& 卡介苗菌株Hsp16.3基因打靶载体的构建及鉴定
卡介苗菌株Hsp16.3基因打靶载体的构建及鉴定
摘 要：目的构建卡介苗菌株Hsp16.3基因打靶载体。方法体外培养卡介苗菌株并提取基因组DNA,扩增Hsp16.3基因两侧序列5＇-Hsp16.3和3＇-Hsp16.3,分别插入到pKO质粒载体预定位点中构建
【题　名】卡介苗菌株Hsp16.3基因打靶载体的构建及鉴定
【作　者】田玺择 徐芳 董江涛 姚楠 吴芳 章乐 曹旭东 张万江
【机　构】石河子大学医学院病理生理学教研室（石河子大学新疆地方与民族高发病教育部重点实验室） 新疆石河子832002
【刊　名】《中国现代医学杂志》2012年 第11期 8-13页　共6页
【关键词】基因敲除 基因打靶载体 Hsp16.3 卡介苗
【文　摘】目的构建卡介苗菌株Hsp16.3基因打靶载体。方法体外培养卡介苗菌株并提取基因组DNA,扩增Hsp16.3基因两侧序列5＇-Hsp16.3和3＇-Hsp16.3,分别插入到pKO质粒载体预定位点中构建Hsp16.3基因置换型打靶载体,筛选并进行PCR、双酶切鉴定及测序鉴定。结果构建的卡介苗菌株Hsp16.3基因打靶载体,经PCR、双酶切鉴定及测序证实pKO质粒中的2个插入片段为所需目的基因。结论成功构建出卡介苗菌株Hsp16.3基因打靶载体。
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基因敲除,基因打靶载体,Hsp16.3,卡介苗
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通用型基因打靶载体的构建及其功能鉴定PRPS1基因打靶载体的构建及Treacher collins综合征致病基因筛查--博士论文下载
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PRPS1基因打靶载体的构建及Treacher collins综合征致病基因筛查
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英文缩略词表第1-8页中文摘要第8-10页Abstract第10-12页前言第12-14页第一部分&PRPS1&基因打靶载体的构建及&ES&细胞的筛选和鉴定第14-58页&材料与方法第15-42页&结果第42-47页&讨论第47-54页&小结第54-55页&参考文献第55-58页第二部分&Treacher&collins&综合征致病基因筛查及分子机制研究第58-92页&前言第58-59页&材料与方法第59-67页&结果第67-70页&讨论第70-75页&小结第75-88页&参考文献第88-92页文献综述第92-105页&参考文献第101-105页附录第105-106页个人简历第106-108页致谢第108-110页
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联系方式： QQ:靶，所以选择二倍体或近二倍体细胞对实验最为便捷，大多数具有稳定染色体组的二倍体肿瘤细胞系是具有错配修复缺陷的[7]。迄今为止，在基因打靶中应用最广泛的是错配修复缺陷的结肠癌细胞系HCT116和DLD1。当然还有一些细胞系也曾被用于基因打靶，包括其他肿瘤细胞系以及正常组织细胞系，但也有很多未经验证的细胞系很可能不适合基因打靶，所以我们应该尽量选择经过验证的细胞系。
人们设计了多种方法用于基因的改造，其成功率和效率差别很大，而最直接的方法就是利用构建好的含外源基因的载体转入细胞与内源基因进行同源重组。用于体细胞打靶的方法与构建基因敲除小鼠的方法相似，在两种方法中，都包括四个基本的步骤：（ 1）设计并构建打靶载体，载体中包括两段同源区及在两段同源区之间的筛选标记，（2）将打靶载体高效转入目的细胞，（3）在一定的筛选条件下，使稳定整合筛选标记的克隆扩增，（4）鉴定并大量扩增发生同源重组而非随机重组的细胞克隆。除了上述基本的步骤外，对人源细胞的打靶又有独特的要求，需要对用于小鼠的标准方法进行修改。首先，外源DNA 整合进人类细胞基因组的效率比整合进小鼠基因组的效率低，这就使大量转基因克隆的产生变得相对困难。其次，人类基因组大小约为小鼠基因组的三倍，有证据显示培养的人源细胞中同源重组效率较低
[8]。最后，人源细胞与小鼠细胞相同，一般为二倍体，在小鼠中杂合子可以通过回交（back crossing）变为纯合子，这在人源细胞中显然不能实现，所以多个等位基因需要逐个敲除M敲入才能获得纯合克隆。在以上四个步骤中，打靶载体的构建是后续实验的基础，决定了同源重组的位点及重组效率，所以打靶载体的选择与构建就显得尤为关键。
3 重组腺相关病毒介导的基因打靶
在基因打靶技术应用的早期，一般以质粒为骨架构建打靶载体，再通过电转化的方法将载体转入目的细胞系。例如，Brown 等[9] 成功在人正常二倍体成纤维细胞中敲除p21 基因，
揭示了p21 与细胞衰老间的关系。Chan 等[10] 在HCT116细胞系中成功敲除14-3-3σ基因，证明这个基因在DNA 发生损伤后参与维持G2期检验点并阻止细胞死亡。Ku86 在哺乳动物中的非同源末端连接中起非常关键的作用，敲除Ku86 产生的杂合子HCT116 细胞，其增殖速度减慢，p53 表达水平增高，而敲除的纯合子细胞在经过几次分裂后就发生凋亡[11]。以上实验取得了很大的成功，但是在上述实验中，载体转入细胞及整合进特异位点的效率较低，增加了实验的成本和操作的复杂性。重组腺相关病毒（rAAV）载体的出现在一定程度上克服了上述缺点。Russell 等[12] 发现rAAV 载体中的外源DNA 序列整合进染色体同源位点的效率较高，有证据证明其效率比质粒载体高25 倍[13]。由于细胞表面的腺相关病毒受体广泛分布于各种人体组织中，所以包装好的rAAV病毒颗粒可以高效转染各种人源细胞。
另外一个对基因打靶技术的改进是启动子捕获载体（promoter trap vector）的应用。典型的例子是应用于小鼠胚胎干细胞的打靶载体，包含一个由强启动子驱动的筛选标记基因，这种筛选元件在染色体上发生随机重组时也会稳定表达筛选标记，产生非目的打靶克隆，增加了筛选的工作量。Sedivy 等[8] 发现，当筛选标记基因的表达依赖于内源目的基因的启动子，就可以使所有转基因克隆中产生同源重组克隆的比例大大增加，这项技术就叫做启动子捕获技术。Bunz 等[13] 设计了一个通用的筛选元件，从元件的上游到下游包含剪接受体（Splice acceptor,SA）、IRES 序列（internal ribosomal entry sequence），筛选标记基因以及多聚腺苷酸尾，将这个元件命名为SEPT（synthetic exon promoter trap），用于构建启动子捕获载体。在SEPT 的两侧，还包括loxP 位点，从而可以通过Cre 重组酶将筛选基因切除（见图1a）。需要说明的是，这项技术需要一个有活性的内源启动子，所以被打靶的基因必须是在正常生长条件下持续表达的基因[14]。
rAAV 打靶载体和启动子捕获技术的应用在很大程度上提高了产生同源重组细胞克隆的效
率，优化了转基因克隆产生的条件，缩小了克隆筛选的范围，使阳性克隆的产生率达到1%以上[3]。应用上述改进的基因打靶方法，研究人员在细胞水平上对肿瘤的凋亡、生长、转移等许多方面有了进一步的认识，有很多的基因敲除M敲入细胞系还被用于新药研发及对药物靶点的验证[3]。
图1：同源重组介导的基因敲除/敲入。(a) 基因打靶载体中的功能元件，主要是两条同源臂及中间的筛选标记；SEPT 通用筛选元件，包括一个剪接位点、一个IRES 序列、新霉素转移酶编码序列（neo）以及一个多聚腺苷酸尾；这个筛选元件两端还含有Cre 重组酶的识别位点（即loxP 位点）。(b) 同源臂的位置决定打靶载体的功能。在knockout 打靶载体中，同源臂的位置选在目的外显子的两侧，这样通过同源重组使目的外显子被敲除；但要产生knockin 等位基因，选取的同源臂应跨越目的外显子，同源重组后，由经过修饰的同源臂代替野生型同源区。
4 体细胞基因打靶的实验设计
基因打靶的第一步是设计打靶载体，打靶载体由两个重要的部分组成：一部分是同源臂（homology arm, HA），另一部分是位于两个同源臂之间的筛选标记元件。同源臂决定了}