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引物设计的原则
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引物设计的几点重要原则
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PCR引物设计的11条黄金法则
1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。
2.引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。 3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。 4.引物3′端要避开密码子的第3位。如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简，会影响扩增的特异性与效率。 5.引物3′端不能选择A，最好选择T。引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。 6.碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC集序列区错误引发。 7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Crossdimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。 引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。 8.引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。△G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′端和中间△G值相对较高，而3′端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′端的△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo6软件进行分析）
9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。引物的5′端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能。 10.扩增产物的单链不能形成二级结构。 某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。 11.引物应具有特异性。 引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。 附：值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。做RealTime时,用于SYBRGreenI法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：1)避免重复碱基，尤其是G. 2)Tm=58-60度。3）GC=30-80%. 4)3'端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C. 5)正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。 6)PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150bp最为合适（可以延长至300bp）. 7)引物的退火温度要高，一般要在60度以上；要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。 至于设计软件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMEREXPRESS都应该可以的。 做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不容易。
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引物设计的、软件有哪些?有什么优点和缺点?
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引物设计相关软件! NoePrimer 2.03 独特的引物设计软件 Primer Premier 6.0 DEMO 序列分析与引物设计,非常棒的一个软件.Oligo 7.36 Demo 引物设计分析著名软件,主要应用于核酸序列引物分析设计软件.
Primer D'Signer 1.1 免费的引物设计辅助软件,专门用于pASK-IBA和pPR-IBA表达载体,简化引物设计工作. Array Designer 4.25 Demo DNA微阵列（microarray）软件,批量设计DNA和寡核苷酸引物工具.
Beacon Designer 7.80 Demo 实时荧光定量PCR分子信标(Molecular beacon )及TaqMan探针设计软件.
NetPrimer JAVA语言写成的免费引物设计软件,用IE打开运行. TGGE-STAR DOS软件,PCR结合梯度凝胶电泳实验引物设计软件. e-PCR 2.3.9
电子克隆是一种电脑软件,用来识别DNA序列标签位点（STSs). FastPCR 6.0.165b2 快速设计各种类型PCR引物,还包括一些常用的DNA与蛋白序列软件工具； OligoMaster 1.0.164 多用户寡核苷酸管理软件,可建立寡核苷酸数据库 PerlPrimer v1.1.19 一个免费的用来设计引物的开源软件. AmplifX 1.5.4 设计与管理引物的软件. AutoDimer 1.0 快速筛选二聚体引物软件. MutaPrimer 1.00 用于定点突变的引物设计桌面工具软件 ORFprimer 1.6.4.1 JAVA语言设计的引物设计软件 Primer Prim'er 5.6.0 Flash制作的PCR引物设计软件. PCR Analyzer 1.0
实时RT-PCR反应中估算初始扩增子浓度软件 在线工具
DNAWorks 3.0
是一个帮助进行基因合成的设计寡核苷酸序列的免费程序. 程序仅需要输入一些简单的信息,比如,目标蛋白的氨基酸序列及合成核酸序列的温度.程序输出的为适合所选择生物表达的优化密码子的核酸序列.利用DNAWorks的帮助,用两步PCR法,可以成功合成长度达到3000碱基对的基因.原始网站. The Primer Generator 在线引物设计程序. Primer 3 比较有名的在线引物设计程序. Primo Pro 3.4 在线PCR引物设计java系列软件. Web Primer 斯坦福大学提供的在线引物设计软件. AutoPrime 快速设计真核表达实时定量PCR引物在线软件 .一般性引物自动搜索可采用“Premier Primer 5”软件,而引物的评价分析则可采用“Oligo 6”软件.附上两款软件使用方法!Primer Premier 5.0 的使用技巧简介 1. 功能 “Premier”的主要功能分四大块,其中有三种功能比较常用,即引物设计( )、限制性内切酶位点分析( )和DNA 基元(motif)查找( ).“Premier”还具有同源性分析功能（ ）,但并非其特长,在此略过.此外,该软件还有一些特殊功能,其中最重要的是设计简并引物,另外还有序列“朗读”、DNA 与蛋白序列的互换（ ）、语音提示键盘输入（ ）等等. 有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA 来设计引物,由于大多数氨基酸（20 种常见结构氨基酸中的18 种）的遗传密码不只一种,因此,由氨基酸序列反推DNA 序列时,会遇到部分碱基的不确定性.这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物,它们的序列组成大部分相同,但在某些位点有所变化,称之为简并引物.遗传密码规则因物种或细胞亚结构的不同而异,比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的.“Premier”可以针对模板DNA 的来源以相应的遗传密码规则转换DNA 和氨基酸序列.软件共给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择,有纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear）、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion）、支原体（Mycoplasma）、植物线粒体（Plant Mitochondrion）、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion）、一般标准（Standard）、脊椎动物线粒体（Vertebrate Mitochondrion）和酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）. 2. 使用步骤及技巧 “Premier”软件启动界面如下： (转载的时候就没有图) 其主要功能在主界面上一目了然（按钮功能如上述）.限制性酶切点分析及基元查找功能比较简单,点击该功能按钮后,选择相应的限制性内切酶或基元（如-10 序列,-35 序列等）,按确定即可.常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到.你还可以编辑或者添加新限制性内切酶或基元. 进行引物设计时,点击按钮,界面如下： 进一步点击按钮,出现“search criteria”窗口,有多种参数可以调整.搜索目的（Seach For）有三种选项,PCR 引物（PCR Primers）,测序引物（Sequencing Primers）,杂交****（Hybridization Probes）.搜索类型(Search Type)可选择分别或同时查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer,或Both）,或者成对查找（Pairs）,或者分别以适合上、下游引物为主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）.另外还可改变选择区域（Search Ranges）,引物长度（Primer Length）,选择方式（Search Mode）,参数选择（Search Parameters）等等.使用者可根据自己的需要设定各项参数.如果没有特殊要求,建议使用默认设置.然 后按,随之出现的Search Progress 窗口中显示Search Completed 时,再按,这时搜索结果以表格的形式出现,有三种显示方式,上游引物（Sense）,下游引物(Anti-sense),成对显示(Pairs).默认显示为成对方式,并按优劣次序（Rating）排列,满分为100,即各指标基本都能达标（如下图）. 点击其中一对引物,如第1#引物,并把上述窗口挪开或退出,显示“Peimer Premier”主窗口,如图所示： 该图分三部分,最上面是图示PCR 模板及产物位置,中间是所选的上下游引物的一些性质,最下面是四种重要指标的分析,包括发夹结构（Hairpin）,二聚体（Dimer）,错误引发情况（False Priming）,及上下游引物之间二聚体形成情况（Cross Dimer）.当所分析的引物有这四种结构的形成可能时,按钮由变成,点击该按钮,在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况.一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构,因此最好的情况是最下面的分析栏没有,只有.值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度,可参考应用. 在需要对引物进行修饰编辑时,如在5’端加入酶切位点,可点击,然后修改引物序列.若要回到搜索结果中,则点击按钮.如果要设计简并引物,只需根据源氨基酸序列的物种来源选择前述的八种遗传密码规则,反推至DNA 序列即可.对简并引物的分析不需像一般引物那样严格.总之,“Premier”有优秀的引物自动搜索功能,同时可进行部分指标的分析,而且容易 使用,是一个相当不错的软件. Oligo 6.22 使用技巧简介 1. 功能 在专门的引物设计软件中,“Oligo”是最著名的.它的使用并不十分复杂,但初学者容易被其复杂的图表吓倒.Oligo 5.0 的初始界面是两个图：Tm 图和ΔG 图；Oligo 6.22 的界面更复杂,出现三个图,加了个Frq 图.“Oligo”的功能比“Premier”还要单一,就是引物设计.但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界. 2. 使用（以Oligo 6.22 为例） Oligo 6.22 的启动界面如下： 图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG 和Frq,其中Frq 是6.22 版本的新功能,为邻近6至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率.该频率高则可增加错误引发的可能性.因为分析要涉及多个指标,起动窗口的cascade 排列方式不太方便,可从windows菜单改为tili 方式.如果觉得太拥挤,可去掉一个指标,如Frq,这样界面的结构同于Oligo5.0,只是显示更清楚了. 经过Windows/Tili 项后的显示如图： 在设计时,可依据图上三种指标的信息选取序列,如果觉得合适,可点击Tm 图块上左下角的Upper 按钮,选好上游引物,此时该按钮变成,表示上游引物已选取好.下游引物的选取步骤基本同上,只是按钮变成Lower.∆G 值反映了序列与模板的结合强度,最好引物的∆G 值在5’端和中间值比较高,而在3’端相对低（如图：） Tm 值曲线以选取72℃附近为佳,5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应.Frq 曲线为“Oligo 6”新引进的一个指标,揭示了序列片段存在的重复机率大小.选取引物时,宜选用3’端Frq 值相对较低的片段. 当上下游引物全选好以后,需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改.首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性.需要注意的是,引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成,也有可能是在上下游引物之间形成（cross dimer）.二聚体形成的能值越高,越不符合要求.一般的检测（非克隆）性PCR,对引物位置、产物大小要求较低,因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物.第二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同,发夹结构的能值越低越好.一般来说,这两项结构的能值以不超过4.5 为好. 当然,在设计克隆目的的PCR 引物时,引物两端一般都添加酶切位点,必然存在发夹结构,而且能值不会太低.这种PCR 需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果,对引物的发夹结构的检测就不应要求太高.第三项检查为GC 含量,以45-55％为宜.有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高,导致引物的GC 含量不能被控制在上述范围内,这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近,以有利于退火温度的选择.如果PCR 的模板不是基因组DNA,而是一个特定模板序列,那么最好还进行False priming site 的检测.这项检查 可以看出引物在非目的位点引发PCR 反应的可能性.如果引物在错配位点的引发效率比较高,就可能出假阳性的PCR 结果.一般在错配引发效率以不超过100 为好,但对于特定的模板序列,还应结合比较其在正确位点的引发效率.如果两者相差很大,比如在正确位点的引发效率为450 以上,而在错误位点的引发效率为130,那么这对引物也是可以接受的.当我们结束以上四项检测,按Alt+P 键弹出PCR 窗口,其中总结性地显示该引物的位置、产物大小、Tm 值等参数,最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价. 由于“Oligo”软件的引物自动搜索功能与“Primer Premier 5”的相类似,并且似乎并不比后者更好用,在此不再赘述.其实,使用软件自动搜索引物就是让计算机按照人的要求去寻找最佳引物,如果参数设置得当将大大提高工作效率. 除了本地引物设计软件之外,现在还有一些网上引物设计软件,如由Whitehead Institute开发的“Primer 3”等（本网站http://210.72.11.60/ 已引进并调试好该软件,欢迎使用）.该软件的独特之处在于,对全基因组PCR 的引物设计；可以将设计好的引物对后台核酸数据库进行比对,发现并排除可引发错配的引物.因此建议经常做全基因组PCR 的用户试用.
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设计realtimePCR引物的问题
我在设计rtpcr引物时候对一句话不是很理解，就是为了避免基因组的扩增，引物设计最好跨两个外显子，这是什么意思，请指导！！！！
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