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我们使用的胰酶过了有效期，浓度是0.5%（1640配制），一般0.25%就好了。消化很快呀（3-5min），你再试试。
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我也在做sf9细胞表达蛋白，但是蛋白表达量没有你的高。目的蛋白分泌到上清中。纯化蛋白时，100ml细胞上清液仅能纯化约100ug蛋白。我的纯化方法是：细胞上清用PBS透析几次，然后过NTA-Ni柱。能否将你的蛋白纯化方法共享一下，谢过！
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原帖由 mamamiya 于
15:53 发表
我也在做sf9细胞表达蛋白，但是蛋白表达量没有你的高。目的蛋白分泌到上清中。纯化蛋白时，100ml细胞上清液仅能纯化约100ug蛋白。我的纯化方法是：细胞上清用PBS透析几次，然后过NTA-Ni柱。能否将你的蛋白纯化方法共享一下，谢 ...
以前做过杆状病毒分泌表达的纯化工作，提供你一些意见，稍作参考。你的表达量还是很可以的，就分泌表达而言，完全能够纯化出来。我的实验技术路线如下：以1L的培养液上清为对象，先用阴离子交换层析柱富集，然后脱盐柱除掉部分色素，再直接上样于Ni-NTA上，条件成熟，大半天时间就可完成1L的纯化，我最终1L培养基中获得1.5mg的目的蛋白，纯度在90%以上。
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请教：你的Bacmid是如何提取的，怎么纯化的？转染剂量是否严格遵守操作手册的推荐剂量？你所说的“病毒感染晚期（正常24-72h）可见细胞停止生长、黏附，呈颗粒状外观”能否详细描述一下？不胜感激！！！
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不知道coffejumps表达的蛋白有多大？是否是膜蛋白？膜蛋白不好做，蛋白太大不好做。
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深表赞同啊，我就是用bac-to-bac系统表达膜蛋白的，作了一年。一开始也是前面的步骤都没问题，就是最后的western做不出来，一直以为是序列有移码，测序存在问题。反反复复测了很多次结果都不一样，汗啊～～后来才发现是蛋白表达量太低，western没有检测到（因为当时的阳性对照是一直以为表达量应该差不多的蛋白，结果哪知道差那么多！）。最近提高一抗的稀释度4倍，就检测到了，提膜蛋白做纯度就更高了。
这么做下来，也是觉得，转染纯度什么的都不是问题，有的话就可以了。我们也是手工提的。至于细胞状态，我们用的是sf9细胞，一般过夜就一定能贴壁的不错，传代的时候就用吹管吹下就下来了，很容易，不需要用消化液消化的，而且我记得sf9好像应该是半贴壁细胞吧？？
感染的迹象：做病毒P1扩增的时候，不是很明显的，也就是细胞一开始还是长的，后来停住，变大变透明的感觉。如果是用高滴度病毒做表达的时候，好的情况（国外一位老师说）应该是像“气球”一样浮起来，然后变大变通透，如果是有要裂掉的那个样子我觉得是养的太久了吧。一般我作的话，病毒扩增都是3天的，表达4天，如果真要表达7天，我在想是不是蛋白都要被水解光了？
感觉做滴度是最麻烦最费时间的事情，很容易污染，不知道大家是不是这样的？要么就是一个噬斑都没，反正成功率不高。但觉得病毒滴度对优化表达条件提高蛋白表达量又是很重要的，不知道有没有什么好建议或是做的好的同志的心得，可以分享一下？那天有看到基因公司在代理BD的滴度测定试剂盒（BacPAK rapid titer kit），2天就可以测完，就是太贵，3700RMB就没几次好用，奢侈啊～～
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相关疾病：
我是用Baculogold 来做蛋白表达的，做了一年多了，始终没有检测的到，细胞是sf9。
我的蛋白是膜蛋白，140kD，国外都表达出来了，但是我用我自己构建的病毒来做，怎么都没有做出来，听说膜蛋白很难表达，我想到底是什么问题？表达量文献上的很高，而我的western 都基本上看不出来。
我所怀疑的各个步骤都没有问题，包括病毒都是由感染性的，MOI试过n多次，我每次感染都是在72h或更长时间，后收细胞的，细胞病变很明显，对于这么大的蛋白，是不是时间短了阿，
不过在细胞的培养方面还是有很多经验的，希望和大家交流，也希望大家能在蛋白表达这方面给我指导，郁闷中
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还有，sf9的细胞电泳，你们都是怎么处理细胞的？
我的细胞量不是很多，如果提膜来检测膜蛋白的话，就很少了，我试过跑全细胞电泳，但是结果考染后整条带都兰呼呼的，而且带形很难看，不知道是由于脂太多，还是由于核算的干扰？
你们都是怎么处理细胞的，来检测蛋白的？
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我目前纯化出来的这个蛋白，表达量大约在2-3mg/1*10^8个细胞，还不是很满意。呵呵，这两个酶的效率比较高，放心用！反正后面要鉴定嘛
这个状态怎么控制？谈谈你的经验如何？
放一个星期都可以？？？晕！细胞破裂死亡不会导致表达蛋白降解吗？
你们通常都表达什么性质的蛋白，稳定性如何，表达膜蛋白成功的例子多么？
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就我自己做的来说吧，扩毒时，一般加毒后到第五天收毒，收毒前如果细胞漂起来的不多，就再等一到两天收毒。表达蛋白就不同了，要摸索时相和加的病毒量，蛋白不同表达时相会不一样。
我自己做的一个分泌型蛋白表达还行，不过我用的培基加有FBS，想试试把血清去掉再做做表达。另做了个膜蛋白90kD左右，表达的量很低，正在郁闷中。
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这么做下来，也是觉得，转染纯度什么的都不是问题，有的话就可以了。我们也是手工提的。至于细胞状态，我们用的是sf9细胞，一般过夜就一定能贴壁的不错，传代的时候就用吹管吹下就下来了，很容易，不需要用消化液消化的，而且我记得sf9好像应该是半贴壁细胞吧？？
感染的迹象：做病毒P1扩增的时候，不是很明显的，也就是细胞一开始还是长的，后来停住，变大变透明的感觉。如果是用高滴度病毒做表达的时候，好的情况（国外一位老师说）应该是像“气球”一样浮起来，然后变大变通透，如果是有要裂掉的那个样子我觉得是养的太久了吧。一般我作的话，病毒扩增都是3天的，表达4天，如果真要表达7天，我在想是不是蛋白都要被水解光了？
感觉做滴度是最麻烦最费时间的事情，很容易污染，不知道大家是不是这样的？要么就是一个噬斑都没，反正成功率不高。但觉得病毒滴度对优化表达条件提高蛋白表达量又是很重要的，不知道有没有什么好建议或是做的好的同志的心得，可以分享一下？那天有看到基因公司在代理BD的滴度测定试剂盒（BacPAK rapid titer kit），2天就可以测完，就是太贵，3700RMB就没几次好用，奢侈啊～～
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我也觉得挺好吹的，好像消化液处理对细胞状态会有一些影响的。
滴度一定要做么？我觉得好麻烦，总不想去做。反正表达的时候不是要做时相跟MOI的么？条件摸好了表达的时候用同一个病毒stock不行么？
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我也在用昆虫细胞sf9和baculovirus表达一个蛋白， 蛋白要么是不合histag结合， 要么是没有活力。 试验室里的人说我表达的是分泌型蛋白，他们只用细胞培养上清做分离纯化，可我怀疑上清中蛋白不够多，也许大部分都在细胞里，怎么确定蛋白是分泌表达还是胞浆表达呢， 是不是是由蛋白本身的特性决定的。 另外我对你的纯化过程非常感兴趣，我最近对一个蛋白进行了几次纯化， 过了histag 的bead,还是有很多条带，能不能介绍介绍纯化过程，非常感谢。君，已阅读到文档的结尾了呢~~
Insect Cell Expression：昆虫细胞表达
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【求助】血吸附实验的详细操作步骤
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这个帖子发布于8年零94天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
那位师兄师姐有血吸附实验的详细操作步骤，赐教一下吧
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来源：虽然不能帮楼主了，但是对于只会用度娘、搜狗的童鞋还是有很大帮助的。。。用谷歌才找到这个页面，贴在这里帮助需要的同学。致细胞病变/血吸附病毒因子检查试验 （本规程依据《中华人民共和国兽药典》2010年版第三部、《中华人民共和国药典》2010年版第三部、《美国药典》第35版/30和《美国联邦法典》第9部制订）1 材料与方法1.1材料1.1.1 试剂及配制1)无钙镁的PBS平衡盐溶液（D-PBSA溶液）的配制称取氯化钾（KCl）0.20g、磷酸二氢钾（KH2PO4）0.20g、氯化钠（NaCl）8.00g、磷酸氢二钠（Na2HPO4·7H2O）2.20g，用少量纯化水/蒸馏水溶解并定容至1000ml，调pH至7.4，室温存放，有效期为6个月。
2) 4%（g/ml）柠檬酸三钠(C6H5Na3O7·2H2O)的配制称取柠檬酸三钠4g，用少量纯化水/蒸馏水溶解并定容至100ml，调pH至7.4，2～8℃存放，有效期为6个月。3) 0.2%～0.5%的鸡和豚鼠红细胞悬液的制备250～300g健康豚鼠心脏采血3ml，加至12ml 4%（g/ml）柠檬酸三钠溶液中，轻轻混匀，800rpm离心10min，吸出上清，将红细胞悬浮于无钙镁的PBS中，再次离心，如此洗涤直至上清液澄清，弃上清，将沉积的红细胞留用；选用g健康鸡采血1ml，同法制备鸡红细胞。分别取100μl～250μl豚鼠红细胞和鸡红细胞于100 ml无钙镁的PBS中，即得0.2%～0.5%的鸡和豚鼠红细胞悬液。新鲜红细胞在2～8℃保存不得超过7天。1.1.2培养基及血清1)MEM高糖培养基（Gibco，货号02-5062EJ），加10%新生牛血清。2)血清(兰州民海生物工程有限公司 批号：)。1.1.3 细胞株1) 二倍体细胞：MRC-5细胞、KMb细胞、2BS细胞等任选其一；2) Vero细胞：来源于ATCC；3) 与待检细胞同种属同组织类型的细胞，可不同代次。1.1.4 阳性对照1) 细胞病变阳性对照：脑心肌炎病毒，X74312株，来源于ATCC；2) 血吸附阳性对照：牛副流感病毒3型，SB株，来源于ATCC。1.1.5 阴性对照
以正常传代细胞作为阴性对照。1.1.6 其他细胞培养瓶（T75）、吸管、刻度吸管、培养皿（Ф60mm）、盖玻片、载玻片，用前灭菌。移液器及其配套吸头、带盖湿盒。1.1.7 设备
1)倒置式生物显微镜（日本 OLYMPUS CKX-41）2)CO2培养箱（美国 Thermo 3111）3)倒置式荧光生物显微镜（日本 OLYMPUS IX-71）4)生物安全柜（美国 Thermo MSC-Advantage）1.2 方法1.2.1待检样品制备 将待检细胞经无抗生素培养基传1代，取三天未换液的且已长成单层的细胞，反复冻融3次，1000rpm离心15min除去细胞碎片，收集上清液，过滤除菌后即为待检样品。悬浮培养型细胞直接冻融后离心，同法制备待检品。1.2.2 接种培养1) 致细胞病变试验二倍体细胞、Vero细胞以及与待检细胞同种属同组织类型的细胞，每组细胞6瓶，每瓶20ml，每瓶接种待检样品3ml。于5%CO2培养箱36℃±1℃培养21d。同时设立细胞阴性对照和阳性对照。阳性对照接种100μl稀释至10-3的脑心肌炎病毒。在培养过程中每7天进行传代，期间根据细胞生长情况更换细胞培养液。显微镜下观察并记录是否有细胞病变出现。2) 血吸附试验在观察期的第7d、14d和第21d，分别取2瓶细胞，弃去细胞培养液，用无钙镁PBS将细胞单层轻轻冲洗3遍。加入20ml的豚鼠红细胞和鸡红细胞混合悬液（加入前应混匀），使之均匀的覆盖在细胞单层上。加入红细胞悬液后将细胞单层置2～8℃ 30min，然后置20～25℃ 30min，然后用PBS轻轻冲洗3遍分别进行镜检，观察并记录细胞单层红细胞吸附情况。1.2.3 结果判定1)致细胞病变试验阳性对照应出现典型的细胞病变；阴性对照应无任何细胞病变出现。接种待检样品的细胞组均不出现任何细胞病变，则待检细胞致细胞病变试验判为阴性。2)血吸附试验 阳性对照应出现红细胞吸附，阴性对照应无红细胞吸附。接种待检样品的细胞组均不出现红细胞吸附，则待检细胞血吸附试验判为阴性。3)观察期内接种待检样品的细胞组细胞形态正常、致细胞病变试验阴性且血吸附试验阴性，则待检细胞无病毒外源因子污染，判为阴性（—）；若观察期内接种待检样品的细胞组中任一细胞出现致细胞病变试验阳性或血吸附试验阳性时，则待检细胞存在外源因子污染，判为阳性（+）。
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关于丁香园& 【求助】我如何来分离纯化我的昆虫细胞表达产物？
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【求助】我如何来分离纯化我的昆虫细胞表达产物？
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【求助】我如何来分离纯化我的昆虫细胞表达产物？
相关疾病：
我用昆虫细胞表达了一个蛋白，细胞培养上清(即培养液)和感染细胞冻融裂解后的上清做SDS-PAGE,在目的条带附近都有一个带，继续做免疫印迹，用原核表达产物制备的兔血清做一抗反应，结果在细胞培养上清和感染细胞冻融裂解后的上清中都有反应。看来我的蛋白在细胞培养上清和感染细胞中都有表达。
现在，我不知道如何来分离纯化我的表达产物，细胞培养上清中还有血清存在，真是一筹莫展，希望得到大家的指点和帮助！万分感谢！
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我现在在做昆虫细胞表达，
我不怎么清楚你说的意思
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我做的时候是收集细胞
然后SDS-PAGE检测有表达没有
然后破碎细胞
取上清纯化
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只有在细胞破碎以后上清里面才有蛋白（就是裂解液）
沉淀？你说的沉淀是什么？细胞破碎以后离心的沉淀吗？
一般细胞破碎以后基本没有什么沉淀
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原帖由 紫烟 于
16:25 发表
相关疾病：
我用昆虫细胞表达了一个蛋白，细胞培养上清(即培养液)和感染细胞冻融裂解后的上清做SDS-PAGE,在目的条带附近都有一个带，继续做免疫印迹，用原核表达产物制备的兔血清做一抗反应，结果在细胞培养上清和感染细 ... 没有加标签吗?
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很抱歉，一着急，没把帖子说清楚，我已经修改过了。是在细胞培养液和细胞中都有表达，我用的是Bac-TO-Bac系统，pFastBac(TM)HT B载体带有6his标签。
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pFastBac(TM)HT B载体应该是不分泌的,所以应该是不会分泌到细胞培养基中,细胞培养基中的检测到蛋白,可能是因为有细胞破裂了.
Bac-TO-Bac系统一般都是用细胞裂解物纯化的.
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请问你的细胞是用什么方法破碎的?只是简单的冻融吗?有没有超声?
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用细胞裂解液结合超声
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pFastBac(TM)HT B载体应该是不分泌的,所以应该是不会分泌到细胞培养基中。
请教为何？昆虫杆状病毒表达系统简介及应用情况_百度文库
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昆虫杆状病毒表达系统简介及应用情况
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