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AYL-S7-322GM(曲霉菌抗原)实验操作规范30
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编写者：沈继录 审核者：
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GM（曲霉菌抗原）实验操作规范
曲霉菌感染通常由于吸入空气中曲霉菌孢子引起。侵入性曲霉菌感染是曲霉菌感染的主要形式，一般有以下易患因素：恶病质、肿瘤、使用皮质醇激素、以及由于器官移植而使用免疫抑制剂等。早期正确用药是治疗的关键，但是由于血培养中很少可以分离到曲霉菌，所以诊断曲霉菌感染较为困难。目前诊断曲霉菌感染主要依据非特异的临床症状和放射检查。
检测血清中可溶性曲霉菌抗原（半乳甘露聚糖galactromannan）已成为目前主要的血清学方法，这个方法有助于曲霉菌感染的早期诊断，提高检测特异性。本试剂盒是利用酶联免疫一步夹心法半定量测定血清中半乳甘露聚糖galactomannan抗原。
试剂盒组成：
1块（12 x 8 ）
R2 浓缩洗液
1 x 100ml（10倍浓缩）：
R3 阴性控制
2 x qs 1ml
2 x qs 1ml（2.0 ng/ml）
R5 阳性质控
2 x qs 1ml
1 x 10.5 ml
R8 TMB稀释液
R10 终止液
实验前，将试剂平衡至室温（18-30℃）
样本采集：
用干燥管采集的血样（只能用干燥管采集的血清样品），离心后，吸取血清并保存在密闭的试管中。样品离心前应完全凝结
试剂配制：
1）实验用洗液——用无菌蒸馏水将浓缩洗液（R2）按 1:10稀释，
2) 实验用阴性质控(R3)、阳性质控(R5)、标准血清（R4）——用1000μl超纯无菌水稀释配制成三等份，其中两份零下二十度冷冻。
3）实验用显色液——用底物稀释液（R8）将显色液（R9）按1:50稀释。
样品处理：
分别取阴性质控(R3)，阳性质控(R5)，标准血清（R4）和病人都样本放入1.5ml Eppendorf管。按3:1加入处理溶液(R7)，摇匀，密封管子。100℃水浴3分钟后，10000g离心10分钟。
取上清液用于检测可溶性曲霉菌抗原。处理好的血清，必须尽快使用。所有血清处理程序，可用于念珠菌抗原测试，这两种血清的处理程序是一样的。
1）取实验所需数量的微孔板
2）每孔加入50μl酶反应液R6（使用前，颠倒R6小瓶以摇匀。）。
3）分别加入50μl处理过血清的上清液，阴性质控, 阳性质控，标准血清上清液
可以根据下面的计划放置：
-A1：阴性质控血清（R3）
-B1：标准血清（R4）
-C1：标准血清（R4）
-D1：阳性质控血清（R5）
3）用封板胶覆盖整个微孔板，按紧整个表面保证滴水不漏。
4）于37℃恒温温育90分钟
5）拿去粘合膜，弃去孔内的液体，用稀释后的洗液洗5次。反转板条放在吸水纸上轻拍，去掉所有洗液，把板条弄干。
9）每孔加200μl稀释显色液，室温（18-30℃）避光（不要使用封板胶）反应30分钟。
10）每孔加100μl终止液，
11）30分钟内于酶标仪450/620 nm读数。
1. 检测CUT-OFF值。
Cut-off值 = 标准血清（R4）OD值。
2. 计算每个测试后血清的指数（I）：
I = OD 样品/cut-off 值
该计算限于内部测试和实验室测试不同酶免反应条件下的各种OD。
测试确定：
每次测试都要用质控血清。以下标准确保测试过程的有效性：
0.3≤cut-off值≤0.8
阳性质控血清（R5）指数&2.0
阴性质控血清（R3）指数&0.4
4）结果解释
. 阴性——指数I&0.5
. 阳性——指数I≥0.5
病人血清样品的指数&1,必须用同一样品（用未处理血清）再测和测试该病人的另一样品以确认，来排除收集样品后受污染导致的假阳性结果。
24小时内完成试验的，可将样品储存在+2-8℃；不能在24小时内完成试验的，或要运输样品的，样品必须 冰冻在-20℃以下。
样品血清只允许最多3次冻融。
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曲霉菌检测 GM检测方法
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3秒自动关闭窗口侵袭性曲霉菌病---&ICU患者的高危因素
侵袭性曲霉菌病---
ICU患者的高危因素
是曲霉菌感染人体致病最严重的一种形式。对于ICU的危重患者，有报道的IA的发病率高达10%，1 这个数字要高于以往其他疾病人群所报道的数字0.33-6.9%。2& 事实上， 在ICU患者中，IA的危险因素有很多，不仅仅限于由EORTC/MSG指南中提到的单一的宿主因素。比如，长期糖皮质激素治疗的患者，慢性阻塞性肺病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease,
COPD），肝硬化，实体器官肿瘤，HIV感染，肺移植，以及较长时间的ICU住院（大于21天）等。3
两项针对COPD患者伴发IA研究分析发现，这类患者的临床结局都非常差，死亡率均达到了100%。4,5 在2014年另一项研究中，COPD伴发IA的死亡率为66%。1 在 and Mycoses
Study Group, EORTC/MSG）的标准中，类固醇使用超过三周以上被认为是IA的危险因素。对于严重的和/或持续的败血性休克患者，使用低剂量的类固醇（盐皮质激素）可以改善临床结局。6
但它们也对巨噬细胞杀伤曲霉菌孢子和单核细胞杀伤曲霉菌菌丝的作用存在损害。7
对于有肺部疾病的患者，即使使用低剂量的类固醇，其伴发IA的风险也会更高。8 对于肝硬化患者，由于其细胞吞噬作用和趋化作用受损，被认为是导致IA发病的可能因素。9
由于ICU患者伴发IA有较高的发病率和死亡率，建立可以实现早期诊断的检测方法或诊断标准就非常有意义。血清曲霉菌抗或半乳甘露聚糖是有报道的血液肿瘤患者中IA检测的可靠手段。10 GM检测比较于其他方法，可以帮助临床提早8天诊断IA。11 血清GM抗原是曲霉菌细胞壁的多糖成分，在曲霉菌菌丝侵袭机体组织时释放。这个成分可通过一步夹心酶联免疫法进行检测。近年的一些研究证实，在血液肿瘤患者中，由于GM水平升高与较差的临床结局呈强相关，因此认为GM抗原检测也可作为IA临床结局的衡量工具。12,13
GM抗原检测所使用的试剂为Bio-Rad公司的曲霉菌抗原检测试剂盒（PlateliaTM Aspergillus
Ag），该试剂为一步夹心酶联免疫法，利用单克隆抗体（EBA-2）对血液循环中的GM抗原。推荐首次检测时间点一般为当临床怀疑患者发生IA时，或者需要对免疫妥协患者进行常规筛查时。1
另外，对于开始进行抗真菌治疗的患者，推荐进行每周两次的GM水平监测，以帮助判断临床疗效及患者预后。14
1. Suzanne Teering, Annelies Verreth, Anneleen
Peeter, et al Prognostic value of serum galactomannan in mixed ICU
patients: a retrospective observational study Anaesthesiology
Intensive Therapy 2014, vol. 46, no 3, 145&154
2. Meersseman W, Vandecasteele SJ, Wilmer A et
al.: Invasive aspergillosis in critically ill patients without
malignancy. Am J Respir Crit Care Med :
3. Dimopoulos G, Frantzeskaki F, Poulakou G et
al.: Invasive aspergillosis in the intensive care unit. Ann NY Acad
Sci : 31&39.
4. Bulpa PA, Dive AM, Garrino MG et al.: Chronic
obstructive pulmonary disease patients with invasive pulmonary
aspergillosis: benefits of intensive care? Intensive Care Med 2001;
27: 59&67.
5. Rello J, Esandi ME, Mariscal D et al.: Invasive
pulmonary aspergillosis in patients with chronic obstructive
pulmonary disease: report of eight cases and review. Clin Infect
Dis 73&1475.
6. Annane D, S&bille V, Charpentier C et al.:
Effect of treatment with low doses of hydrocortisone and
fludrocortisone on mortality in patients with septic shock. JAMA
: 862&871.
7. Lionakis MS, Kontoyiannis DP: Glucocorticoids
and invasive fungal infections. Lancet :
8. Palmer LB, Greenberg HE, Schiff MJ:
Corticosteroid treatment as a risk factor for invasive
aspergillosis in patients with lung disease. Thorax 1991; 46:
9. Bailey RJ, Woolf IL, Cullens H et al.:
Metabolic inhibition of polymorphonuclear leucocytes in fulminant
hepatic failure. Lancet 62&1163.
10 .Maertens J, Verhaegen J, Lagrou K et al.:
Screening for circulating galac&tomannan as a noninvasive
diagnostic tool for invasive aspergillosis in prolonged neutropenic
patients and stem cell transplantation reci&pients: a prospective
validation. Blood 04&1610.
11. Maertens J, Van Eldere J, Verhaegen J et al.:
Use of circulating galacto-mannan screening for early diagnosis of
invasive aspergillosis in allogeneic stem cell transplant
recipients. J Infect Dis : .
12. Woods G, Miceli MH, Grazziutti ML et al.:
Serum Aspergillus galactoman&nan antigen values strongly correlate
with outcome of invasive asper&gillosis: a study of 56 patients
with haematologic cancer. Cancer : 830&834.
13. Koo S, Bryar JM, Baden LR et al.: Prognostic
features of galactomannan antigenemia in galactomannan-positive
invasive aspergillosis. J Clin Microbiol 2010; 48:
14. Lehrnbecher T, Phillips R, Alexander S, et al.
Guideline for the Management of Fever and Neutropenia in Children
With Cancer and/or Undergoing Hematopoietic Stem-Cell
Transplantation. Journal of Clinical Oncology. 2012 epub ahead of
print. This manuscript is the first pediatric fever and neutropenia
guideline. It summarizes the impact of both galactomannan and beta
glucan testing in children.
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G试验和GM试验检测的方法及临床意义
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G试验和GM试验检测的方法及临床意义
侵袭性真菌病即是以往所说的深部真菌病，是指致病性真菌侵犯皮下组织、粘膜、肌肉和内脏器官等所引起的真菌感染性疾病。引起侵袭性真菌病的病原菌有270余种，常见病原菌有念珠菌（占70%-90%）和曲霉菌（占10%-20%）。医学教|育网搜集整理常引起侵袭性真菌病的高危因素有严重粒细胞缺乏、免疫功能低下、移植、糖尿病、肾衰、血透、慢阻肺、实体器官移植、长期激素治疗以及入住ICU等。
G试验是检测1，3-&-D-葡聚糖的试验，采用的方法是动态显色法。1，3-&-D-葡聚糖是真菌细胞壁的一种成分，广泛存在与各种真菌，只有当真菌进入体内被吞噬细胞吞噬，细胞壁被感染，对于念珠菌血症而言，G试验检测是首选检查方法。G试验检测一般先于临床症状平均4天，平均早于发热5天，是早期检测的重要手段。G试验检测值&70 pg/ml定义为阴性，此时不建议抗真菌治疗，当检测值在70-95 pg/ml时定义为灰区，此为观察期，应连续监测，当检测值&95 pg/ml定义为阳性，建议结合临床症状诊断治疗。
GM试验是检测半乳甘露聚糖抗原的试验，采用的方法是酶免法。半乳甘露聚糖（GM）是曲霉细胞壁的一种成分，GM从薄弱的菌丝顶端释放，曲霉菌感染的患者血液内存在GM.曲霉菌不入血，主要是侵袭血管壁，沿血管壁进行侵袭，进入血液。GM试验是曲霉菌病早期诊断的筛查指标。GM常于临床症状前5-8天和影像学出现异常之前7.2天出现。GM释放量与菌量呈正比，可以反映感染的程度，若两次检测阳性即可以诊断侵袭性曲霉菌感染，GM试验也可作为疗效判断的重要指标。GM实验检测值&0.65 ug/l定义为阴性，此时不建议抗真菌治疗。当检测值在0.65-0.85 ug/l时定义为灰区，此为观察期，应连续监测，当检测值&0.85 ug/l时定义为阳性，建议结合临床症状诊断治疗。
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