双酶切buffer的选择（MBI、罗氏、NEB、Promega、Takar
要保证双酶切实验的高效、准确，就要选择合适的通用buffer。这样就能避免质粒和基因没有切动或者被切散。常用的几家内切酶公司有MBI、NEB、Promega、Roche、Takara，要双酶切体系的通用buffer，最好到出品该内切酶的公司网站上。下面就提供了这几家公司的查询网址。
Fermentas（MBI）双酶切反应体系中buffer的选择可以在其网站上查看：
Promega公司的限制性内切酶双酶切通用buffer的选择，可以参考promega网站。
Roche公司的限制性内切酶当然是最好的了，跟罗氏的地位也是相称的，查看：
该网页上refinder的运行需要安装Java程序，不过，真的还是很有用也很方便。
Takara公司的限制性内切酶效果同样非常好，该公司产品双酶切时通用buffer的参考资料：
如果打不开网页，可以下载下面这个word文档，其中包含了所需的信息。
NEB公司的酶双酶切buffer
则可以在下面这个网页在线查询：
或者也可以自己参考下面这个表来选择：
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这里再给大家推荐一种新的不需要连接反应的分子克隆方法，优点包括：
①设计引物不必考虑选择什么酶切位点；
②不必考虑保护碱基的问题；
③不必每次都选择合适的酶来酶切质粒制备载体；
④而且不需要DNA连接酶；
⑤假阳性几率低（因为没有连接反应这一步，载体自连的问题没有了）。
另外，还有一个经济问题：如果一次性制备一批载体（小提一次质粒约80μL），并将之线性化（可双酶切亦可单酶切），然后每次做分子克隆实验时用一点，大约可以做约40次转化，管上一年没问题，呵呵。
可能对你有帮助的关于保护碱基选择的有关日志，请参考：
与蛋白质操作过程中的注意事项相关的日志：（Redondo推荐）
其他与PCR操作相关的日志：
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PCR-双酶切鉴定STGC3抑癌基因重组子假阳性研究连接转化假阳性提不出来质粒吗？ - 实验交流 - 生物秀
标题: 连接转化假阳性提不出来质粒吗？
摘要: [连接转化假阳性提不出来质粒吗？] 我做连接转化两个月了，还没出结果，心情相当之郁闷！请教大家几个问题： 1、100ul大体系酶切，酶加2ul够吗？我没有直接这样加过，一直是按照20ul的体系，质粒10ul，酶各1ul，10×buffer 2ul，补水到20ul。然后按这个比例扩大5倍，即100ul体系，酶切3h。但是还是酶切不完全 关键词:[质粒 酶切 载体 假阳性 胶回收 双酶切 拷贝]……
我做连接转化两个月了，还没出结果，心情相当之郁闷！请教大家几个问题：
1、100ul大体系酶切，酶加2ul够吗？我没有直接这样加过，一直是按照20ul的体系，质粒10ul，酶各1ul，10×buffer 2ul，补水到20ul。然后按这个比例扩大5倍，即100ul体系，酶切3h。但是还是酶切不完全，会出现三条带，再胶回收目的片段后浓度更低了，通常只有10ng/ul左右。
2、我的载体两个酶切位点之间只有6个碱基，用的是宝生物的Kpn 1和Xba 1，同时进行双酶切。两个酶都做过单酶切对照，都能完全切成线性载体。所以我就直接拿双酶切载体进行连接了。
3、连接采用的10ul体系：目的片段1755bp，载体2548bp，按照3:1的比例加，宝生物T4连接酶1ul，buffer 1ul。连接后取5ul电转50ul感受态。结果5个板子只有一个长菌了。挑了80多个样PCR全部阴性。但是菌落变黄显示的是阳性结果，看来全是假阳性了。由于菌株时阳性菌，我怕PCR前面预热时间短没有把细菌壁破掉，所以又重新提质粒检测了下，结果质粒也没有。如果是假阳性，载体没有切完全，或者是载体发生自连了，那质粒应该能提出来吧？
4、对照组，我直接转的空质粒，提质粒后发现是正确的。直接转的连接产物，就全是假阳性，也提不出来质粒。
5、T4连接酶用时是在冰上操作，T4 buffer用分装吗？每次都必须在冰上融化完全才能加？
6、连接时能直接用T载体中的solution I 吗？
实验室没人做过这些，所以很是苦恼，希望大家给予帮助，先感谢！回复1，酶切反应：质粒要定量。根据质粒的量加酶，说明书上有使用比例，双酶切后胶回收，。回收的大小要了解。
2，连接：按照mol比，载体和插入片段比为1：10。。建议载体0.03pmol ，插入片段0.3pmol。。16度过夜。
每一步都定量做，成功的概率高回复酶切效果是与底物的量（质粒的μg数）及酶的活力（U）有关的，不能只考虑质粒体积建立酶切体系。你先把提好的质粒定量后做酶切，可以用小体积电泳检测酶切效果。一般是确认酶切完全后再做胶回收的。
如果提不出来质粒，可能是污染了杂菌或者是筛选抗生素(antibiotic)的浓度不够。
两个酶切位点之间相差6个碱基已经不少了，应该不太影响效率，可以完全切开的。酶切后的载体最好也做胶回收。
T4连接酶一般16度过夜比较好。buffer一般不分装，当然分装会比较好。buffer需要完全融化后才能使用，一般是在室温下才能完全溶解的。融化后放在冰上操作。
连接时可以用T载体的solution I。回复不谢，祝好:work:实验顺利回复
多谢多谢！！！！
1、一般胶回收目的片段时做的双酶切，肯定是越多回收的片段浓度才会越高。一般都用多大体系双酶切呢？我的质粒一般是50ng/ul左右。。按照宝生物的说明书，20ul体系 1 ul 的酶可以切1ug DNA，那 ... 1. 根据你的质粒浓度，的确量不是很多。但存储质粒的缓冲液里有少量EDTA，如果质粒用的体积大了会抑制后面的酶切作用，如果质粒纯度不高，问题就更大了。根据个人经验，一般高拷贝质粒提出来的浓度都有几百ng/μl。
2. 可能与你的筛选培养基有关，我不清楚乳糖筛选是否非常严格。
3. 虽然是这么说，不过我们实验室的buffer是不分装了，N多人都用，也没见有什么问题。如果你怕出问题就分装成小管。
4. 克隆时连接一般很少出问题，T4或者solution I都应该可以的。连接体系一般是10μl或者20μl。回复
1. 根据你的质粒浓度，的确量不是很多。但存储质粒的缓冲液里有少量EDTA，如果质粒用的体积大了会抑制后面的酶切作用，如果质粒纯度不高，问题就更大了。根据个人经验，一般高拷贝质粒提出来的浓度都有几百ng/μl。 ... 我的是T克隆扩增的质粒，感受态时DH5α，质粒是PMD-19，应该也是高拷贝呀，过夜培养将近16个小时以后，取的10ml菌液来提的。用的天根盒。难道盒出问题？
我是要连接表达载体，连接感觉挺难的。你们一般各组分比例怎么加？回复
我的是T克隆扩增的质粒，感受态时DH5α，质粒是PMD-19，应该也是高拷贝呀，过夜培养将近16个小时以后，取的10ml菌液来提的。用的天根试剂盒。难道试剂盒出问题？
我是要连接表达载体，连接感觉挺难的。你们一般 ... 我觉得你用的菌太多了吧，高拷贝质粒一般用2-3ml菌液提就行了。用盒子提出来的质粒的质和量一般还是有保证的。
连接也没什么难的，控制也不用特别严格。如果前面酶切回收做得好的话这一步不需要怎么担心的。一般就是10Xbuffer 2μl, T4 ligase 1μl, 载体片段50ng, 目的片段按照摩尔比3:1加（很小的片段按照10:1），用水补足体积到20μl。16°C过夜。
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官方微信号：shengwuxiu
电话：021-产品名称: Hieff Clone™
Multi One Step Cloning Kit多片段一步法（快速/无缝）克隆试剂盒
Hieff CloneTM Multi One Step Cloning Kit是一款简单、快速、高效的多片段DNA定向克隆产品，该试剂盒可以将PCR产物定向克隆至任意载体的任意位点。将载体在克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR引物5&端引入线性化克隆载体末端序列，使得插入片段PCR产物5&和3&最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列 (15 bp～20 bp)。将这种两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化克隆载体按一定比例混合，在重组酶Exnase的催化下，仅需反应30 min即可进行转化，完成定向克隆。克隆阳性率可达95%以上。克隆载体酶切产物或PCR产物和插入片段PCR产物可以不进行DNA纯化直接用于重组克隆，极大的简化了实验步骤。
试剂盒中包含有针对多片段重组反应而优化的反应缓冲液和重组酶 。使用该试剂盒，可以一次实现多至5个片段的顺序拼接克隆。Exnase MultiS还兼容常规酶切、PCR反应体系。
wet ice-20 &C
实验流程概览
1)线性化克隆载体制备；
2)插入片段扩增引物设计；
3)插入片段PCR扩增；
4)进行重组反应；
5)反应产物转化、涂板；
6)克隆鉴定。
插入片段PCR扩增时，引物5&端添加同源重组序列&(图中以蓝色、紫色、茶色和橙色标记)，使得扩增产物之间以及扩增产物与线性化克隆载体之间都具有能够相互同源重组的一致序列。
1.制备线性化克隆载体
选择合适的克隆位点，并对克隆载体进行线性化。推荐您尽量选择无重复序列且GC含量均匀的区域进行克隆。当载体克隆位点上下游20 bp区域内GC含量均在40%～60%范围之内时，重组效率将达到最大。
线性化载体可通过限制性内切酶酶切（单酶切或双酶切）或反向PCR扩增获得。
A&酶切制备线性化克隆载体
双酶切线性化：线性化完全，转化背景&(假阳性克隆)&低。推荐使用。
单酶切线性化：线性化程度较差。可适当延长酶切时间以降低转化背景。
注：1）Hieff CloneTM&MultiS重组反应体系内无DNA连接酶，不会发生载体自连反应。因此，即使是以单酶切方式制备的线性化载体也无需进行末端脱磷酸处理。重组产物转化后出现的假阳性克隆&(无插入片段)&是由未线性化环状载体转化而形成的。如这种假阳性克隆比例较高，应重新制备线性化克隆载体。
2）Hieff CloneTM&MultiS重组反应体系兼容几乎所有的酶切反应体系。克隆载体酶切产物加热失活内切酶(参见内切酶使用说明书，例如Hind III，65℃孵育20 min完全失活)后可直接用于重组反应。
B&反向PCR扩增制备线性化克隆载体
推荐您使用高保真聚合酶进行载体扩增&(HieffTM&Pfu DNA Polymerase，&Cat No. 10113ES60)&以减少扩增突变的引入。PCR扩增模板应尽量使用预线性化质粒，以防止残留环状质粒模板对克隆阳性率的影响。
Hieff CloneTM&MultiS重组反应体系兼容常规PCR反应体系。因此，如扩增模板为预线性化质粒且PCR产物电泳条带单一，扩增产物可以无需纯化直接用于重组反应。
克隆载体酶切产物或PCR&扩增产物DNA&纯度较低且有可能含有未线性化环状质粒，直接使用进行重组反应时，重组效率、克隆阳性率都会有所降低。因此，在进行较大片段(&5kb)&克隆时，我们推荐您使用高质量的试剂盒对线性化克隆载体进行胶回收纯化，以提高DNA&纯度并去除一部分未线性化的环状载体&(其电泳位置不同于线性化克隆载体)。不同方式制备的线性化克隆载体的使用方式可查阅表一。
表一：线性化克隆载体的使用方式
线性化载体制备方式
快速实验方案
最佳实验方案
酶切消化制备
加入失活内切酶后直接使用
DpnI消化后直接使用（降解扩增模板）
胶回收或DpnI消化后胶回收
预线性化质粒、基因组、cDNA
有明显非特异性扩增
注：直接使用酶切产物或扩增产物进行重组反应时，使用体积不应超过4&l（重组反应总体积的1/5）
2.制备PCR产物
2.1设计扩增引物
Hieff CloneTM&MultiS引物设计总的原则是：通过在引物5&端引入线性化克隆载体末端同源序列，使得插入片段扩增产物&和3&最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列&(15 bp～20 bp)。
首先设计第一片段的正向扩增引物和第三片段的反向扩增引物(与载体相邻的两个插入片段)。
5&&&上游载体末端同源序列+第一片段基因特异性正向扩增序列&&3&
第三片段反向扩增引物设计方式：
3&&&第三片段基因特异性反向扩增序列+下游载体末端同源序列&&5&
基因特异性正/反向扩增序列即常规插入片段正/反向扩增引物序列；
上游/下游载体末端同源序列为线性化克隆载体最末端序列（用于同源重组）。
以pUC18作为克隆载体、进行三插入片段顺序拼接克隆（5&至3&按克隆顺序依次为：第一片段、第二片段、第三片段）为例，引物设计方案如图二所示。
图二：重组引物设计方案
注：如最终引物长度超过40bp，我们推荐您在引物合成时选用PAGE纯化，可提高克隆成功率。计算扩增引物退火温度时，只需计算基因特异性扩增序列的Tm值，载体末端同源序列不应参与计算。
其次设计第一片段的反向扩增引物和第二片段的正向扩增引物。用于片段之间进行重组的同源序列可以添加至前方片段的反向扩增引物中，也可以添加至后方片段的正向扩增引物中，还可以两片段各添加一部分。以将同源序列添加至前方片段&(第一片段)的反向扩增引物中为例，引物具体设计方案如图三所示：
第一片段正向扩增引物设计方式：
3&&&第一片段基因特异性反向扩增序列+第二片段5&端同源序列&&&
第二片段正向扩增引物设计方式：
5&&&第二片段基因特异性正向扩增序列&&3&
基因特异性正/反向扩增序列即常规插入片段正/反向扩增引物序列；第二片段5&端同源序列即用于第一片段与第二片段进行重组的添加序列。最后设计第二片段的反向扩增引物和第三片段的正反向扩增引物。设计方式与第一片段的反向扩增引物和第二片段的正向扩增引物设计方式一致。
2.2&插入片段PCR扩增
插入片段可用任意PCR酶&(Taq酶或高保真酶)&扩增，无需考虑产物末端有无A加尾&(重组过程中将被去除，在最终载体中不会出现)。我们推荐您使用高保真聚合酶进行扩增，&Cat No. 10113ES60)，以减少扩增突变的引入。
PCR结束后，取少量产物进行琼脂糖电泳以检验扩增产量和特异性。Hieff CloneTM&MultiS重组反应体系兼容常规PCR反应体系。因此，如扩增模板不是与克隆载体抗性相同的环状质粒，且PCR产物电泳条带单一，扩增产物可以无需纯化直接用于重组反应。
PCR扩增产物DNA纯度较低，直接使用进行重组反应时，重组效率、克隆阳性率都会有所降低。因此，在进行较大片段(&5 kb)&克隆实验时，我们推荐您使用高质量的试剂盒对扩增产物进行胶回收纯化以提高DNA纯度。插入片段扩增产物的使用方式可查阅表二。
表二：扩增产物推荐使用方式
PCR扩增情况
PCR模板类型
快速实验方案
最佳实验方案
与克隆载体抗性相同的环状质粒
DpnI消化后直接使用*
胶回收或DpnI消化后胶回收
预线性化质粒、基因组、cDNA
有明显非特异性扩增
注：直接使用扩增产物进行重组反应时，使用体积不应超过4&l（重组反应总体积的1/5）
*当线性化克隆载体为酶切制备时，插入片段扩增产物经DpnI消化结束后应置于85℃加热20 min将DpnI&失活，以避免重组反应时残留DpnI&对克隆载体的降解。
3.重组反应
3.1&配制反应体系
于冰水浴中配制如下反应体系。如果不慎将液体粘在管壁，可通过短暂离心使其沉入管底。
Up to 20 &l
5&CE&Buffer
线性化克隆载体
插入片度扩增产物
Exnase MultiS
Hieff CloneTM&MultiS重组反应体系最适DNA使用量为每片段（包括线性化克隆载体）0.03 pmol。该摩尔数对应的DNA质量可由以下公式粗略计算获得：
每片段最适使用量&= [0.02&克隆载体碱基对数]ng (0.03 pmol)
例如，将长度为0.5、1kb、2 kb三插入片段克隆至长度为5 kb的克隆载体时，各片段最适使用量应为：线性化克隆载体最适使用量：0.02 & 5000 = 100 ng
0.5 kb插入片段最适使用量应为：0.02 & 500 = 10 ng
1 kb插入片段最适使用量应为：0.02 & 1000 = 20 ng
2 kb插入片段最适使用量应为：0.02 & 2000 = 40 ng
注：1.&线性化克隆载体的使用量应在50～200 ng之间。当使用上述公式计算DNA最适使用量超出这个范围时，直接选择最低/最高使用量即可。
2.&插入片段DNA使用量应大于10 ng。当使用上述公式计算DNA最适使用量低于这个值时，直接使用10 ng即可。
3.&线性化克隆载体和插入片段扩增产物不进行DNA纯化直接使用时，加入总体积应不超过反应体系体积的1/5，即4 &l。
4.&试剂盒中提供pUC19 control vector, linearized (50 ng/&l)和Control insert Mix (0.5 kb, 10 ng/&l; 1 kb, 20 ng/&l; 2 kb, 40 ng/&l)各5 &l，需要时可进行阳性对照反应，每次反应各加1 &l。
3.2&重组反应
1)体系配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分，避免产生气泡&(请勿剧烈震荡或者涡旋混匀)&。
2)置于37℃反应30 min。
3)待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5 min。
4)反应产物可直接进行转化；也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。
注意：我们推荐您在PCR仪或者水浴锅等温控比较精确的仪器上进行反应。重组效率在反应30 min左右达到最高，反应时间不足或者太长都将会降低克隆效率。
4.重组产物转化、涂板
1)取20 &l冷却反应液，加入到200 &l感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30 min。
2)42℃热激45～90秒，冰水浴孵育2 min。
3)加入900 &l SOC或LB培养基，37℃孵育10 min充分复苏。37℃摇菌45 min。
4)取100 &l菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养。
注意：我们推荐您使用转化效率&108&cfu/&g的感受态细胞。如果感受态转化效率&108&cfu/&g(例如用CaCl2法新鲜制备的感受态转化效率通常在106-107&cfu/&g之间)&，请将培养菌液在5000 rpm离心3 min收集菌体，用100 &l LB培养基重悬后全部涂板。
5.克隆鉴定
最方便快捷的方法是菌落PCR。用无菌的枪头或牙签将单个菌落挑至20～50 &l LB&培养基中混匀，直接取1 &l作为PCR模板。
我们推荐您至少用一条通用测序引物进行菌落PCR，这样可以避免PCR假阳性的产生。
将PCR阳性菌落的剩余菌液接种至含有适当抗生素的LB培养基中培养过夜，提取质粒做后续的鉴定。
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有关DNA酶切的问题
PCR产物需要经过双酶切与同样双酶切的表达质粒相连&请问：&1.PCR产物不经纯化可以直接酶切吗？&2.酶切之后的PCR产物和质粒需要割胶纯化吗？&3.如果需要割胶纯化的话，为了方便后面的连接，PCR产物和质粒在电泳时上样大概用多少微克呢？
可以切，但效果不一定好。我都把pcr产物连到t载体上--转化--提质粒--酶切--胶回收酶切产物--再练，这样可以减少很多麻烦。
楼上这个方法不错，谢谢了啊。
不用连T载，有点浪费时间。除非逼不得已，怎么也连不上再试T载吧&1 PCR产物可以直接酶切，有人这么做过。但是我觉得还是纯化一下比较好，可以排除其它的不利影响&2.如果酶切下来的碱基数很少，比如20以下，可以就用PCR清洁回收试剂盒回收&&&质粒酶切前先检验一下，是否切完全了。如果酶切时间很短，最好切胶回收，以免少量的质粒没切开，造成后面的假阳性很多。我们一般切的很久，直接用pcr清洁回收试剂盒回收了，效果也行。自己摸索一下吧&3.我一般点2，3微升就行了。要看你的酶切的量以及你回收的效果来定
啊，版主，感谢啊！我就是不想连T载，哈哈，说的很详细啊，太感谢啦！
呵呵 不客气，有问题的话再聊
酶切三个小时应该就足够了吧
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