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您好.我最近的PCR扩的产物成弥散状,但是能看见目的条带,这是怎么回事啊,我之前试条件时都没有弥散这样的产物酶切能切吗?
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可能性超多的如果是同一个模版,同一个引物,同一条件的PCR,考虑模版/引物/buffer是否污染,引物是否时间比较久有降解.Mg浓度/退火温度是否有改变?考虑降低Mg或者提高退火温度减少非特异扩增.电泳缓冲液不干净也可能会使条带变难看.
是这样的，DNA不同（但别人扩的就没有拖带），酶，缓冲液都是新的。引物前天我扩的都很好（当时扩的很少，就几个样）。条件没变。
如果你再随机挑少量几个样品扩增：还有问题的话，建议你微调PCR的Mg或退火温度条件；如果少量样品没有问题，可能是你在做大量样品的时候时间比较长，引起降解或酶活性降低，注意一直在冰上操作哦。
可以直接割胶回收纯化之后酶切，如果你之后要连接载体作克隆的话，还是建议你再优化条件，单一条带最好。
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&&连接载体转化后挑单菌落，菌落pcr扩出条带，但是摇菌摇不起来
连接载体转化后挑单菌落，菌落pcr扩出条带，但是摇菌摇不起来
载体是连接有EGFP的瞬时表达载体，有氨苄抗性。转化到DH5α中，涂含氨苄的平板。倒置培养12个小时候未见菌落，但是17个小时候有菌落，且密度不是很大，单菌落数不多不少的样子。我先是挑单菌落摇菌，准备做菌液pcr，但是37°C转速200培养过夜之后LB培养基仍然是清亮的，没有任何菌生长。再挑单菌落，换了别人配的LB震荡培养，仍然是没有摇起来。最后我挑单菌落加到20μl的水中做菌落pcr，设置了空白对照，pcr结果显示空白对照没有条带，其它菌落pcr只有两个未扩出条带。将pcr条带最亮的几管分别加到4mlLB培养基中，再加入4μl氨苄，37°C振荡培养过夜。最后居然还是没有菌落生长，培养基一片清亮······
我在网上查到说，挑单菌落的时候可能挑到平板上未干的连接液，连接液里可能含有未连接到载体上的目的片段，所以pcr可以扩出条带。但是我很确定我挑到了菌落，肉眼看到菌落慢慢的分散开来然后水变浑浊。即使是空载，摇菌应该也能摇起来。平板是刚刚倒的，氨苄的作用肯定存在。氨苄也没问题，别人刚用过我直接拿过来用的，别人的结果没出问题。
以前挑过很多次菌，菌液pcr也做过，，都没有发生这种状况。我觉得我的操作没有问题，但是实在是找不到原因了，哪位高手给指点一下啊……
昨天刚刚又转化了一次，现在已经有14个小时了，肉眼只能看到几个小菌落。一般来说12个小时应该就长得差不多了。转化涂板用的是新配制的氨苄板，菌落生长缓慢会不会是感受态细菌的问题呢？细菌没有接受外源抗性质粒的活性了，但还是能缓慢的在含氨苄的平板上生长，在含有氨苄的LB液体培养基里培养24个小时也不会快速的生长。是不是这样呢？
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【求助】求助：普通PCR能跑出目的条带但Q-PCR无扩增
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这个帖子发布于4年零114天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
如题，实验进行几个月了，但是一直没进展，相同的质粒普通PCR能跑出目的条带但Q-PCR却无扩增曲线，求助啊？？不是Q-PCR的敏感性大于普通PCR的吗
不知道邀请谁？试试他们
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在线等帮助啊
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1.引物探针设计有问题，或者合成质量有问题。2.荧光定量PCR试剂有问题。3.模板浓度太高，做梯度稀释后在进行实验。最好把你实验的详细信息在描述下，方便各位战友分析。
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yybiotech 1.引物探针设计有问题，或者合成质量有问题。2.荧光定量PCR试剂有问题。3.模板浓度太高，做梯度稀释后在进行实验。最好把你实验的详细信息在描述下，方便各位战友分析。首先感谢 您的帮助1引物和探针都是在上海生工合成，而且合成了不止一对，感觉不会有质量问题，而且买回来溶解过了就分装。2PCR试剂我是用罗氏的也不会有问题吧3模板浓度我是从10次方稀释到10但是只有10、9、8次方有扩增，比较恼火啊我的体系如下：probe master mix 10μl,模板2μl,上游引物(5μM)2μl(终浓度为0.5μM),下游引物同前，探针(5μM)1ul，水3μl.因为实验还未有阳性样本，所以一直使用合成的质粒当成模板使用。而且我的实验很不稳定，有时候低浓度能出来但是高浓度的出来不来，所以一直很纠结
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模板稀释1-7次方，普通PCR能否做出来？
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不知道你所谓的普通pcr指什么？与Q-PCR的试剂是否完全不同？两个体系有任何的不同，同样的扩增条件也可能一个能扩出条带，一个扩不出。建议采取下面的措施：1、用你扩普通pcr的体系，加入探针扩增（只比普通pcr多加个探针），同时做个不加探针的对照，看是否有峰出现，然后都跑下电泳看下有无条带2、用Q-PCR的体系做个温度梯度，一般退火温度影响较大，不知你做定量pcr的产物有没有跑电泳看是否有条带通过上面的方法应该能解决你的问题
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你不能用扩普通pcr的反应条件来扩荧光定量pcr！！！！两个体系不同，尤其是酶不同
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seuzsl 不知道你所谓的普通pcr指什么？与Q-PCR的试剂是否完全不同？两个体系有任何的不同，同样的扩增条件也可能一个能扩出条带，一个扩不出。建议采取下面的措施：1、用你扩普通pcr的体系，加入探针扩增（只比普通pcr多加个探针），同时做个不加探针的对照，看是否有峰出现，然后都跑下电泳看下有无条带2、用Q-PCR的体系做个温度梯度，一般退火温度影响较大，不知你做定量pcr的产物有没有跑电泳看是否有条带通过上面的方法应该能解决你的问题谢谢，普通的PCR就是跑胶的那种，普通PCR的MIX是天根的，Q-PCR的probe master mix是罗氏的，肯定是不一样的。您说的用QPCR做温度梯度，那还要不要加探针呢？还是按照原来的体系加样
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yybiotech 模板稀释1-7次方，普通PCR能否做出来？一般情况下只有6次方，7次方能跑出目的条带，其他的都没有
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seuzsl 你不能用扩普通pcr的反应条件来扩荧光定量pcr！！！！两个体系不同，尤其是酶不同我只是用普通PCR大致看看引物可以不可以，两个反应条件是不一样的。Q-PCR我用的是两步法。普通PCR时我也跑过梯度，感觉每个温度的条带都相差不大。
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建议：定量PCR的产物电泳确认是否有产物，如果有产物说明体系及引物没有问题，探针法中定量检测的是探针被水解后的荧光，有产物但没有荧光，怀疑探针有问题。
如果电泳结果根本没有产物，而定量用的引物和普通PCR用的引物一致的话，建议调整反应条件。
信息不够具体。提供反应条件，反应体系，等信息。
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今夕何夕_1989 谢谢，普通的PCR就是跑胶的那种，普通PCR的MIX是天根的，Q-PCR的probe master mix是罗氏的，肯定是不一样的。您说的用QPCR做温度梯度，那还要不要加探针呢？还是按照原来的体系加样当然要加探针了，体系一致，只是退火温度做个梯度也要跑下电泳看是否有产物还有就是为什么要用两个体系？其实第一个体系能跑出条带，直接在里面加探针就可以了
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willa_521 建议：定量PCR的产物电泳确认是否有产物，如果有产物说明体系及引物没有问题，探针法中定量检测的是探针被水解后的荧光，有产物但没有荧光，怀疑探针有问题。
如果电泳结果根本没有产物，而定量用的引物和普通PCR用的引物一致的话，建议调整反应条件。
信息不够具体。提供反应条件，反应体系，等信息。谢谢，我的反应体系如下：probe master mix 10μl(罗氏),模板2μl,上游引物(5μM)2μl(终浓度为0.5μM),下游引物同前，探针(5μM)1ul，水3μl，是20μl体系。ABI7500，程序如下：95℃（10min）;95℃(10s),60℃(30s),40个循环您的意思就是直接用Q-PCR产物跑电泳看看吗？
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seuzsl 当然要加探针了，体系一致，只是退火温度做个梯度也要跑下电泳看是否有产物还有就是为什么要用两个体系？其实第一个体系能跑出条带，直接在里面加探针就可以了那我晚上就直接用罗氏的mix试一下，去PCR仪上把退火温度跑个梯度，看看那个比较好，哎，都快绝望了，谢谢你啊
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定量 PCR产物直接电泳，确认问题点。另外，探针法建议使用三步法反应条件。
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楼主找出原因了么？求分享经验啊
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Q-PCR两步法扩增不如 三步法，你可以试试三步法，上机，我做了，两步不行。三步法结果挺好！
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今夕何夕_1989 我只是用普通PCR大致看看引物可以不可以，两个反应条件是不一样的。Q-PCR我用的是两步法。普通PC ...个人觉得应该是荧光PCR试剂有问题，换下其他公司的试试！
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zengyb1987 个人觉得应该是荧光PCR试剂有问题，换下其他公司的试试！不会吧，我用的是罗氏的试剂啊
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高世珂 Q-PCR两步法扩增不如 三步法，你可以试试三步法，上机，我做了，两步不行。三步法结果挺好！真的吗，那我去试试吧，谢谢你了
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PCR阴性对照始终有条带上一次PCR的阴性对照跑出来一条带.而且跟我的目标片段位置目测是一样的.我的片段大小加上两段引物,长度是160BP.大家都说是加错样了或者污染了.昨天特意到超净台里重新做了一次.仍然是这样.我要疯了.为什么.是不是我的无菌水有问题.我本周刚灭的菌啊.我说的阴性对照是指不加模板
加水的。。刚百度了一下发现有人说的阴性对照好像和我指的不是一个意思。。
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明白你的意思,你这个阴性对照出现目的条带,一个原因：就是你的PCR体系中任一一个试剂被模板污染了,把把PCR的试剂全部换新,重新来试,明白了吗我也遇到过这样的问题
很有可能。
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要么是无菌水污染了 不过我更觉得是你的目的片段太短了 那个条带只是引物聚体 你可以再多跑一会看能不能跑开 还有就是你P目的片段后有没有测序确定你扩增出来了 这么短的 说不定你目测的什么目的片段也只是引物聚体而已目的片段没有错。测序过。是用于荧光定量的。所以必须小。
引物聚体不会在这个位置上吧。都已经接近200的位置了。所以让你再跑一会啊 毕竟marker的浓度是很大的 要不然还有什么可能呢 什么...
所以让你再跑一会啊 毕竟marker的浓度是很大的 要不然还有什么可能呢 什么试剂里混入模板了 你不会操作这么不小心的吧
不仅仅怀疑水的问题，也有可能模板混进了引物里，或是buffer里，dNTP里，都有可能，最好就是全部都换新的，试一试。省时省气省钱！不要试图去寻找哪个样品污染了，那是浪费时间力气金钱！
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