扫二维码下载作业帮
1.75亿学生的选择
下载作业帮安装包
扫二维码下载作业帮
1.75亿学生的选择
还有细胞壁结构的细胞一定是植物细胞吗?反之,植物细胞一定有细胞壁么?
韩晓柒系列898
扫二维码下载作业帮
1.75亿学生的选择
植物细胞一定有细胞壁,但有细胞壁的并不都是植物细胞,如细菌、酵母菌等也有细胞壁.?
为您推荐：
其他类似问题
是的反之不对，原始的单细胞植物就不一定有细胞壁
细菌也有细胞壁 只不过成分与植物的不同
细菌的细胞壁含太聚糖
植物的含纤维素和果胶。植物一定有细胞壁
有些细菌是由细胞壁的 但是成分上不同~
有细胞壁的不一定是植物 比如细菌
酵母菌都有细胞壁但是
它们的成分不一样
植物细胞壁成分为纤维素和果胶 细菌细胞壁成分主要是肽聚糖（蛋白质和糖类结合）
酵母菌细胞壁成分是甘露聚糖活着葡聚糖反之
植物细胞一定是有细胞壁的
不一定的。植物细胞一定有细胞壁，但有细胞结构的，不一定是植物细胞，如酵母菌也有细胞壁，还有低级的动物也有细胞结构。
有细胞壁结构的细胞不一定是植物细胞，很多的细菌也有细胞壁，但是他们细胞壁的组成不同，植物细胞的细胞壁是由纤维素和果糖；而细菌的细胞壁则是聚肽糖植物细胞一定有细胞壁
这个应该对了。
有细胞壁结构的细胞不一定是植物细胞植物细胞一定有细胞壁
生物普遍被分为动物和植物，但这样的分类是进化的结果，所以有一部分生物既可属于动物也可属于植物，主要是一些低等的生物，如绿藻和绿眼虫。
植物细胞的细胞壁主要成分是纤维素和果胶，另外，一些细菌的细胞也有细胞壁，但这些细胞壁的主要成分是肽聚糖。...
植物细胞一定有细胞壁，有细胞壁的不一定是植物细胞
那可不一定，细菌也有细胞壁呢，生物书高中必修1中学原核生物和真核生物那一章节有图片的
不对植物细胞壁成分为纤维素和果胶 细菌细胞壁成分主要是肽聚糖
酵母菌有细胞壁，酵母细胞壁主要成分是酵母纤维素，外层甘露聚糖、内层为葡聚糖中间夹着蛋白质，细菌是有细胞壁的，主要成分为酵母纤维素组成的肽聚糖。
植物细胞一定有细胞壁，但不一定有叶绿素。
扫描下载二维码向具有细胞壁的细胞导入外来物质的方法
专利名称向具有细胞壁的细胞导入外来物质的方法
技术领域本发明涉及向具有细胞壁的细胞内导入核酸(DNA、 RNA)、蛋白 质等外来物质的方法。特别涉及利用碳纳米管的外来物质导入方法。
并且，本国际申请主张日提出的日本专利申请 号的优先权，在本说明书中引用该申请的全部内容以作参 昭。
背景技术为了将DNA或RNA这样的多核苷酸、蛋白质、脂质等的活性物 质作为外来物质导入靶细胞内，已知各种方法。例如，作为导入DNA 等基因的方法，已知使用脂质体的方法(脂质体法lipofection)、显微 注射法、电穿孔法、使用病毒载体的方法、DEAE-葡聚糖法、使用基
因枪的方法等。
但是，通常，与动物细胞相比，向植物细胞导入外来物质更困难。 这是由于植物细胞被含有纤维素的坚固的细胞壁包围，该细胞壁的存 在成为外来物质导入的障碍。另外，为了提高外来物质向细胞内的导 入效率，也经常预先进行酶处理(例如纤维素酶处理)，从而将细胞原 生质体化。但是，原生质体化是繁琐并且费时费力的操作。并且，对
原生质体化后的细胞的操作要求熟练性和慎重性。
作为这样的现有技术，例如在专利文献1中记载了利用激光所具 有的高加工特性，切断构成植物细胞壁的高分子的化学键，由此将基 因等外来物质(活性物质)导入植物细胞内的方法。但是，该文献中 记载的方法需要昂贵的激光照射装置，并且没有改变需要进行繁琐且 费时费力的操作(激光照射处理等)的现状。
专利文献1:日本特开号公报
本发明是为了解决向植物细胞等具有细胞壁的细胞导入外来物质
(例如活性物质，特别是DNA等遗传物质)时的现有问题而完成的， 其目的在于提供一种能够简便且容易地向靶细胞导入外来物质的方 法。本发明的目的在于提供一种能够简便且高效地向靶细胞导入特别 是DNA、 RNA等遗传物质(典型的是外来基因)的方法。
为了解决上述问题，本发明提供的方法是向具有细胞壁的细胞导 入外来物质的方法。这里所公开的方法，包括准备载持有至少一种 细胞壁分解酶的碳纳米管的步骤；向含有上述细胞的处理对象(典型 的是含有该细胞的处理液)供给上述载持有细胞壁分解酶的碳纳米管 和作为导入对象的外来物质的步骤；通过与上述细胞接触的碳纳米管 所具有的上述分解酶的作用，分解该细胞的细胞壁的步骤；和通过上 述细胞壁被分解的部位，向上述细胞内导入目的外来物质的步骤。
本说明书中的"外来物质(导入物质)"是指能够向靶细胞内供给 的大小和性状的物质。可以是天然存在的物质，或者人工制造的物质。 作为典型例，可以列举各种活性分子。例如，多核苷酸(DNA、 RNA)、 多肽、蛋白质等活性分子是包括在这里所说的外来物质(导入物质) 的优选例。
另外，本说明书中的"碳纳米管"是由碳骨架形成的构造体，是 纳米尺寸(典型的是200nm以下、例如1 200nm左右)的直径的筒 状或纤维状的一层或多层巻成的碳构造体。除了所谓单层碳纳米管 (single-walled carbon nanotube: SWNT)禾卩多层碳纟内米管(multi-walled carbonnanotube: MWNT)之夕卜，本说明书的碳纳米管也包括根据形态 的特征而被称为碳纳米纤维(碳纳米晶须)或碳纳米锥的物质。
本发明的外来物质导入方法中，通过使用所期望的细胞壁分解酶 被固定化的碳纳米管，能够通过该碳纳米管上固定化的细胞壁分解酶 在靶细胞的细胞壁上打开微小的孔(纳米孔)。因此，能够从该微小的 孔向细胞内导入目的的外来物质。
另外，由于通过该方法在靶细胞的细胞壁上形成的孔非常微小， 处理后细胞的生存率极高(换言之，导入处理后容易进行穿孔的自我 修复)，能够得到维持细胞本来具有的机能的正常的细胞(无缺陷细胞)。另外，细胞的操作不需要特别的慎重。因此，根据本发明的方法，能够不进行繁琐且费时费力的操作，有效地得到高效率地导入目的外来物质的细胞。
由此，本发明的另一方面提供一种通过导入外来遗传物质而发生转化的细胞(进一步为由该转化的细胞产生的组织)的生产方法，该方法的特征在于通过本发明的导入方法，将作为外来物质的多核苷
酸(包括DNA或RNA形成的基因、含有该基因的蛋白质类、以及多核苷酸和其它物质(例如蛋白质)的复合体)导入靶细胞。
这里公开的方法的一个优选方式的特征在于作为上述酶，使用
至少一种的纤维素酶。
通过使用纤维素酶，能够有效地在耙细胞、特别是植物细胞的细胞壁上形成微小的孔。因此，特别是在上述细胞是植物细胞时，优选将纤维素酶在碳纳米管上固定化。
另外，这里公开的方法的其它优选方式的特征在于作为上述碳
纳米管，使用全长(平均值)为10pm以下的碳纳米管。
通过使用上述比较短的碳纳米管作为碳纳米管，提高各向异性的碳纳米管颗粒在处理液中的无规运动性(典型的是平移、旋转等的布朗运动)，结果，能够提高与靶细胞的接触频率，能够更高效地通过固定化在碳纳米管上的酶处理进行对细胞壁的穿孔及随之的外来物质的导入。
另外，这里公开的方法的其它优选方式中，预先将上述准备好的载持有细胞壁分解酶的碳纳米管添加在含有表面活性剂(优选非离子型表面活性剂和/或阳离子型表面活性剂)的溶液中，配制外来物质导入用溶液，向含有上述细胞的处理对象供给该配制得到的溶液。
在向含有靶细胞的处理对象供给之前，将载持有细胞壁分解酶的碳纳米管向含有表面活性剂(优选非离子型表面活性剂和/或阳离子型表面活性剂)的溶液中添加，预先配制外来物质导入用溶液，通过使用该配制得到的溶液，能够进一步促进载持细胞壁分解酶的碳纳米管的无规运动。另外，对靶细胞的细胞壁的穿孔被活化，能够进一步提高外来物质的导入效率。另外，上述外来物质导入用溶液除了使用载持有细胞壁分解酶的碳纳米管以外，还可以添加并使用所希望的外来
另外，优选上述细胞处理对象是含有上述细胞的处理液，其特征在于，该细胞处理液含有表面活性剂、特别是非离子型表面活性剂和/
或阳离子型表面活性剂。更优选作为非离子型表面活性剂，使用n-辛基-(3-D-葡萄糖苷。由于处理液中含有这样的表面活性剂，能够促进碳纳米管在处理液中的无规运动，并且能够提高外来物质的导入效率(特别是DNA或RNA这样多核苷酸)。
另外，根据本发明，提供一种细胞，该细胞的特征在于，通过这里公开的方法，将规定的外来物质导入细胞内。作为其优选例，提供一种植物细胞(进一步为由该植物细胞得到的组织或植物个体)。典型地提供一种细胞，其特征在于，将规定的外来物质和载持有细胞壁分解酶的碳纳米管一起导入(进入)细胞内。
另外，本发明提供一种试剂盒，其为适于实施这里公开的外来物质导入方法的材料的组合，即，用于向植物细胞那种具有细胞壁的细胞导入外来物质。
本发明提供的外来物质导入用的试剂盒，具备至少一种细胞壁分解酶、碳纳米管和含有至少一种表面活性剂(优选非离子型表面活性剂和/或阳离子型表面活性剂)的外来物质导入用溶液。
在优选方式的试剂盒中，试剂盒中所含有的碳纳米管中预先载持有上述至少一种的细胞壁分解酶。
根据本发明提供的试剂盒，能够容易地配制上述外来物质导入用溶液，并且上述碳纳米管所载持的细胞壁分解酶与上述细胞接触，分解该细胞的细胞壁，能够容易地从该细胞壁被分解的部位向该细胞内导入目的的外来物质。
在一种优选方式的试剂盒中，上述酶是至少一种的纤维素酶。另外，在另一种优选方式的试剂盒中，上述非离子型表面活性剂是n-辛基-P-D-葡萄糖苷。
通过使用这样的试剂盒，能够通过简单的操作，适当地对具有细胞壁的细胞(典型的是植物细胞)，向细胞内同时导入规定的外来物质和载持有细胞壁分解酶的碳纳米管。
图1A是表示一个实施例中使用的碳纳米管的形态的显微镜照片。
图1B是表示一个实施例中，在碳纳米管的表面固定纤维素酶后的碳纳米管的形态的显微镜照片。
图2A是表示一个实施例中，在添加载持有纤维素酶的碳纳米管后，经过1小时时的靶植物细胞的状态的显微镜照片。
图2B是表示一个实施例中，在添加载持有纤维素酶的碳纳米管后，经过2小时时的靶植物细胞的状态的显微镜照片。
图2C是表示一个实施例中，在添加载持有纤维素酶的碳纳米管后，经过3小时时的靶植物细胞的状态的显微镜照片。
图2D是表示一个实施例中，在添加载持有纤维素酶的碳纳米管后，经过5小时时的靶植物细胞的状态的显微镜照片。
图3是表示一个实施例中，载持有纤维素酶的碳纳米管通过细胞壁而进入细胞内的状态的显微镜照片(利用投射照明的亮视野观察)。
图4是表示一个实施例的利用载持有纤维素酶的碳纳米管的纤维素水解物的解析结果的图谱。
图5是示意性地表示一个实施例的导入方法概要的说明图。
图6是一个实施例中摄入外来物质后的靶植物细胞的三维重构图。
图7A是表示导入外来物质后的靶细胞内的状态的荧光显微镜照片(载持有纤维物酶的碳纳米管的观察)。
图7B是表示导入外来物质后的靶细胞内的状态的荧光显微镜照片(核酸的观察)。
图7C是表示导入外来物质后的靶细胞内的状态的荧光显微镜照片(载持有纤维物酶的碳纳米管和核酸的观察)。
图7D是表示导入外来物质后的靶细胞内的状态的荧光显微镜照片(载持有纤维物酶的碳纳米管和核酸的亮视野观察)。
具体实施例方式
以下，说明本发明的优选实施方式。其中，本说明书中除了特别言及的事项(例如，载持细胞壁分解酶的碳纳米管的制造方法、向含有靶细胞的处理对象(典型的是含有细胞的处理液)供给该碳纳米管的方法)以外，实施本发明的必要事项(例如，所期望的外来物质的供给装置和配制方法)可以基于本领域中的现有技术，作为本领域技术人员的设计事项进行把握。本发明能够基于本说明书中公开的内容和本领域的技术常识实施。
如上所述，这里公开的方法的特征在于，向靶细胞同时供给载持有适当的细胞壁分解酶的碳纳米管、和规定的外来物质，只要能够实现本发明的目的，对使用的碳纳米管的性状、细胞壁分解酶的种类、靶细胞的种类、处理对象的构成(例如处理液的组成)、培养基(具体的是培养本发明的导入处理前的细胞的培养基、处理液、培养处理后的细胞的培养基)的组成没有特别限制。
作为适用本发明方法的靶细胞、即"具有细胞壁的细胞"，可以使
用具有细胞壁的各种生物的细胞。高等植物的细胞壁中，果胶和半纤维素等多糖类基质充满纤维素形成的微小纤维间隙而构成。另外，细
菌类的细胞壁以肽聚糖为主要构成成分。另外，丝状菌的细胞壁以几
丁质和P-l，3-葡聚糖为主要构成成分。因此，根据靶细胞使用的细胞壁分解酶不同。
作为实施本发明时优选使用的细胞壁分解酶，可以列举切断纤维素的纤维素酶、切断果胶的果胶酶、切断半纤维素的半纤维素酶、切断几丁质的几丁质酶，切断P-l,3-葡聚糖的(3-l,3-葡聚糖酶、分解细菌类的细胞壁的溶菌酶等。
本发明特别优选将难以适用上述现有的导入方法的植物细胞(典型的是高等植物)作为靶细胞的方式。
另外，适用本发明的处理对象中的靶细胞的存在方式没有特别限定。典型地可以将细胞悬浊液作为处理对象(处理液)，但处理液中也可以含有植物活性组织的一部分(例如叶、根、茎、种子、花粉、花瓣或愈伤组织)。或者，本发明的说明书中的"含有靶细胞的处理对象"也包括在植物的一部分中水滴状地添加处理液(即含有碳纳米管和外来物质的液体)的方式、或将植物体的一部分浸渍在该处理液中的方式。
将植物细胞作为耙细胞时，作为细胞分解酶，特别优选使用纤维素酶。纤维素酶只要是能够水解(3-l，4-葡聚糖(纤维素)的糖苷键的酶即可，可以没有特别限制地使用，但是，特别优选作为葡聚糖内切酶
进行作用的酶(EC3.2丄4)。另外，也可以组合使用作为葡聚糖内切酶进行作用的纤维素酶、和作为外葡糖酶(纤维二糖水解酶EC 3.2.1.91)
进行作用的纤维素酶。
另外，使用的纤维素酶的来源没有特别限定，可以使用一般市售的酶。例如，能够购入并使用丝状菌(曲霉菌属等)产生的纤维素酶精制品0
对使用的碳纳米管的性状和制法没有特别限定。可以使用SWNT、MWNT等。从能够在处理液中无规且活跃地运动、提高与靶细胞的接触频率的观点出发，优选全长(链长)较短的物质。例如，全长(平均值)为10pm的碳纳米管，更优选全长(平均值)为5)Lim以下(例如0.1fim 5)im)左右的短链碳纳米管。特别优选全长(平均值)为lpm以下(例如0.1)Lim l^im)左右的短链碳纳米管。直径没有特别限定，优选为200nm以下，例如l 200nm左右。
这种短链碳纳米管优选采用化学气相成长(CVD)法制造，在该方法中，使用金属(催化剂)微粒作为成长核，使用烃等含碳气体作为材料。另外，采用该方法得到的碳纳米管的取向性高，能够大量配制外形相对一致的同形态、同性质的碳纳米管，故而优选。因此，在实施本发明时，优选使用通过化学气相成长(CVD)法制造的短链碳纳米管。例如，优选使用商品名为Carbere (注册商标)(GSI CREOS公司商品)的链长较短、重叠底部打开的杯状物的叠层构造的多层型碳纳米管。这种形态的较短的碳纳米管在处理液中无规且活跃地进行平移运动(变换位置的运动)和旋转运动，故而在本发明的实施中优选。
将纤维素酶等细胞壁分解酶载持在碳纳米管上(固定化)的方法，可以使用一直以来进行的一般方法。例如，通过在酶溶液中添加碳纳米管，能够将酶固定于碳纳米管的表面。优选对碳纳米管迸行酸处理、臭氧处理、等离子体处理、加热处理等，将碳纳米管的表面氧化，由此能够在碳纳米管表面上产生各种官能团(例如羰基、羟基)。由此，能够利用该官能团，使纤维素酶等细胞壁分解酶与碳纳米管化学结合。其中，向碳纳米管导入官能团的方法(酸处理、等离子体处理、臭氧处理、加热处理等)是现有公知的方法，不是本发明特征的方法，故而省略以上的详细说明。
作为实施本发明向靶细胞(植物细胞等)导入的外来物质，可以
根据目的，使用各种天然物质(典型的是DNA、 RNA等的多核苷酸、寡肽、多肽、蛋白质、脂质、糖类、DNA与各种有机聚合物(例如多肽)的复合体这种活性分子，或者颗粒状的金属或金属化合物或者陶瓷及其它的无机物质，或者不溶性的高分子或有机体)、或者人工构筑的物质(典型的是各种人工载体或重组基因、脂质体、非天然型酶等人工蛋白质)。特别是由于本发明是适合得到植物细胞等的转化体的方法，因此，优选使用作为基因的多核苷酸本身或构筑成含有该基因的各种载体作为外来物质。
在本发明的方法中，利用通过载持于碳纳米管上的细胞壁分解酶的作用在耙细胞的细胞壁上产生的微孔(典型的是直径为纳米尺寸的洞)，主要以物理方式导入外来物质，因此不需要对外来物质进行特别的前处理，进行基于现有的外来物质向细胞的导入方法的前处理即可。例如，在使用由DNA或RNA形成的基因或载体这种多核苷酸作为外来物质时，可以与显微注射法、电穿孔法等现有的基因导入方法相同地配制外来物质(和含有该物质的溶液或培养基)。
另外，用于进行本发明的导入法的处理对象(例如细胞悬浊液)，除了调节用于使细胞壁分解酶高效作用的条件(pH或盐浓度等)、添加细胞生存所必须的营养素、药品类(各种培养基、抗生素、pH调节用的盐类等)之外，优选含有能够提高外来物质的导入效率的成分。
例如，作为典型例可以列举表面活性剂。优选使用垸基糖苷类、聚氧乙烯烷基醚类、聚氧乙烯烷基酚基醚类、聚氧乙烯脂肪酸酯类(聚乙二醇类)、蔗糖脂肪酸酯类、山梨糖醇酐脂肪酸酯类、脂肪酸烷醇酰胺类、聚乙烯醇类这种非离子型表面活性剂。其中，特别优选使用作为较低分子量的表面活性剂的烷基糖苷类。例如可以列举n-辛基-p-D-葡萄糖苷、n-辛基-P-D-麦芽苷、n-癸基-p-D-麦芽苷、n-庚基-p-D-硫葡糖苷等。还可以使用烷基三甲基铵盐类、二烷基二甲基铵盐类、烷基二甲基苄基铵盐类和胺盐等阳离子型表面活性剂。其中，这种表面活性剂除了在上述处理液中添加外，还可以在配制上述外来物质导入用溶液时使用。
因此，优选这些表面活性剂作为本发明提供的外来物质导入用试剂盒的构成要素。
可以向处理液(即靶细胞)直接供给外来物质，也可以根据外来
物质的性状，使其载持(或者含有)于导入用的载体(carrier)而供给。这里的载体是用于向细胞内供给外来物质的介质(搬运体)。例如，可以列举脂质体、金属(金、钨等)或无机物(例如硅化合物)形成的颗粒或者晶须、藻酸珠子、病毒性物质(例如编码蛋白质)。
因此，作为本发明提供的外来物质导入用试剂盒的优选方式，可以列举具有至少一种的这样的导入用载体的试剂盒。
另外，本发明也提供用于导入某种特定外来物质的试剂盒(例如预先具备由规定的氨基酸序列构成的肽(寡肽、多肽)或者蛋白质、规定碱基序列构成的多核苷酸等作为该特定外来物质的试剂盒)。
另外，本发明提供的试剂盒中，除了上述主要构成要素(酶、碳纳米管、表面活性剂，根据期望的外来物质和载体)之外，还可以包括后述的几个实施例中列举的用于进行外来物质导入法而使用的各种试剂类、溶剂、器具类(典型的是经过灭菌的一次性处理管、培养皿等的容器类)。它们可以选择性地含有于试剂盒中，这些次要成分和器具类的有无不影响本发明的试剂盒所涉及的权利范围和技术范围的变动。
通过以下实施例，详细说明本发明的外来物质导入方法，但本发&第一实施例&
在本实施例中，作为靶细胞，使用来自采自高等植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)的胚轴的植物细胞悬浊液。这样的细胞悬浊液通过以下操作配制。培养基使用MS培养基(添加有30g/L的蔗糖、0.2g/L的肌醇，下同)。
艮P，将灭菌后的拟南芥种子在含有8g/L的含琼脂MS培养基(pH5.7)的平板上培养(暗条件)，发芽后用小刀切取采集胚轴。接着，将采集后的胚轴组织移至愈伤组织培养用MS琼脂培养基上，该培养基通过在含有0.5mg/L的苄氮基嘌呤(BAP)、 lmg/L的萘乙酸
12(NAA)、lmg/L的卩引哚乙酸(IAA)、lmg/L的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的愈伤组织培养用MS培养基(pH5.7)上添加8g/L的琼脂而配制。这样，在暗条件下继续培养约4周，直至形成愈伤组织。生出的愈伤组织每四周进行继代培养。培养在暗条件下以23土rc进行。
接着，向含有50mL的上述愈伤组织培养用MS培养基的100mL容积的三角烧瓶(Erlenmeyer flask)中添加约lg的愈伤组织，使其缓慢旋转，将愈伤组织分散，配制细胞悬浊液。将培养烧瓶载置于轨道式振荡器上，以100rpm进行旋转培养。培养在暗条件下以23士TC进行。细胞培养液(悬浊液)每四周进行继代培养。
另一方面，在本实施例中，作为细胞壁分解酶使用市售的纤维素酶。另外，作为碳纳米管，从制造商购入上述的Carbere (注册商标)使用。该碳纳米管材料含有大约数^m 数十^im左右的长链长的物质，但是从显微镜-AFM观察求得的平均链长(全长)约为0.5)iim。通过以下操作配制载持有纤维素酶的碳纳米管。
首先，在60。/。的硝酸中添加20mg上述碳纳米管，进行30分钟的超声波处理。之后，在12(TC进行12个小时的回流加热。由此，在试样碳纳米管的表面导入羧基作为官能团。
上述加热处理完成后，通过孔径为0.2(am的聚乙酸纤维素膜进行过滤，回收导入羧基的碳纳米管。用适量的纯水对回收的碳纳米管进行6次洗净，在8(TC干燥一晚。
接着，在lmL的MES (2-(N-吗啉)乙磺酸2-(N-Morpholino)ethanesulfonicAcid)缓冲液中混合lmg导入羧基的碳纳米管，进行10分钟的超声波处理。
接着在含有上述导入羰基的碳纳米管的MES液lmL中添加400mM的EDC ( 1-(3- 二甲氨丙基)-3-碳二亚胺盐酸盐l-(3陽(dimethylamino) propyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride)溶液禾口100mM的NHSS (N-羟基硫代琥珀酰亚胺N-hydroxysulfosuccinimide)溶液各lmL，充分搅拌混合15分钟。由此进行碳纳米管表面的羧基的活化。之后以15000rpm进行5分钟离心分离，去上清。该用EDC和NHSS溶液的混合搅拌和离心处理重复共计6次。
接着，在上述操作配制的碳纳米管的表面固定纤维素酶。其中，纤维素酶购入使用Sigma公司生产的C1794-5KU。
具体而言，使上述碳纳米管分散在pH调节为7的0.1M磷酸缓冲 液中。向其中添加上述购入的纤维素酶粉末，形成10mg/mL。并且在 室温条件下搅拌一晚。由此，得到通过碳纳米管表面的羧基与纤维素 酶分子中的氨基的酰胺键将纤维素酶固定在表面上的"载持有纤维素 酶的碳纳米管"。
第二天，以15000rpm对上述分散液进行7分钟的离心分离，去上
清。接着，在Murashige & Skoog培养基(Murashige and Skoog medium:
以下称为"MS培养基")中将离心分离回收物(即载持有纤维素酶的 碳纳米管组分)洗净。该离心分离处理和洗净处理重复进行4次。之 后，最终在离心分离回收物中添加含有10% (w/v) n-辛基-P-D-葡萄糖 苷的MS培养基lmL，得到载持有纤维素酶的碳纳米管分散液(外来 物质导入用溶液)。另外，该分散液在4'C保存，每次使用时用含有表 面活性剂n-辛基-(3-D-葡萄糖苷的MS培养基进行稀释。
使用原子力显微镜(AFM)观察配制的载持有纤维素酶的碳纳米 管的状态。悬臂前端的曲率为20nm。
结果如图1A和图1B所示。图1A是观察在碳纳米管表面固定纤 维素酶之前的碳纳米管的显微镜照片，图1B是观察上述配制好的固定 纤维素酶之后的碳纳米管的显微镜照片。其中，图中黑色的箭头表示
本实施例中使用的碳纳米管Carbere (注册商标)特征的重叠底部打开 的杯状物的叠层构造。另外，白色的小箭头表示碳纳米管，白色的大 箭头表示纤维素酶。
从这些图可知，配制前的图1A中，碳纳米管的表面没有附着任何 物质，而图1B中碳纳米管的表面固定有纤维素酶。
作为外来物质使用直径为1 10nm左右的量子点，具体使用硒化 镉(CdSe)颗粒。该量子点从Invitrogen公司购入。
具体而言，将购入的CdSe颗粒与三辛基氧膦(TOPO)在120°C 反应2小时。之后使用0.2pm的针筒过滤器进行过滤。将过滤得到的 CdSe颗粒添加到含有0.5mg载持有纤维素酶的碳纳米管的分散液(外 来物质导入用溶液)中，在室温保持原样静置2小时。之后以15000rpm 进行5分钟离心分离，去上清。将离心分离回收物在MS培养基中进行4次洗净，除去剩余的CdSe颗粒，得到吸附CdSe颗粒的载持有纤 维素酶的碳纳米管(含CdSe的外来物质导入用溶液)。该CdSe颗粒在 细胞内具有作为荧光探针的作用，在该颗粒导入植物细胞内时，能够 通过荧光检测容易地进行观察。
在含有的10% (w/v) OG的细胞悬浊液10mL中添加如上所述配 制的吸附CdSe颗粒的载持有纤维素酶的碳纳米管(含CdSe的外来物 质导入用溶液)。之后在37'C培养，在荧光显微镜下观察添加后经过1 小时、2小时、3小时、5小时时的细胞的状态。其中，光源使用汞灯。 激发波长为480nm。
结果如图2A 图2D所示。图2A表示添加碳纳米管后经过1小 时时的细胞，图2B表示经过2小时时的细胞，图2C表示经过3小时 时的细胞，图2D表示经过5小时时的细胞。
从这些图(显微镜照片)可知，通过利用载持有纤维素酶的碳纳 米管，能够在靶植物细胞的细胞壁上开孔，从而快速且简便地向细胞 内导入目的的外来物质(在此为量子点)。另外，从添加载持有纤维素 酶的碳纳米管开始经过5小时后，能够观察到导入细胞内的量子点大 半存在于小泡(液泡)内。
另外，如图3所示，通过显微镜观察(利用投射照明的亮视野观 察)能够确认处理中使用的载持有纤维素酶的碳纳米管也通过细胞壁、 细胞膜而进入细胞内。图示的数据为从添加载持有纤维素酶的碳纳米 管开始经过30秒的时刻的数据。另外，可以观察到进入细胞内的碳纳
米管接着在小泡(液泡)中聚集。
但是，没有发生由于碳纳米管本身的导入而引起的细胞损伤性， 从细胞维持的观点出发，碳纳米管本身向细胞内的导入没有问题。
另外，为了确认图2A D所示的结果是碳纳米管的纤维素酶活性 所引起的，在上述配制的载持有纤维素酶的碳纳米管分散液(外来物 质导入用溶液)10mL中，添加200mg市售的纤维素粉末(Sigma公司 产品)，并进行搅拌混合，配制纤维素处理液。将得到的处理液在37'C 孵育一晚。
孵育结束后，使用日立SV1100装置对纤维素处理液(水 液)进 行电泳并观察。其结果，如图4的曲线图可知，检测出纤维素的水解产物葡萄糖(图中的迁移时间(Migration Time): 80秒附近的峰)和 纤维素二糖(图中的迁移时间(Migration Time): 100秒附近的峰)。 这显示本实施例中使用的载持(固定)于碳纳米管的纤维素酶没有 失去酶活性，在细胞处理液(细胞悬浊液)中维持能够分解纤维素的 功能。
另外，图5是本实施例中外来物质导入方法的示意图。符号1表 示植物细胞，2表示载持有纤维素酶的碳纳米管，3表示量子点。该图 描述了从通过固定于碳纳米管的纤维素酶产生的微小孔4，量子点3 和碳纳米管2向植物细胞1内导入的状态。
另外，对于向靶植物细胞(Arabidopsis thaliana)内导入外来物质 时，表面活性剂n-辛基-P-D-葡萄糖苷(以下称为"OG")和细胞壁分 解酶纤维素酶对导入效率的影响进行研究。
在0.75% (w/v) 15% (w/v)的不同浓度的含有OG的细胞悬浊 液中分别添加如上所述配制的吸附CdSe颗粒的载持有纤维素酶的碳 纳米管(含CdSe的外来物质导入用溶液)，在25C培养3小吋。研究 培养后各自向植物细胞内的导入效率。另外，对使用不载持纤维素酶 的碳纳米管时的导入效率也用同样的方法进行研究。该结果表示于表1 中。 &table&table see original document page 16&/column&&/row&&table&
由表l所示的结果可知，含有OG的细胞悬浊液(以下称为"OG 溶液")的OG浓度越高，导入效率越大。
向10% (w/v)的OG溶液中添加时的导入效率最大，为20.2%。但是，向15n/。(w/v)的OG溶液中添加时的导入效率小于向10%(w/v) 的OG溶液中添加时的导入效率，为17.5%。另外，用不含OG的细胞 悬浊液尝试导入时，导入效率显著降低至3%。
另一方面，使用不含OG的细胞悬浊液并且使用不载持纤维素酶 的碳纳米管时，导入效率为0%，相对于此，即使在不载持纤维素酶的 碳纳米管的情况下，向含有10n/。(w/v) OG的OG溶液中添加时，导 入效率为9%。由此显示，高效率地向植物细胞内导入外来物质，与 OG和纤维素酶的存在，特别是与OG的存在有关。并且，显示导入效 率依赖于OG溶液的浓度。
另夕卜，准备不含细胞悬浊液的0.75。/。(w/v)、6。/。(w/v)和10%(w/v) 的OG溶液，向各OG溶液中添加载持有纤维素酶的碳纳米管(外来 物质导入用溶液)，在电子显微镜下观察拍摄碳纳米管的状态。
其结果，虽未图示，但是向0.75% (w/v)的OG溶液中添加时几 乎观察不到碳纳米管的无规运动，但是向6% (w/v)和10% (w/v)的 OG溶液中添加时观察到碳纳米管的平移、旋转等的布朗运动。另外， 可以确认该运动在向10% (w/v)的OG溶液中添加时最为活跃。
由此，可以确认，通过预先在细胞培养液或载持有纤维素酶的碳 纳米管(外来物质导入用溶液)中添加OG，能够进一步促进载持有纤 维素酶的碳纳米管的无规运动。
&第二实施例&
在本实施例中，作为靶细胞，使用来自采自高等植物拟南芥 (Arabidopsis thaliana)的胚轴的细胞悬浊液。该细胞悬浊液的配制方 法与上述第一实施例相同。
另一方面，向2.5mL的含有10% (w/v) n-辛基-P-D-葡萄糖苷的 MS培养基中添加与实施例1相同地制作的载持有纤维素酶的碳纳米管 2.5mg，得到本实施例的载持有纤维素酶的碳纳米管分散液。
将得到的分散液分别注入5个直径3.5cm的皮氏培养皿。接着， 在各皮氏培养皿中添加0.5mL上述细胞悬浊液。接着小心混合。
在本实施例中，作为外来物质，使用含有新霉素磷酸转移酶II基 因、半乳糖苷酶基因的市售的植物细胞用DNA载体(Ckmtech公司的 产品，pBI系载体，这里为pBI121)。具体而言，用MS培养基稀释该DNA载体，在各皮氏培养皿中添 加，使DNA浓度为2,5吗/mL、 5 |ug/mL、 7.5 |ig/mL、 10昭/mL、 12.5 pg/mL的5个阶段。
将如上所述的添加有碳纳米管和DNA载体的细胞悬浊液(处理 液)在25。C培养3小时。
培养结束后，将悬浊液中的细胞移至含有lmg/mL的2，4-二氯苯氧 乙酸(2,4-D，合成植物生长激素)和0.5mg/mL的激动素(N、呋喃甲 基腺嘌呤(N6-furfUryladenine)，细胞分裂素的类似物)的MS培养基 上，在25。C培养24小时。
之后，回收细胞，进一步将该回收的细胞在含有上述浓度的2，4-D 和激动素、还含有50|ig/L的卡那霉素的MS培养基上在25。C继续培养。
开始在含有卡那霉素的MS培养基上培养40天后，确认培养细胞 的生存。这显示上述DNA载体导入培养中的植物细胞中，该载体中 含有的卡那霉素耐性基因(新霉素磷酸转移酶II基因)进行表达。因 此，可以确认在本实施例中，通过本发明的方法，能够容易并且简便 地将目的外来物质(特别是基因等的活性分子)向植物细胞内导入。
另外，本实施例显示通过实施本发明的导入方法，能够容易地得到
转化植物细胞。
&第三实施例&
在本实施例中，作为外来物质，使用包含GFP (绿色荧光蛋白
Green Fluorescent Protein)表达基因的市售的植物细胞用DNA载体 (Invitrogen公司制品，pBI系载体，这里为pBI-GW-NOS载体)。另 外，除了变更外来物质以外，按照与第一实施例相同的方法，使用来 自釆自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的胚轴的细胞悬浊液和配制的载 持有纤维素酶的碳纳米管。
具体而言，向IO吗含有载持有纤维素酶的碳纳米管的外来物质导 入用溶液中添加pBI-GW-NOS载体，使得浓度达到750ng/ pL，在25°C 静置2小时。之后，向含有10% (w/v) OG的细胞悬浊液(每liuL含 10个细胞)lOmL中添加该溶液，在25'C培养。
培养48小时后，确认GFP的表达。图6是培养后的Arabidopsis thaliana细胞的三维重构图。由图6可以确认Arabidopsis thaliana细胞中绿色发光的GFP的表 达。另外，可以确认在细胞内部存在大量的碳纳米管。这显示 pBI-GW-NOS载体向植物细胞中导入，该载体中含有的GFP进行表达。 另外，本实施例的导入效率平均为6%。
由此，可以确认在本实施例中，通过本发明的方法，利用载持有 纤维素酶的碳纳米管，在靶植物细胞的细胞壁上开孔，能够快速且简 便地将目的外来物质导入细胞内。另外，本实施例显示通过实施本 发明的导入方法，能够容易地得到转化植物细胞。
&第四实施例&
在本实施例中，作为耙细胞，使用来自采自其它的高等植物豆科 的甘草(Glycyrrhizaglabra)的胚轴的细胞悬浊液，尝试载持有纤维素 酶的碳纳米管向细胞内的导入。该细胞悬浊液通过以下操作配制。培 养基使用Linsmaier& Skoog培养基(Linsmaier and Skoog medium, 以
下称为"LS"培养基)。其中，除了变更靶细胞以外，使用与第一实施 例同样的方法配制的载持有纤维素酶的碳纳米管和外来物质。
艮f]，将采自灭菌后的甘草种子的胚轴组织移至愈伤组织培养用LS 琼脂培养基上，该培养基通过在含有O.lmM的萘乙酸(NAA)、 l)aM 的苄基腺嘌呤(BA)的愈伤组织培养用LS培养基(pH5.8)上添加琼 脂而配制。这样，在暗条件下继续培养约3周，直至形成愈伤组织。 生出的愈伤组织每三周进行继代培养。培养在暗条件下以25。C进行。
接着，将愈伤组织添加到25mL的上述愈伤组织培养用LS培养基 中，通过使其缓慢转动，将愈伤组织分散，配制细胞悬浊液。培养在 暗条件下以25。C进行。细胞培养液(悬浊液)每四周进行继代培养。
向含有10% (w/v) OG的细胞悬浊液10mL中添加按照与第一实 施例相同的方法配制的吸附CdSe的载持有纤维素酶的碳纳米管(含有 CdSe的外来物质导入用溶液)，在25"C培养8小时。
培养后，用荧光显微镜观察细胞的状态。该观察时拍摄的照片表 示于图7A 图7D中。每一个图拍摄的都是同一视野。图7A是拍摄 绿色发光的吸附CdSe的载持有纤维素酶的碳纳米管的照片。图7B是 拍摄以DAPI染色的靶细胞的核酸的照片。图7C是拍摄载持有纤维素 酶的碳纳米管和核酸的照片。图7D是利用投射照明的亮视野观察照片。
由图7A 图7D可以确认，在细胞内、特别是在核内存在大量绿
、1, JJx_U4^ /,亇八tV neb厶/- T山/.丄、，/ ZrA" 、_X* I=t ~\ 1=1.
、 Arrj n/~t 上L十!、-
色次兀tr、j執付fl5T难系鹏tf、J碳别不苜。込並不守八细肥hJtf」载持有
纤维素酶的碳纳米管被输送至小泡(液泡)内，也在核内局部存在。 因此可以确认，通过本发明的方法，利用载持有纤维素酶的碳纳米管，
在靶植物细胞Glycyrrhiza glabra的细胞壁上开孔，能够快速且简便地 将目的外来物质导入细胞内。另外，本实施例显示通过实施本发明 的导入方法，能够容易地得到转化植物细胞。
如上所述，根据本发明，通过使用载持有细胞壁分解酶的碳纳米 管，能够取代现有的用于导入外来物质的繁琐且成功率低的方法，简 便且容易地将所期望的外来物质导入具有细胞壁的细胞(特别是植物 细胞)内。
另外，通过作为外来物质导入能够在靶细胞内表达的基因(多核 苷酸)或基因构筑物(载体等)，育b够容易地获得转化体。
产业上的可利用性
另外，本发明的方法不限于上述试验例，能够适用于例如将质粒 DNA以外的多核苷酸(反义寡DNA、 RNA等)、蛋白质(酶等)、或 者功能性肽、寡糖等的低分子物质作为封入物质的微小胶囊的制造。 另外，本方法中使用的基材能够与现有方法中使用的微片同样容易地 进行批量生产。
1.一种向具有细胞壁的细胞导入外来物质的方法，其特征在于，包括准备载持有至少一种细胞壁分解酶的碳纳米管的步骤；向含有所述细胞的处理对象供给所述载持有细胞壁分解酶的碳纳米管和作为导入对象的外来物质的步骤；通过与所述细胞接触的碳纳米管所具有的所述分解酶的作用，分解该细胞的细胞壁的步骤；和从所述细胞壁被分解的部位，向所述细胞内导入目的外来物质的步骤。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于 作为所述酶，使用至少一种的纤维素酶。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于 作为所述碳纳米管，使用全长(平均值)为10pm以下的碳纳米管。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于预先向含有表面活性剂的溶液中添加所述准备好的载持有细胞壁 分解酶的碳纳米管，配制外来物质导入用溶液，向含有所述细胞的处 理对象供给该配制得到的溶液。
5. 如权利要求1 4中任一项所述的方法，其特征在于所述细胞处理对象是含有所述细胞的处理液，该细胞处理液含有 表面活性剂。
6. 如权利要求4或5所述的方法，其特征在于 作为所述表面活性剂，使用n-辛基-p-D葡萄糖苷。
7. 如权利要求1 6中任一项所述的方法，其特征在于作为所述外来物质，导入多核苷酸。
8. 如权利要求1 7中任一项所述的方法，其特征在于 所述细胞是植物细胞。
9. 一种细胞，其特征在于.-通过权利要求1 7中任一项所述的方法，外来物质被导入细胞内。
10. 如权利要求9所述的细胞，其特征在于该细胞是植物细胞。
11. 如权利要求9或IO所述的细胞，其特征在于载持有细胞壁分解酶的碳纳米管与所述外来物质一起导入细胞内。
12. —种外来物质导入用的试剂盒，其用于向具有细胞壁的细胞导 入外来物质，其特征在于包括至少一种细胞壁分解酶、碳纳米管、和含有至少一种表面活 性剂的外来物质导入用溶液。
13. 如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于所述酶是至少一种的纤维素酶。
14. 如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于所述表面活性剂是n-辛基-(3-D-葡萄糖苷。
15. 如权利要求12 14中任一项所述的试剂盒，其特征在于 所述碳纳米管上载持有所述至少一种的细胞壁分解酶。
本发明的方法向具有细胞壁的细胞(1)导入外来物质(3)。该方法包括准备载持有至少一种细胞壁分解酶的碳纳米管(2)的步骤，向含有上述细胞(1)的处理液中供给载持有细胞壁分解酶的碳纳米管(2)和作为导入对象的外来物质(3)的步骤，通过与上述细胞(1)接触的碳纳米管(2)所具有的细胞壁分解酶的作用分解该细胞(1)的细胞壁的步骤，和通过细胞壁被分解的部位向细胞(1)内导入目的外来物质(3)的步骤。
文档编号C12N15/82GKSQ
公开日日 申请日期日 优先权日日
发明者I·M·F·S·E·巴尤米, 加地范匡, 渡庆次学, 马场嘉信 申请人:国立大学法人名古屋大学}