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梅毒血清1:2稀释是什么意思?
女 | 23个月
健康咨询描述：
10月9日我的孕期就四个月了昨天在医院打了两针左右一针医生叫我礼拜四再去找他，我想请问，我现在治疗肚子里的孩子还有救吗、。？风险是有我知道，但是我会尽力去挽回孩子的健康，
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擅长: 擅长儿科长见疾病，贫血，肺炎，腹泻，佝偻病等，新生
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疾病百科| 梅毒
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&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&免疫印迹法
免疫印迹法 (Western blotting) 是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。免疫印迹法具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法，如组织抗原的定性定量检测、多肽分子的质量测定及病毒的抗体或抗原检测等。
免疫印迹法(immunobiotting test,IBT)亦称酶联免疫电转移印斑法(enzyme linked
immunoelectrotransfer blot,EITB),因与Southern早先建立的检测核酸的印迹方法 Southern
blot 相类似,亦被称为Western-blot.
免疫印迹法分三个阶段进行.第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE):抗原等蛋白
样品经SDS处理后带阴电荷,在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动,分子量越小,泳动速度就越
快.此阶段分离效果肉眼不可见(只有在染色后才显出电泳区带).第二阶段为电转移:将在凝胶
中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上,选用低电压(100V)和大电流(1～2A),通电45min
转移即可完成.此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见.第三阶段为酶免疫定位:将印有蛋白质条
带的硝酸纤维素膜(相当于包被了抗原的固相载体)依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后,加
入能形成不溶性显色物的酶反应底物,使区带染色.常用的HRP底物为3,3'-二氨基联苯胺(呈
棕色)和4-氯-1-萘酚(呈蓝紫色).阳性反应的条带清晰可辨,并可根据SDS-PAGE时加入的分子
量标准,确定各组分的分子量.本法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性,
是一个有效的分析手段,不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性,并可用于疾病的诊断.在艾
滋病病毒感染中此法作为确诊试验.抗原经电泳转移在硝酸纤维素膜上后,将膜切成小条,配合酶
标抗体及显色底物制成的试剂盒,可方便地在实验室中供检测用.根据出现显色线条的位置可判断
有无针对病毒的特异性抗体.
Western Blotting检测人血清IgG重链
1．掌握Western blotting的基本原理。
2．熟悉Western
blotting的实验操作步骤。
3．加深理解理论课IgG的基本结构。
1979年Towbin最先采用Western Blotting（也称之为免疫印迹）技术用于分析蛋白，该技术现已成为蛋白分析的一种常规技术。它是根据抗原抗体结合的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白。“印迹”是指蛋白质从凝胶转移到膜上的过程中同时保持它们的相对位置和分辨率。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。
&&&&&&&&免疫印迹的主要操作过程分为三个步骤：1、蛋白质经凝胶电泳按分子量大小不同依次分离；2、将分离的蛋白转印（印迹）到印迹膜（通常是硝酸纤维素膜或PVDF膜）；3、对转印到印迹膜的蛋白成分进行免疫学检测。化学发光检测法是最灵敏的检测法，底物在酶的催化下被氧化，释放的光子通过X胶片曝光，也可以用CCD检测系统或专为化学发光检测设计的成像系统检测。无论使用哪种底物，信号的强度与印迹膜上抗原的丰度呈正比。
免疫印迹基本步骤
SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量.PAGE能有效的分离蛋白质，主要依据其分子量和电荷的差异，而SDS-PAGE(SDS变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异，因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中加入含有SDS，其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构，SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级及三级结构，并与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，电泳样品加入样品缓冲液后，要在沸水中煮5分钟变性使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物，SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时，蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化，蛋白质也完全变性和解聚，并形成棒状结构，稳定的存在于均一的溶液中，SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷，平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子，这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖，远远超过其原来所带的电荷，从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计，消除了不同分子之间原有的电荷差别，其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小，这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基.样品处理液中通常加入溴酚蓝染料， 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子，可以自由通过凝胶孔径，所以它显示着电泳的前沿位置，当指示剂到达凝胶底部时，即可停止电泳。另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部。最常见的凝胶电泳缓冲液由Tris-glycine组成。缓冲液可以包含0.1%去污剂，通常是SDS。Tris-glycine可用于分离很宽分子量范围（6 - 200 kDa）的蛋白质，并且与变性或非变性条件相容。
&&&&&&&& 免疫印迹检测的具体操作过程存在很大差异。其中最常见的是直接和间接检测，间接检测法即一抗首先与抗原结合，再加入能与一抗特异结合标记过的二级抗体。标记物包括生物素、荧光探针（如荧光素和罗丹明）和酶（如HRP和AP）。这种方法的优点是单个二级抗体可测定多种多样的一级抗体从而避免了逐一标记一级抗体，另一方面一抗通常能与几个二抗分子结合，从而起了信号放大的作用。其缺点是检测过程增加了额外的温育步骤。与直接检测法相比，大多数研究者更喜欢用间接方法。
本实验利用辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG抗体直接检测人血清IgG重链，无需再用第二抗体。先将人血清上样进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过转移系统将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维膜上，再用丽春红S(Ponceau S)对硝酸纤维膜染色并用铅笔标出分子量标准的条带(该染料只会短暂显色，进行Western印迹时可被洗去，且与所有免疫学检则方法兼容)，漂洗后再用封闭液(本实验采用牛血清白蛋白)封闭膜上可能结合非相关蛋白的位点以降低非特异性结合的背景，封闭之后滤膜加入酶联抗体温育，漂洗后加入生色底物进行特异性显带。免疫偶联的辣根过氧化物酶最敏感的底物是3，3＇-二氨基联苯胺，它在过氧化物酶所在部位转变成棕色沉淀。在Co2＋或Ni2＋存在下可以加深沉淀的颜色并提高反应的灵敏度。
IgG是由两条轻链和两条重链通过二硫键连接起来，变性后轻链和重链分开，因此在膜上可以显出重链带(约为57KD)。
三、仪器和试剂
1.仪器：夹心式电泳槽，转移电泳槽，电泳仪，PVDF膜，直径9cm培养皿，剪刀、镊子、刀片，微量进样器，可调移液器，3MM滤纸。
2.丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，四甲基乙二胺(TEMED)，过硫酸铵，Tris（三羟甲基氨基甲烷），甘氨酸，蔗糖，溴酚蓝，SDS，甲醇，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG， BSA，HCl，NaCl，Tween-20，二氨基联苯胺(DAB系统)。
(1)电极缓冲液：1×电泳缓冲液配制
&&&&&&&&Tris碱3.03 g，甘氨酸14.4 g，SDS 1.0 g，双蒸水调至体积为1 L，pH8.3。
(2)转移缓冲液：2.9g甘氨酸,5.8gTris碱，0.37gSDS，并加入200ml甲醇加水至1L, pH8.3。
(3)TBS（Tris-HCl，NaCl）缓冲液：12.1g Tris碱， 9g NaCl，蒸馏水500ml,HClpH7.5,定容1L.
(4)T-TBS：取1000mlTBS，加1 ml Tween-20。
(5)封闭液：
1×TBS-T加入5 % w/v BSA（或脱脂奶粉），实验前配置。
(6)抗体稀释液配制：
? 用于多克隆抗体：1×TBS-T或含5% BSA的1×TBS-T
(7)丽春红溶液的配制:
储存液(10×)： 0.1g丽春红溶于5ml冰乙酸，加入双蒸水定容至100ml，临用前双蒸水稀释10倍为应用液
(8)洗膜缓冲液（TBS-T）配制：
1 L的1×TBS中，加入1 ml的Tween-20至Tween-20 %浓度为0.1 %。
(9)底物溶液1ML双蒸水加A，B，C各一滴。20-30ml，临用前配制。
(10)30％丙烯酰胺贮备液：29.2g 丙烯酰胺，0.8g 甲叉双丙烯酰胺，加双蒸水至100ml。
(11)浓缩胶缓冲液：1mol/L
Tris-HCl，pH6.8。
(12)分离胶缓冲液：1mol/L
Tris-HCl，pH8.8。
(13)10％过硫酸铵（APS）(w/v)：临用前用双蒸水配制。
(14)20％SDS(w/v)。
(15)10％TEMED。
(16) 1×SDS上样品缓冲液：50mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH6.8），10％甘油，2％SDS，100mmol/L二硫苏糖醇，0.1％溴酚蓝。
(17)考马斯亮蓝R250染色液：考马斯亮蓝R250 0.25g，50%甲醇454ml，冰乙酸46ml，总体积500ml。
(18)脱色液：甲醇50ml，冰乙酸75ml，加水至1000ml。
以上试剂都用双蒸水配制。
四、实验步骤
1.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
(1)灌胶前的准备：a)&洗板；b)配板
(2)凝胶的配制：
根据所需要的胶液浓度和体积按下表比例配制。
本实验配制分离胶15ml，浓缩胶10ml。
制备分离胶（pH 8.8）
30:0.8% w/v丙烯酰胺:双丙烯酰胺
1.0M Tris-Cl pH 8.8
混合，灌胶前加入APS和TEMED
制备浓缩胶（pH 6.8）
4%浓缩胶配合&10%的分离胶使用，6%浓缩胶配合&10%的分离胶使用。
浓缩胶浓度
30:0.8% w/v 丙烯酰胺:双丙烯酰胺
1M Tris-Cl pH6.8
混合，灌胶前加入APS和TEMED
将配制好的分离胶溶液缓慢加入到装配好的板中，待胶液加至距短玻璃板顶端约3cm处时停止灌胶，稍后在胶液表面上小心加入厚约0.5cm的水层，以保持分离胶面平整，并起到隔绝空气（目的是隔绝氧气）的作用。大约30min聚合完毕 。
使用Whatman 3 mm滤纸吸去分离胶上层覆盖的所有水层，如上配制浓缩胶。将浓缩胶加入板中至顶端，小心插入梳子，注意不要产生气泡。凝胶聚合1小时左右。
&&&&凝胶电泳前，拔去梳子，每孔均用1×电泳缓冲液清洗。上、下层电泳槽中加入1×电泳缓冲液，上层槽中缓冲液液面需超过上样孔顶端1 - 2 cm。BioRad电泳槽中需加入500 ml的1×电泳缓冲液（50 ml的10×储存液+450 ml dH20）。
(4)样品制备：
①人血清用生理盐水稀释5倍，再加等量2×上样缓冲液混匀，。
②人IgG标准蛋白(10 mg/管)用生理盐水稀释成浓度2mg/ml，再加等量2×上样品缓冲液混匀。
③蛋白Mark，按说明书适量稀释。
④空白对照仅加等量2×上样缓冲液。
全部沸水浴加热5分钟。
加样顺序：
(5)电泳： 200V1.5 h电泳至溴酚蓝刚出胶底部。电泳于4℃进行。
2.转印蛋白质到PVDF膜上。
. 电转移是最常用的蛋白质转移方法，其优点是速度快和转移更完全。转移缓冲液是一种Tris-甘氨酸缓冲液，常用于湿转系统。该缓冲液pH为8.3，比大多数蛋白质的等电点（pI）高，蛋白质带净负电荷并向阳极迁移。
实验准备：
①转移缓冲液：2.9g甘氨酸,5.8gTris碱，0.37gSDS，并加入200ml甲醇加双蒸水至1L, pH8.3。
②.制备足够转移缓冲液以充满转移槽，另外准备200 ml用于平衡凝胶和膜以及润湿滤纸。
③.从玻璃板上取下凝胶，去除所有浓缩胶。
④.将凝胶浸入转移缓冲液中15 - 30分钟。
⑤.滤纸在转移缓冲液中至少浸泡30秒。
⑥.准备膜： 在甲醇中润湿膜15秒，保证膜由不透明变成半透明。
?小心将膜放入双蒸水水中浸泡2分钟。
小心将膜放入转移缓冲液中平衡至少5分钟。
按照泡沫、滤纸、凝胶、转印膜、滤纸、泡沫的顺序组装转移夹层。
（注：胶，虑膜，滤纸大小一样）
②将转移夹放入转移槽中，确保转移夹的凝胶侧面向阴极（-）而膜侧面向阳极（+）。
③向转移槽中加入适量缓冲液，确保将转移夹完全浸没。
④将黑色电极引线（-）插入转移装置的阴极插孔，红色阳极引线（+）插入阳极插孔。
⑤连接阳极和阴极引线至对应的电源输出端。
⑥转膜装置置于冰水中，打开电源200 mA 2小时。
⑦转移完成后，从槽中取出转移夹。
⑧用镊子小心打开转移叠层。
⑨在双蒸水中漂洗膜。
3．蛋白质显像
蛋白质显像的一个最主要的目的是验证蛋白质是否转移到膜上。染色是显示印迹膜上蛋白质的最简单方法。丽春红S印迹膜染色法：
丽春红S适用于酸性水溶液，染色但是不持久，在后续的处理中红色染料易被洗去，由于与蛋白质的结合是可逆性的，该染色方法适用于所有显示抗原的技术，丽春红S带负电荷，可以与带正电贺的氨基酸残基结合，同时丽春红也可以与蛋白的非极性区相结合，从而形成红色条带.
①将膜置于反应盒中（印迹蛋白的一面朝上）
②加0.5 ml丽春红S染色10秒，观察转印效果。
③去除染液，双蒸水洗膜两次，每次5分钟。
封闭是为了避免抗体与膜的非特异结合。用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点可以降低抗体的非特异性结合。封闭剂应该封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白、也不与抗体或检测试剂有交叉反应。最常见的封闭剂是BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶和Tween-20（0.05 - 0.1%）稀溶液。Tween-20有复性抗原的作用，可提高特异性的识别能力。封闭剂通常溶于适当的缓冲液中，如PBS或TBS。
1) 洗转印膜：室温漂洗3次x10min，以尽量洗去转印膜上的SDS，防止影响后面的抗体结合。
2) 取漂洗的转印膜，放入封闭液内，摇床震动，室温封闭1h，也可在4℃过夜。
3) 用1×TBS-T ，PH7.6洗液，室温漂洗3次x10min。
5．抗体杂交
①以封闭液适当稀释HRP标记的抗体，加入膜上，室温1小时或4℃过夜振荡孵育。
②洗膜液洗膜3 - 5次（每次3 - 5分钟）。
6．加底物显色。
根据标记Ab2的标记物不同，其杂交的结果检测方法也不同，较常用的检测系统有HRP标记 Ab2的DAB检测系统。
①DAB显色液的配制:按照1mlH2O加显色剂A，B，C各1滴，混匀，需配20ml。
②显色:将适量DAB显色液平铺在Ab2杂交后的印迹膜上，室温放置观察，可出现明显的棕褐色蛋白显色带。
③终止：用水漂洗杂交膜即可终止反应。
注意事项：
1． 免疫印迹杂交的敏感与检测系统有关。因此，凝胶电泳时的蛋白上样量应该保证被检测抗原量不至于太低。
2． 形成凝胶的试剂要有足够的纯度，激活剂的浓度适当，不仅可以决定凝胶聚合的速度，也将影响凝胶的质量，聚胶时的温度也将影响凝胶聚合的速度。因此，建议要根据不同温度下适量增减激活剂的用量以保证分离胶从加入激活剂起至开始出现凝胶凝聚的时间为15-20分钟最佳，对于浓缩胶最佳聚合时间为8-10分钟开始可见聚合。灌完分离胶加水封闭分离胶与外界氧气的结合。
3． 未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性，操作时应该戴手套防护。梳子插入浓缩胶时，应确保没有气泡，可将梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生，梳子拔出来时应该小心，不要破坏加样孔。
4． 电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的气和未聚合的丙烯酰胺，同时建议低电压短时间的预电泳，清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通(恒压10-20V，20-30min)。
5． 加样前样品应先离心，尤其是长时间放置的样品，以减少蛋白质带的拖尾现象。
6． 为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液。
7． 样品缓冲液中煮沸的样品可在-20℃存放数天，但是反复冻融会使蛋白质降解。
8． 为减少蛋白质条带的扩散，上样后应尽快进行电泳，电泳结束后也应直接转印。
9． 上样时，小心不要使样品溢出而污染相临加样孔。
10． 取出凝胶后应注意分清上下，可用刀片切去凝胶的一角作为标记(如左上角)转膜时也应用同样的方法对NC膜做上标记(如左上角)以分清正反面和上下关系。
11． 转膜时应依次放好NC膜与凝胶所对应的电极，即凝胶对应负极，NC膜对应正极。
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零值混合血清和生理盐水对PSA高浓度稀释的影响
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&&近年来,老龄男性前列腺癌肿发病率升高。临床对PSA〉150ng／mL的高浓度样品,需要作稀释后再复检以便提高诊断的可靠性。本文探讨用生理盐水及女性PSA零值混合血清作稀释介质,分别对同一高值PSA样品倍比稀释测定并作回收率试验及胶体稳定试验。现报道如下。
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