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TGF-β1和Smad4及Smad7基因在体外培养的小鼠原代肾小管上皮细胞中表达情况的检测大鼠近端肾小管上皮细胞的原代培养和鉴定_图文-学网-中国IT综合门户网站-提供健康,养生,留学,移民,创业,汽车等信息
大鼠近端肾小管上皮细胞的原代培养和鉴定_图文
来源：互联网 发表时间： 1:53:17 责任编辑：王亮字体：
白细胞发挥毒性作用的重要条件＂】。研究发现，心肌缺血再灌注损伤中ＩＣＡＭ．１明显升高，且与心肌损伤一致哺ｏ；本实验中，模型组１ＣＡＭ一１ｍＲＮＡ量明显高于对照组，且与ＭＰＯ、ＭＤＡ和血清中ＣＫ活性变化一致。
ＩＣＡＭ一１介导的炎症反应在心肌缺血再灌注损伤中的作用越来越受到关注，寻找新的方法预防这种炎症反应以减轻心肌缺血再灌注损伤是目前的研究热点。本实验通过观察葛根素对白细胞浸润、自由基产生、心肌损伤程度和ＩＣＡＭ一１ｍＲＮＡ含量的影响研究葛根素对心肌缺血再灌注的保护作用，表明葛根素有减轻白细胞和内皮细胞的黏附作用，减少自由基产生，从而减轻心肌缺血再灌注中的炎症反应，达到保护心肌的作用。
３潘洪平．葛根总黄酮和葛根素的药理作用和临床应用研究进展
（Ｊ】．广西医学，２００３；２５（１０）：１９４１－４．
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ＺｉｅｇｅｌｓｔｅｉｎＲＣ，ＨｅＣ，ＨｕｐｅｎｄｅｎｔｌＣＡＭ―ｌ
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ｔｒｍ妣吖ａｎｄ
ｌｉｎｔｅｒａｃｔ
ａｃｔｉｖａｔｏｒ
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《ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ３【却ＩＩａ］ａｎｄ
ｒｅｄｕｃｉｎｇｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ－
ｕｐｒｃｇａｌａｔｅ
ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ―ｌ
ｖａｓｃｕｌａｒ
ｉｓｃｈｅｍｉｅ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｅｄｍｙｅｃａｒｄｉｕｍａｎｄ
ｉｎｊｕｒｙｄｕｒｉｎｇｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪＥｘｔｒａ
ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ（Ｊ］．ＡｒｔｅｒｉｅｓｃｌｅｒＴｈｒｃｍｂＶａｓｅＢｉｏｌ，２００５；２５（７）：
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ＭＢ，甜以Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅａｎｄｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌ
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ＪｏｎｅｓＳＰ．ＴｒｏｃｈａＳＤ。Ｓｔｒａｎｇｅａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅｓｉｎ
［２００９－０６－２９收稿２００９４）９．１４修回］
ｃｈｒｏｎｉｃｍｕｆｉｎｅｍｏｄｅｌｏｆｍｙｏｃａｒｄｉａｌｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ
（编辑袁左鸣）
ｉｎｊｕｒｙ［Ｊ］．ＡｍＪＰｈｙｓｉｏｌＨｅａｒｔＣｌｒｃ
Ｐｈｙｓｉｏｌ，２０００；２７９（５）：２１９６－２０１．
大鼠近端肾小管上皮细胞的原代培养和鉴定
陈爽张丽红范颖石英爱孙华君刘晓会吴珊
（吉林大学白求恩医学院病理生物学教育部重点实验室，吉林长春１３００２１）
目的建立较好的大鼠近端肾小管上皮细胞原代培养模型。方法无菌取Ｗｉｓｔａｒ大鼠肾脏，取皮质剪碎，经Ｉ型胶原酶消化和
４５％Ｐｅｒｃｏｌｌ连续密度梯度离心进行纯化，用含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ／Ｆ１２堵养基原代培养并传代，观察细胞形态并以免疫细胞化学染色及酶化学染色鉴定。结果培养４－５ｄ细胞融合成单层，呈典型的鹅卵石样，细胞角蛋白１８及碱性磷酸酶染色均呈阳性，细胞可传２―３代。结论此法可在短期获得数量较多、重复性好的近端肾小管上皮细胞，为体外研究肾小管细胞的病变提供了实验平台。
［关键词］近端肾小管上皮细胞；原代培养；大鼠［中图分类号】Ｒ３２２．６１
（文献标识码】Ａ
［文章编号）１００５－９２０２（２０１０Ｊ０３－０３３４－０３
Ｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒａｔｒｅｎａｌｐｒｏｘｉｍａｌｔｕｂｕｌｅｃｅｌｌｓ
ＷＡＮＧＧｕａｎｇ－Ｌａｎ，ＣＨＥＮＳｈｎａｎｇ，ＺＨＡＮＧＬｉ?Ｈｏｎｇ，ｅｔ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＰａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ，ＭｂｌｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＪＨｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００２１，Ｊｔｎｎ，Ｃｈｉｎａ
ｔｕｂｕｌｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ（ＰｒＣ８）．Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｗｉｓｔａｒｒａｔｓｋｉｄｎｅｙｗｅｒｅｓｔｅｒｉｌｅｔａｋｅｎｏｕｔ．ｔｈｅｎｔｈｅｃｏｒｔｅｘｗａｓｓｅｐａｒａｔｅｄａｎｄｓｈｒｅｄｄｅｄ．ｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙｅｏｌｌａｇｅｎａｓｅＩｄｉｇｅｓｔｉｏｎａｎｄ４５％ｐｅｒｃｏｌｌｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｄｅｎｓｉｔｙｇｒａｄｉｅｎｔｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ．ｃｕｌｔｕｒｅｄａｎｄｐａｓｓａｇｅｄｂｙＤＭＥｌ彤Ｆ１２ｍｅｄｉｕｍｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄｗｉｔｈ１０％ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ．ｉ－
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ
Ｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈｔｈｅｂｅｔｔｅｒｍｏｄｅｌ
ｆｏｒ埘ｍａｒｙ
ｃｕｌｔｕｒｅｏｆｒａｔ
ｐｒｏｘｉｍａｌ
ｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ。ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｓｔａｉｎｉｎｇａｎｄｅｎｚｙｍｅｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｒｅｓｕｌｔｓｇｔｅｌａｙｅｒｃｏｕｌｄｂｅ
Ａｆｔｅｒ４ｔｏ５
ｄａｙｓ，ｔｈｅｅｅＨｓ
ｗｅｒｅｉｎｏｓｃｕｌａｔｅｄｉｎｔｏ
ｓｈｏｗｅｄｔｈｅｔｙｐｉｃａｌｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ－ｌｉｋｅ
ａｐｐｅａｒａｎｃｅ．ｎｅ
ｅｙｔｏｋｅｒａｔｉｎｌ８ａｎｄａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓｔａｉｎｉｎｇ
ｐｏｓｉｔｉｖｅ．ｔｈｅｃｅｌｌｓ
ｐａｓｓｅｄ２～３ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ
Ｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄ
ｙｉｅｌｄｌａｒｇｅｑｕａｎｔｉｔｙａｎｄｇｏｏｄｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙＰｒＣＳｉｎｓｈｏｒｔｔｅｒｍ．ｔｈｏｓｅｅｅＵｓ
ｐｒｏｖｉｄｅ
ｐｌａｔｆｏｒｍ
【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｐｒｏｘｉｍａｌｔｕｂｕｌｅ
ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
ｆｏｒｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅＨｓ；Ｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｒｕｅ；Ｒａｔ
ｌｅｓｉｏｎｓ．
肾脏纤维化是多种肾脏疾病发展至肾衰竭终末期的共同表现，肌成纤维细胞在此过程中发挥重要作用。目前，肾小管上皮细胞向间充质细胞转分化是纤维化过程中成纤维细胞和
基金项目：教育郁高校优秀青年教师奖励计划（２０１１８２）；吉林省卫生厅
重点实验室基金（２００６）
通讯作者：吴珊（１９６２?），女，教授，博士生导师．主要研究肾脏病理学。第一作者：王光兰（１９８１．），女，在读博士，主要从事肾脏病理学研究。
肌成纤维细胞的来源之一…。因此，建立良好的近端肾小管上皮细胞的体外培养模型，对于肾小管上皮细胞疾病的研究十分重要，本实验旨在探讨大鼠近端肾小管上皮细胞的原代培养和鉴定的方法。
万方数据　
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【求助】关于F12对原代肾小管上皮细胞提取中的作用
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这个帖子发布于2年零94天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
最近培养小鼠原代肾小管上皮细胞，我按照下面方法操作：1.禁食12h，不禁水。2.小鼠四只颈椎脱臼处死，浸入75%酒精5min，通风橱取肾后置于冰上冷PBS内去肾蒂及包膜后置于80目不锈钢网筛上3.剪碎充分研磨后用无血清F12充分冲洗4.滤液经160目不锈钢网滤过经F12充分冲洗并收集网上肾小管节段5.充分吹吸后，转入离心管中。1000r/min离心5min。6.离心后弃去上清，加0.05%胰酶+EDTA
2ml,37℃消化。7.每3min振荡1次，20min后加等体积含有10％FBS的F12培养液终止消化。8.1 000r/min离心5min。9.弃上清，加含有10%血清的F12充分混匀后，移至培养皿中培养(37℃、5％CO2)。10.72h首换液，以后每2d换液1次。我在前期练习及预实验阶段曾经有过一次原代状态极好，两天就有大量小管节段贴壁，随后细胞长得很好的经历，以后重复试验时就再也没有过类似的情况，昨晚再次提取原代，为节省培养基用PBS冲洗、收集小管节段，消化20min后发现细胞团块仍然较大并较蓬松，终止消化离心后细胞团块较大、蓬松，倾倒消化液时易随液体流下，再用完全培养基吹吸混匀后镜下观察到多量小管节段并较多大团块小管节段，与我状态最好的那次最相像。后来PBS不够，又用F12冲洗+收集小管节段，仍然消化20分钟后离心只剩下管底一小点细胞，种于瓶中观察发现小管节段很少，跟之前近似失败的培养很类似。再次提取时，将消化时间改为8分钟后，结果只比F12+20min好一点，跟PBS+20min没法比。我之前练习只有一次使用PBS+20min，估计那一次就是原代状态最好的一次，之前用F12+20min及这次的F12+8min效果都不佳——至少从得到的小管节段多寡来看。因此我想，是否F12能够促进胰酶的消化作用呢？我查找了一些中文资料，用生理盐水/PBS/培养基的都有，到底这些选择的理由是什么？有没有高手能解答？谢谢！
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组织消化的时候，只用胰酶可以吗？可能要先用胶原酶、分散酶消化比较好，另外我们在处理的时候用的是0.25%的胰酶；还有就是培养基，只用F12可以吗，况且血清浓度也太高了吧，上皮生长可是一般要求无血清或者血清含量低点比较好
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清风漱叶 最近培养小鼠原代肾小管上皮细胞，我按照下面方法操作：1.禁食12h，不禁水。2.小鼠四只颈椎脱臼处死，浸入75%酒精5min，通风橱取肾后置于冰上冷PBS内去肾蒂及包膜后置于80目不锈钢网筛上3.剪碎充分研磨后用无血清F12充分冲洗4.滤液经160目不锈钢网滤过经F12充分冲洗并收集网上肾小管节段5.充分吹吸后，转入离心管中。1000r/min离心5min。6.离心后弃去上清，加0.05%胰酶+EDTA
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【求助】我养小鼠肾小管上皮细胞中遇到的几个问题
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这个帖子发布于8年零75天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
各位同志，我这段时间正急于养出肾小管上皮细胞，但在培养的过程中，遇到几个问题，请大家帮帮忙，指点指点
1、怎么样把肾皮质从肾上面机械分离得比较纯。我试过用剪刀剪，用镊子小块小块的夹，不知道你们是用的什么方法。
2、怎么样在80目上研磨。我用的是注射器的内芯在80目上研磨的，一直研磨到网筛上不见组织块，基本能用缓冲液冲洗到培养皿里面
3、怎么样从100目上把组织转移到离心管里面。100目上的组织又小又少，我先把它冲到培养皿里，再移到离心管里面，往往只剩一点点东西在里面。太少了，不知道大家是怎么转移的？
4、我用的胶原酶1消化的，买回来的酶是粉剂，我用PBS配的，看说明书上说要用HBSS配，不知道我是否是配错了，反正每次笑话出来极差。
5、另外，我用的PBS来冲洗组织，不知道是不是用错了。是用基础培养基好还是用HBSS好。
:?):?):?):?):)很急，请大家帮帮我！
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我在细胞培养课上问过一位老师，她说肾细胞对离子较敏感，推荐我用含钙镁的Hank‘s液代替PBS处理细胞，即各位所说的HBSS，不过我养的是成品的细胞系，不知跟原代细胞会不会有所不同。另外我看到的说法是钙镁离子可以促进贴壁的，而EDTA是钙镁离子螯合剂，所以会影响贴壁。个人愚见，说的不对的地方请指正哈。
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4、我用的胶原酶1消化的，买回来的酶是粉剂，我用PBS配的，看说明书上说要用HBSS配，不知道我是否是配错了，反正每次笑话出来极差。胶原酶用Hanks配制好，因其中所含的钙离子可使其消化能力增强，钙离子的存在可维持胶原酶的稳定性和消化活性.吕志芬 wrote: 另外，我用的PBS来冲洗组织，不知道是不是用错了。是用基础培养基好还是用HBSS好。用PBS冲洗组织没问题。
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谢谢。我下周用HBSS配一下胶原酶，看看能不能有所改观。呵呵，没办法了
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我也在养肾小管上皮呢，没有成功，大家共同努力哦。我也是用剪刀剪得。
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我现在养媳肾小管上皮细胞的方法已经很成熟了。就是差一步，细胞养出来不纯，原代培养的时候肾小管上皮细胞可以说占了70-80%，可是一传代，细胞就有些不对头了，唉，闯过一关又一关，哪位有好的细胞提纯的方法指导一下
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我养的是大鼠的肾小管上皮细胞，我也发现传代后细胞和原代2~3天的细胞形态不同，我原代和传代都用0.25%的胰酶，传代后贴壁少，细胞胞质稀薄，细胞铺展很大，像纸一样贴在瓶底，希望同道高手指教啊！
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我也养的是大鼠肾小管上皮细胞，传代之前很好，可是传代之后大都没有贴壁，我用的是0.25%胰酶—0.02%EDTA,有人说EDTA 影响贴壁，不知是否如此。
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看来大家现在遇到的都是细胞传代的问题，我的细胞第一是有少量杂细胞夹杂，二是传代后肾小管上皮细胞不贴壁，反而杂细胞贴壁长的满满的。假如有哪位同志先解决了这些问题，与我交流下，唉，急啊！逼得我心慌!本人手机
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我在细胞培养课上问过一位老师，她说肾细胞对离子较敏感，推荐我用含钙镁的Hank‘s液代替PBS处理细胞，即各位所说的HBSS，不过我养的是成品的细胞系，不知跟原代细胞会不会有所不同。另外我看到的说法是钙镁离子可以促进贴壁的，而EDTA是钙镁离子螯合剂，所以会影响贴壁。个人愚见，说的不对的地方请指正哈。
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有没有谁做过滑膜的WB.我不知道怎么去提它的蛋白
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标记下，马上进入研究
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我最近在提小鼠的肾小管上皮细胞，总能提完后总能贴壁，但因为消化不下来，传不下去。我在25cm培养瓶里陪了1%明胶，细胞基本要长一个星期左右才能长满，但我发现细胞好像都已经陷进明胶里，用0.25%胰酶预消化加37度消化7-10分钟都基本不下来，拍了也没有用。兄弟姐妹们有没有遇到这样的问题呀？？大家铺明胶吗？还是鼠尾胶原？浓度是多少呢？急救！！
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请教一下,我是使用以下方法分离RTEC1.小鼠实验前12h禁食，自由进水。2.颈椎脱臼处死后无菌取肾，去肾蒂及包膜后置于80目不锈钢网筛上3.剪碎，研磨后用培养液充分冲洗，收集液体4.经150目不锈钢网筛冲洗并收集网上肾小管节段5.充分吹吸后，装于离心管中。800r/min离心5min。6.离心后弃去上清，加1ml 1g/L胶原酶I消化培养,37℃消化。7.每隔3min振荡1次，20min后加等体积含有5％FBS的DMEM/12培养液终止消化．吹吸后静置5min 。8.胎盘兰计数。9.1 000r/min离心5min。10.小心弃上清，加含有5％FBS的DMEM/F12充分混匀后，移至培养皿中培养(37℃、5％COs)。6. 48h首次换液，以后每2d换液1次。但是效果不好,请问哪里可以改进
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loveteenie 请教一下,我是使用以下方法分离RTEC1.小鼠实验前12h禁食，自由进水。2.颈椎脱臼处死后无菌取肾，去肾蒂及包膜后置于80目不锈钢网筛上3.剪碎，研磨后用培养液充分冲洗，收集液体4.经150目不锈钢网筛冲洗并收集网上肾小管节段5.充分吹吸后，装于离心管中。800r/min离心5min。6.离心后弃去上清，加1ml 1g/L胶原酶I消化培养,37℃消化。7.每隔3min振荡1次，20min后加等体积含有5％FBS的DMEM/12培养液终止消化．吹吸后静置5min 。8.胎盘兰计数。9.1 000r/min离心5min。10.小心弃上清，加含有5％FBS的DMEM/F12充分混匀后，移至培养皿中培养(37℃、5％COs)。6. 48h首次换液，以后每2d换液1次。但是效果不好,请问哪里可以改进 请问您现在原代做的怎么样啦
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syngejane 我在细胞培养课上问过一位老师，她说肾细胞对离子较敏感，推荐我用含钙镁的Hank‘s液代替PBS处理细胞，即各位所说的HBSS，不过我养的是成品的细胞系，不知跟原代细胞会不会有所不同。另外我看到的说法是钙镁离子可以促进贴壁的，而EDTA是钙镁离子螯合剂，所以会影响贴壁。个人愚见，说的不对的地方请指正哈。能分享做肾小管上皮细胞的资料吗 求助
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