疑长达28年的“白银案”的最终破获，是Y-STR方法在刑侦领域对重大悬案的首次成功应用。最近几年应用在刑侦案件中的DNA检测技术，使高承勇所在的家族，与20多年悬而未破的连环杀人案联系到了一起。警方的人士透露，高承勇的落网，首先是与其同姓氏的远房堂叔因行贿被监视居住，警方因此采到了此人的血样。经Y-DNA检验分析后，此人遗传数据输入到违法犯罪人员Y-DNA数据库中。初步对比，结果与“白银案”嫌犯的Y-DNA信息相符合。这一初步检测的结果表明，案犯与此人有相同的Y染色体遗传，是同一家族的男性成员，所以嫌犯应姓高。为了进一步确认，样本又送到甘肃省公安厅鉴定中心，做Y-DNA复核检验，结果符合，从而进一步确定案犯应为高姓。此后，警方询查了该家族所有的男性成员，经筛排分析，确认其侄儿高承勇具备作案条件，为“白银案”的嫌犯。高承勇归案后，其本人指纹和DNA与案发现场指纹和DNA检验对比，确认来自同一个体。经审讯，案犯对犯罪事实供认不讳。
Y-STR方法的应用远未局限在法医学里。在亲子鉴定中，在一些父亲不能参加鉴定的特殊情况下，可利用同一父系亲属来代替。还可以进行父系同代、隔代、以及相隔几代以上的父系亲缘关系的鉴定，如兄弟关系、叔侄关系、爷孙关系的鉴定等。甚至在家族谱系鉴定乃至历史研究中，可以运用于几千年的男性名人后代鉴定，确定某些人是否来自同一个先祖等等。哪怕上万年的历史的民族、种族大迁徙，乃至人类起源问题的研究，都可以利用这一有效武器，科学家们也在最近几年里得出了许多惊人的、颠覆性的人类史前历史细节。
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······贵州农业科学):130~134；[文章编号]07)042；植物染色体原位杂交技术的发展；范燕,陈庆富；(贵州师范大学生物技术与工程学院,植物遗传育种研；[摘要]染色体原位杂交技术是现代生物技术的重要组；挥着重要的作用；[关键词]染色体原位杂交;探针;靶DNA[中图分；DevelopmentofPlantChromo；
贵州农业科学 ):130~134 GuizhouAgriculturalSciences
[文章编号]07)205
植物染色体原位杂交技术的发展
范燕,陈庆富
(贵州师范大学生物技术与工程学院,植物遗传育种研究所,贵州贵阳550001)
[摘 要]染色体原位杂交技术是现代生物技术的重要组成部分。它具有直接、准确、便捷等特点,在生物科学研究中发
挥着重要的作用。随着分子生物学的进步,染色体原位杂交技术不断改进和完善,新的染色体原位杂交技术不断涌现。本文对染色体原位杂交探针、染色体原位杂交靶DNA类型、染色体原位杂交新技术及应用等方面进行了综述。
[关键词]染色体原位杂交;探针;靶DNA[中图分类号]S503.51[文献标识码]A
DevelopmentofPlantChromosomeinSituHybridization(ISH)
FANYan,CHENQingfu*
(InstituteofPlantGeneticsandBreeding,SchoolofBiologicalTechnologyandEngineering,GuizhouNormalUniversity,Guiyang550001,China)
andrapidcharacteristicsandplaysasignificantroleinbiologicalresearch.Withprogressofmolecularbiology,thechromosomeinsituhybridizationhasbeingimprovedandthenewchromosomeinsituhybridizationmethodsareconstantlyemerging.ThepaperreviewstheprobeandtargetDNAtypeofchromosomeinsituhybridizationanditsapplication.
Keywords:chromosomtargetDNA
Abstract:Thechromosomeinsituhybridizationisanimportantpartinmodernbiotechnology.Ithasdirect,accurate
原位杂交技术(insituhybridization,ISH)是分子生物学、组织化学和细胞生物学相结合的产物[1]。该技术属于固相分子杂交范畴,是根据核酸分子碱基互补配对的原则(A2T,A2U,G2C),将外源核酸片段(即用标记的DNA或RNA为探针,probe)与染色体上经过变性后的单链DNA片段或组织、细胞上特定的核苷酸序列,在适宜条件下互补配对,结合形成专一的核酸杂交分子。再经过相应的检测手段,将待测核酸在染色体、组织或细胞上的位置显示
出来。原位杂交技术是由Gall和Parue(1969)利用标记的rDNA探针与非洲爪蟾细胞核杂交首次获得成功。随着植物染色体制备技术的改进,Ray2burn(1985)最早将非放射性检测系统应用到植物染
色体原位杂交。目前,该技术在染色体物理作图的建立、多倍体起源、非整倍体鉴定、杂种及染色体导入片段的鉴定、内外源基因在转录、翻译水平上的特异性研究以及系统进化和亲缘关系等研究方面均得到广泛应用[1,3]。
原位杂交技术是从Southern和Northern杂交技术衍生而来的,可以分为染色体原位杂交和RNA原位杂交。染色体原位杂交(chromosomeinsituhybridization,CISH)技术是用标记的DNA或寡核苷酸等探针来确定目标基因在染色体上的位置。RNA原位杂交是标记的双链DNA或单链反义RNA探针,对组织切片或装片的不同细胞中基因表达产物mRNA(或rRNA)进行原位定位[4]。本文主要就植物染色体原位杂交技术的发展进行回顾。
1原位杂交的探针
探针是原位杂交中用于细胞内特定DNA或mRNA序列定位的一段特定核酸序列。1.1探针的类型
根据生产探针的方法,可将探针分为三类:克隆化探针、酶扩增探针和化学合成探针。克隆化探针的来源是克隆化DNA。克隆化探针又根据克隆载体分为酵母人工合成染色体探针(YAC)、P1人工合成染色体探针(PAC)、人工细菌合成染色体探针(BAC)、粘粒探针、噬菌体探针、质粒探针等。酶扩增探针来源有:用于整个基因组、单个染色体或者染色体某个区域的PCR扩增定位探针或者克隆化探针的扩增文库。此外,通过RNA聚合酶还可以获得正义和反义RNA探针。这种RNA聚合酶上带有RNA分析的T3、T7或者SP6转录因子。化学合成探针包括一些简单的寡核苷酸和特殊用途的寡核苷酸探针,如分子信标或者其他带有与合成过程中或者合成后一致的不同核苷酸类型的寡核苷酸探针[5]。
根据探针的本质,可将上述方式产生的探针分为两大类型:DNA探针和RNA探针。
1.1.1DNA探针根据DNA探针的下列特点,可将DNA探针分为以下一些常见类型。
(1)重复DNA序列作为探针。目前所使用的这类探针主要包括rRNA基因、端粒重复序列、亚
端粒重复序列、转座子、着丝粒重复序列等等。
[收稿日期]
[基金项目] 国家自然基金项目();教育部新世纪人才支持计划(NECT);国家/十一五0科技支撑计划(2006BAD02B06)[作者简介] 范 燕(1982-),女,硕士研究生,研究方向:植物遗传及遗传工程。E2mail:*通讯作者。E2mail:
当标记和杂交足够严谨时,这些探针在着丝点附近或异染色质区和间期染色质的浓缩区域产生杂[1]
(2)单拷贝或低拷贝的DNA序列作为探针。由于这类探针一般只有1~2kb。通常是某个基因的DNA克隆、RFLP或RAPD标记或是用大插入片段探针如柯斯质粒或酵母人工染色体标记。采用这类标记的原位杂交技术克服了单拷贝或低拷贝序列难以杂交和不易检测的困难[7,8]。
(3)利用基因组DNA作探针。植物基因组的差别主要源于它们的重复DNA序列的不同,而且brisization,简FISH)。但与间接法相比,其灵敏度相对较低。间接标记法是指掺入到探针中的标记物不能被直接观察到,必须通过耦联复合物专一地结合到杂交后的探针标记物上,通过特殊的检测方法,来显示杂交位点。这种方法最常用的标记物是生物素(biotin)和地高辛(DIG)[12]。
2染色体原位杂交的靶DNA类型
由于植物细胞壁对作为探针的核苷酸起阻碍作用,使原位杂交技术在植物研究中的应用受到一定限制,但随着植物染色体制片技术的不断改进,该技高等植物基因组中都有高含量的专一重复序列。因此,可利用不同基因组DNA同源性程度的差异来识别植物杂种、异源多倍体和重组的育种品系中不同来源的染色体和染色体片段[9,10]。在杂交中,标记的基因组DNA首先与其完全同源的DNA杂交,通过调节标记DNA与遮盖DNA比例,可以检测出外源染色体或外源片段,同时可以清楚地显示出易
位与交换的位置[1]
1.1.2RNA探针RNA探针主要用于RNA原位杂交技术中。由于RNA原位杂交是探针与细胞内特定的mRNA杂交,故RNA比双链DNA作为探针的敏感性更强,不需要变性,并且RNA2RNA比DNA2RNA要稳定。另外,RNA探针无论是反义和有义链都可以分别体外转录,而有义链可作为非特异性杂交的背景对照,因此,此探针在RNA原位杂交中应用最为广泛[4]。1.2探针的标记方法
1.2.1探针的放射性标记该方法对于组织及染色体样本制备的要求不太高,且具有较高的灵敏度,但是对杂交信号分析困难,同时存在放射性防护等问题[11],制约了这一技术的发展与应用,现逐渐被非放射性标记所取代。
1.2.2探针的非放射性标记Manning等(1975)最先在溶液的分子杂交中使用非放射性标记,通过细胞色素C将生物素(biotin)与RNA分子连接起来。Rudkin等(1977)通过制备抗DNA、RNA复合物的抗体检测杂交后的RNA探针,最早进行免疫荧光法结合抗体,显示RNA杂交位点。Langer等(1982)将耦联有生物素的核苷(biotin2112dUTP)通过切口平移掺入DNA探针进行染色体原位杂交,
从而开创了非放射性原位杂交时期[12]
。自20世纪80年代以来相继发展了3种非放射性标记和检测DNA探针的系统,即生物素标记检测系统、地高辛标记检测系统和荧光素标记检测系统。
根据标记和检测特点的不同可将非放射性原位杂交分为直接法和间接法两种。直接标记法是指掺入到探针中的标记物在杂交后可被直接检测的方法。这种标记物大多为在激发光下能发荧光的物质,故也叫荧光原位杂交(fluorescenceinsituhy2
术在植物研究中的应用愈来愈广。目前可用于原位杂交的染色体主要有以下几种类型。2.1早中期和中期染色体
有丝分裂早中期和中期染色体(metaphasechromosome)容易制备,并且其着丝粒、端粒和次缢痕等形态特征容易识别,有助于染色体的鉴别和杂交信号的定向[13]。但受中期染色体结构高度螺旋化、高度浓缩的影响,其分辨率只能达到1~3Mb的水平[14,15]。对于一些基因组较小的种类,如酵母、蕃茄、水稻等,在光学显微镜下很难根据每条染色体的结构分辨出单条染色体,对构建高分辨率DNA物理图谱带来困难[16]。因此,早中期和中期染色体原位杂交技术适合于对较大的单个DNA序列以及两个或多个相距较远的DNA序列进行物理定位。早中期和中期染色体制片一般采用去壁低渗法。
2.2花粉母细胞减数分裂粗线期染色体
染色体减数分裂粗线期染色体(pachytenechromosome)浓缩程度比中期染色体大为降低,分
辨率可达100kb左右[17]
。同时粗线期染色体在普通的光学显微镜下还具有可识别的结构特征,包括着丝粒位置,短臂和长臂的比例,异染色质和常染色质的形态等。另外,粗线期染色体所在的细胞几乎不存在细胞壁,染色体伸展良好,同源染色体配对提供了两个目标位点使目标区域增加了一倍[1]。但粗线期染色体作为原位杂交的靶DNA的载体也有一些不足。选择时期合适的用于制备粗线期染色体的花粉母细胞较费时费力;多倍体的粗线期染色体因为有复杂的配对构型、不联会和染色体粘连等情况而使分析特别困难;大基因组的粗线期染色体很长,
难以追溯和识别单个的染色体[13]
。粗线期染色体制片一般采用滴片法和压片法。2.3间期细胞核的染色体
间期细胞核的染色质比分裂时期的染色体浓缩程度低得多,其分辨率水平一般为50~100kb[18]。间期细胞核虽然仍保持着细胞中原有的空间结构,但没有典型的染色体结构,而且在不同的细胞类型和染色体区域,染色质的凝缩模式和程度不同,因此虽可以作为定量地分析物理图谱中相邻重叠群间隙
的一种工具,但必须有相应的对照标准,故其应用范围受到一定的限制[1,13]。2.4游离的染色质
通过人为地改变染色质的原有空间结构,可突
破原位杂交的分辨率限制。这种染色质丝已经失去了原有的细胞空间结构,其DNA的浓缩度进一
步降低。根据heng等实验统计,每微米游离染色质丝大约相当于80kb的DNA分子长度,其FISH分辨率接近10kb,可用于分析1Mb范围内DNA序列的位置关系。2.5DNA纤维
(Heng,1992)达到了现在的2.5~3.5kb/Lm。这一数值与Watson2Crick建立的DNA双螺旋模型中B2DNA分子的理论值2.97kb/Lm十分接近。高度伸展的植物DNA纤维使FISH的灵敏度和分辨力大大提高,分辨力达到1~2kb,灵敏度可达到&700bp[25]。这些强大的优势使得Fiber2FISH能够直接显示DNA序列的线性位置,从而准确的构建出DNA物理图谱。还可以根据DNA纤维的伸展程度来测定DNA序列的大小和拷贝数,以及物理作图中重叠群(contig)之间的间隙(gap)大小,从而直接对DNA进行定量分析[13]。DNA纤维是在游离的染色质的基础上对间期细胞核更进一步处理。其基本原理是首先将单细胞悬浮液涂在载玻片上,然后用碱性变性剂将染色体的结构破坏,让DNA分子与复合的蛋白质分离而形成游离的DNA纤维[20]。DNA纤维原位杂交具有更快速、更直接、更简便的优点,在1Mb的DNA范围内,其分辨率能达到1~2kb[21]。但DNA纤维原位杂交也有不足之处,它不能阐明靶序列相对于着丝粒、端粒和异染色质块等染色体标记的位置和取向,如果没有已知位置的DNA标记的共定位则不能鉴别染色体[17]。
3染色体原位杂交的发展
3.1染色体荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridizationFISH)
Pinkel等[22]1986年首次报道了荧光原位杂交,即用荧光素标记探针以检测杂交信号的技术。这是一种通过荧光免疫反应来检测信号的非放射性原位杂交技术。FISH具有敏感快捷,能同时显示多种颜色等优点,因此能同时进行多个探针的定位以及次序确定[23]。目前,FISH经不断的丰富和完善已衍生了一系列技术,下面主要介绍3种。
3.1.1细菌人工染色体荧光原位杂交(BAC2FISH)和酵母人工合成染色体荧光原位杂交(YAC2FISH)
将BAC克隆或YAC克隆与具有高灵敏度的FISH技术结合,即细菌人工染色体荧光原位杂交技术(BAC2FISH)或酵母人工合成染色体荧光原位杂交(YAC2FISH)。采用植物基因组的大片段克隆(即BAC克隆和YAC克隆)作探针的FISH技术克服了单拷贝或低拷贝基因难以杂交和不易检测的困难[8]。BAC克隆的插入片段为100~200kb,YAC克隆更大,与靶DNA的杂交几率大大增加,而且杂交信号的强度和检出率显著提高[13]。3.1.2DNA纤维原位杂交(Fibre2FISH)
提高FISH的分辨率和灵敏度一直是一个重要课题。Parra和Windle(1993)、Heiskanen等(1994)、Florijn等(1995)提出的伸展DNA纤维的方法,使DNA纤维的伸展程度从最初的80kb/Lm
3.1.3多色荧光原位杂交(M2FISH)
多色荧光原位杂交是一项新发展的技术,相对于其他原位杂交技术更有助于检测多染色体区域和绘制单一细胞中相互关联的序列图谱。同时为分析染色体变异的高度自动化也提供了基础[26]。
多色荧光原位杂交(M2FISH)就是利用没颜色的荧光素标记不同探针,同时对一张制片进行杂交,从而对不同的靶DNA同时进行定位和分析,并能对不同探针在染色体上的位置进行排序[27]。Dau2
werse等[28]
利用该技术对12种DNA探针分子在染色体上的排列次序及真实物理距离进行同时检测,并取得成功。组合标记FISH(combinatorialFISH)是一个探针同时利用几种不同颜色的半抗原或荧光素进行标记,这使M2FISH的容量大大增加。若用不同比例的各种荧光素对每个探针进行标记,即比例标记FISH,M2FISH的容量将进一步增
强,并能进行定量分析[29]
3.2基因组原位杂交(Genomicinsituhybridiza2tion,GISH)
基因组原位杂交(Genomicinsituhybridiza2tion,GISH)是20世纪80年代末,由染色体原位抑制杂交(ChromosomeinsitusuppressionCISS)衍生而来的一种重要的原位杂交技术,是一个精确、安全的研究工具,在分子细胞遗传学领域发挥着重要作用[30]。GISH常用于分析植物基因组结构,确定外源DNA的插入位置及定量分析,鉴定外源染色体片段,分析植物杂交品种染色体成分来源以及进
行近种属或品系的比较研究[31]
。通过比较研究,可以进一步为探讨物种的起源、进化和分类提供分子细胞遗传学实验证据。
GISH进一步发展也衍生出一系列技术,如多色基因组原位杂交(multicolorgenomicinsituhy2bricization,McGISH)分析技术,即使用不同的半抗原标记不同来源的基因组总DNA,对异源多倍体和近缘物种的种间杂种或它的衍生系进行原位杂交。McGISH在确定源自属间杂交的易位染色体基因组来源方面比一般GISH的分辨能力要高得多;同时基因组原位杂交(simultaneousgenomicinsituhybridizationwithprobepreannealing,SP2GISH),即
用两种不同标记的基因组DNA探针经过预退火反应,来同时原位杂交分析某个物种与近缘或远缘物种间相同和不同的重复DNA顺序在染色体上的分布特征,从而探讨植物的进化关系[13]。3.3原位杂交显带技术(Insituhybridizationbanding.ISHB)
Neslson等[32]创建了原位杂交显带技术,就是将染色体显带技术与原位杂交技术相结合,即在一个片子上显带后再进行原位杂交。这一技术既能确定特定的染色体,又能确定探针所杂交的具体位点,可以更加精确地定位目的基因,将靶序列定位到染
控区存在的富嘌呤2富嘧啶的核苷酸双链螺旋的大沟中,在偏酸性条件下容易与第三链结合。所以,该技术不需要RNA酶和蛋白酶处理,在45e杂交,即可达到很强的序列特异性。杂交后用长波紫外线激发进行光固定,之后的检测方法与荧光原位杂交相同。该方法不需要进行级联免疫放大就可在光学显微镜下分辨出杂交信号。目前,该技术主要应用于
动物及人类研究中。Johnson等用补骨脂素和生物素修饰的162核苷酸同型嘧啶的3条链与人类第17染色体上A2卫星的单一多拷贝序列原位杂交。随着人们对植物的三链DNA的深入研究以及探针色体的特定区段[33]
。染色体分带原位杂交技术对控制农艺性状的基因进行细胞学遗传分析,从而为克隆这些优质基因,应用于植物遗传育种,培育出更多的对人类有益的品种打下坚实的理论应用基础[23]。
3.4引物原位DNA合成技术(PrimedinsituDNAsynthesis,PRINS)
DNA原位合成技术是由Koch等(1989)建立的[31]
。此技术是利用寡聚核苷酸引物对细胞残余和浓缩染色质的高渗透性,从而提高原位杂交的效率和检测的灵敏度[12]。基本方法是在退火温度下,将变性的染色体与末端标记的寡核苷酸引物特异结合,最初是利用探针作为引物,并在KlenowDNA聚合酶或TaqDNA聚合酶的催化下,在反应液中渗入已标记的脱氧核糖核苷酸,引物原位延伸,据此检测探针杂交的位置。其优点是简单而快速,背景干
3.5原位PCR(insitupolymerasechainreaction,IS2PCR)
原位PCR技术是近年来不断完善的PCR技术与原位杂交技术的完美结合。Hasse等(1990)首次报道了原位DNA多聚酶链反应,简称原位PCR(insituPCR)。该技术集PCR的高效扩增与原位杂交的细胞定位优点于一身,能够在组织切片、细胞等样品中检测到低拷贝甚至是单拷贝的DNA和RNA,并在细胞形态学上准确定位。它是通过在单细胞或染色体水平上对特定的DNA序列进行原位PCR扩增后,根据带有标记的扩增产物来检测定位。它与PRINS技术极为类似,只是其反应信号强度经多次循环大为增加[23]。原位PCR技术包括直接原位PCR、间接原位PCR、原位反转录PCR、原位再生式序列复制反应4种技术,可根据具体研究目的选择
实验方法[34]
3.6第三链原位杂交(thirdstrandinsituhybrid2izationTISH)
Johnson等[35]
1999年首次提出了第三链原位杂交技术。它是根据寡聚核苷酸链的特点,设计的一种不需要对染色体进行变性处理的原位杂交方法。其原理是,基因组中重复序列区域基因表达调
设计方法的完善,该技术也可应用于植物的研究[12,36]。
4染色体原位杂交新技术的应用
目前,染色体原位杂交新技术在染色体识别,基因定位,基因重排,染色体易位,亲缘关系以及遗传图谱的建立方面应用较为广泛,其中以基因定位应用最为广泛。Hanson等(1995)和Gomez等(1997)利用BAC2FISH和YAC2FISH技术成功地将不同低拷贝基因的BAC克隆分别定位在棉花和高粱的染色体上。Jiang等(1995)将与抗白叶枯病基因Xa21相关的BAC克隆定位在水稻的第11染色体
的长臂上,而且是单拷贝座位[37]。Fransz等[25]
(1996)利用Fiber2FISH技术对马铃薯进行了重复序列的定位,之后,在番茄DNA上进行了端粒重复序列的染色体定位和DNA分子排列,并成功地进行了抗虫基因准确的染色体定位。Schwarzacher等[9,10]用GISH在小麦中定位了外源染色体、染色体片段以及染色体结构变异等。Jiang等(1993)采用N显带2GISH(genomicinsituhybridization)技术证实了最小的18S、26S核糖体基因簇位于中国春小麦(CS)的7D染色体上,同时他们结合C2显带和FISH技术,定位了小麦/黑麦易位系中的断裂点和特殊的染色体。Cuadrado等(1996)采用C显带原位杂交技术,成功地鉴定小麦中黑麦基因的遗传
。Abbo等(1993)以克隆的小麦rDNA为引物,用PRINS技术标记和检测到黑麦染色体上的核
仁组织区(NOR)[31]
。Nuovo等(1991)和Zevallos等(1994)利用原位PCR成功地检测出病毒基因及单拷贝基因。Uchiumi等(1998)将原位PCR技术与荧光显色系统结合,成功地在菜豆属植物中进行了豆红蛋白基因的定位研究[12]。Jackson(1998)等利用Fiber2FISH技术成功地对拟南芥第二号染色体上的两邻近重叠(adjacentcontig)的距离进行了估算,并认为该项技术可用来确定分子重叠群图谱上间隙的实际距离,利于重叠群的组装[12]。Long等(1993)利用原位PCR技术成功地用于基因重排
和染色体易位研究[12]
亲缘关系的探讨主要是利用GISH技术。
贵州农业科学
King等()利用GISH做了小麦近缘种属关系配对和重组的研究。ElenaBenavente等(1996)对小麦2黑麦杂种体配对和重组进行了比较[31]。马增艳等(1998)、颜辉煌等(1999)、宁顺斌等(2001)分别用GISH鉴定了抗黄矮病小麦新种质、鉴定栽培稻2药用野生稻杂种以及进行了玉米和水稻基因组同源性研究[29]。
正如上述,染色体原位杂交是现代生物技术的重要组成部分,随着染色体制片技术的不断改进以及组织化学和分子生物学技术的迅速发展,染色体原位杂交技术已得到不断改进和完善,新的原位杂deJongJH,FranszPF,ZabelP.HighresolutionFISHinplants2techniquesandapplications[J].TrendsPlantScience,822631
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(责任编辑:高红卫)
包含各类专业文献、中学教育、各类资格考试、外语学习资料、幼儿教育、小学教育、14植物染色体原位杂交技术的发展等内容。　
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