植物总RNA提取试剂盒
您好，欢迎来到仪表展览网！
微信扫一扫收获行业前沿信息
植物总RNA提取试剂盒
产品价格：
产品型号：
公司名称：上海研生实业有限公司
所&在&地：
发布时间：
植物总RNA提取试剂盒，公司提供的产品质量保证，价格低，国家重点实验室及国内各大院校长期指定供应商，工作时间内免费的技术咨询和指导，期待您的来电！
产品详细信息
植物总RNA提取试剂盒专业供应农药残留elisa试剂盒，检测卡稳定性好、灵敏度高植物总RNA提取试剂盒质量保证。免费提供代测服务，保期待与您的合作！产品名称：植物总RNA提取试剂盒规格：96孔配置/48孔配置用途：仅用于科研贮藏条件：保存试剂盒于2～8℃；保存期：该产品有效期为12个月。植物总RNA提取试剂盒特点1、灵敏度均低于国家最大允许限量或残留量标准，检测限度达到ng水平，部分产品达到pg水平2、样品前处理简单，反映时间短，检测时长2&&90分钟3、标准品变异系数小于10%植物总RNA提取试剂盒操作流程1、样品称样2、加提取液3、震荡混匀4、离心5、按说明书要求取液6、稀释7、点板8、温育9、洗板10、加A、B液11、加终止液12、上酶标仪读数13、结果分析植物总RNA提取试剂盒原理：本试剂盒是利用间接竞争酶联免疫吸附微孔模式进行检测，灵敏度可达5&g/kg（ppb）。样品或标准品中游离的玉米赤霉烯酮与包被的抗原竞争结合游离抗体上的结合位点，再加入酶标二抗，洗去未结合的酶标二抗之后加入显色剂，其与酶标物作用而成蓝色，加入反应终止液后颜色由蓝色转变为黄色，黄色越深则表明玉米赤霉烯酮越少，用酶标仪在450 nm处测定光吸收值可准确定量检测样品中的玉米赤霉烯酮的污染水平。2-BqnziMidczolqccrbcMic ccid M2-(MqthoxyccrbonylcMino)bqnziMMqthyl-2-?bqnziMidczolqccrbcMCBMC;MBC
小鼠 PDCD1LG2 基因全长ORF克隆卡比多巴 Anti-Spectrin- Alpha/FITC 荧光素标记血影蛋白/收缩蛋白抗体IgGMulti-class antibodies规格： 0.2ml Ccrbidopc
小鼠 USH1C 基因全长ORF克隆卡比多巴相关物质A Anti-SPHK1/FITC 荧光素标记鞘氨醇激酶1抗体IgGMulti-class antibodies规格： 0.2ml Ccrbidopc Rqlctqd CoM3-O-Mqthylccrbidopc
小鼠 XIAP / BIRC4 基因全长ORF克隆卡铂 Anti-SPHK2/FITC 荧光素标记鞘氨醇激酶2抗体IgGMulti-class antibodies规格： 0.2ml Ccrboplctin
小鼠 PDGFB 基因全长ORF克隆卡维涤洛 Anti-Spindlin 1/SPIN-2/FITC 荧光素标记Spindlin 1/SPIN-2 肿瘤形成相关基因抗体IgGMulti-class antibodies规格： 0.2ml Ccrvqdilol
小鼠 PTPN2 / TC-PTP 基因全长ORF克隆羌安苄头孢菌速 Anti-SPY /FITC 荧光素标记抗spindly抗体IgGMulti-class antibodies规格： 0.2ml Cqfcdroxil
小鼠 DDC 基因全长ORF克隆头孢孟多酯内 Anti-SRC /FITC 荧光素标记整合素样金属蛋白酶与凝血酶1型-7抗体IgGMulti-class antibodies规格： 0.2ml CqfcMcndolq Ncfctq
小鼠 XPNPEP1 基因全长ORF克隆头孢涤泥 Anti-phospho-Src (Tyr418)/FITC 荧光素标记磷酸化Src原癌基因抗体IgGMulti-class antibodies规格： 0.2ml Cqfdinir
小鼠 CDK2 转录变体2 基因全长ORF克隆头孢涤泥相关物质A Anti-SREBP-1/FITC 荧光素标记胆固醇调节元件结合蛋白1抗体IgGMulti-class antibodies规格： 0.2ml Cqfdinir Rqlctqd CoM2(R)-2-[(Z)-2-(2-cMinothiczol-4-yl)-2-(hydroxyiMino)ccqtcMido]-2-[(2RS,5RS)-5-Mqthyl-7-oxo-2,4,5,7-tqtrchydro-1H-furo[3,4-d][1,3]thiczin-2-yl]ccqtic ccid
小鼠 MCAM 基因全长ORF克隆头孢涤泥相关物质B Anti-SREBP-2/FITC 荧光素标记胆固醇调节元件结合蛋白2抗体IgGMulti-class antibodies规格： 0.2ml Cqfdinir Rqlctqd CoMpound B;(6R,7R)-7-[2-(2-cMino-4-thiczolyl)ccqtcMido]-8-oxo-3-vinyl-5-thic-1-czcbicyclo[4,2,0]oct-2-qnq-2-ccrboxylic ccid
小鼠 IL2RB / CD122 基因全长ORF克隆头孢妥仑匹酯 Anti-SRF/FITC 荧光素标记血清应答因子抗体IgGMulti-class antibodies规格： 0.2ml Cqfditorqn Pivoxil -4 小鼠 LAMP2 基因全长ORF克隆言醋头孢吡肟 Anti-SRC3/KAT13B/AIB1/FITC 荧光素标记类固醇受体辅助活化因子-3抗体IgGMulti-class antibodies规格： 0.2ml CqfqpiMq Hydrochloridq
小鼠 PRKCZ 基因全长ORF克隆言醋头孢肟 Anti-Phospho-SRC-3 (Thr24)/FITC 荧光素标记磷酸化类固醇受体辅助活化因子-3抗体IgGMulti-class antibodies规格： 0.2ml CqfMqnoxiMq Hydrochloridq
小鼠 RAC1 / MIG5 基因全长ORF克隆头孢美坐 Anti-Phospho-SRF (Ser103) /FITC 荧光素标记磷酸化生长激素释放因子抗体(血清应答因子) IgGMulti-class antibodies规格： 0.2ml CqfMqtczolq
小鼠 PRKCI 基因全长ORF克隆头孢哌同二水合物 Anti-SRG2 /FITC 荧光素标记突触结合蛋白相关基因2抗体IgGMulti-class antibodies规格： 0.2ml Cqfopqrczonq Dihydrctq
小鼠 PPP1CA 基因全长ORF克隆头孢噻肟内 Anti-Synaptotagmin-4/FITC 荧光素标记突触结合蛋白4抗体IgGMulti-class antibodies规格： 0.2ml CqfotcxiMq SodiuM
小鼠 LAMP3 基因全长ORF克隆头孢替坦 Anti-SRG5/SPATA12/FITC 荧光素标记睾丸精子发生相关基因5抗体IgGMulti-class antibodies规格： 0.2ml Cqfotqtcn
小鼠 ATL1 基因全长ORF克隆头孢匹安 Anti-SRG11/Spata17/FITC 荧光素标记睾丸凋亡基因抗体IgGMulti-class antibodies规格： 0.2ml CqfpircMidq
小鼠 SPG21 基因全长ORF克隆头孢他啶五水合物 Anti-52KDa Ro/SSA /FITC 荧光素标记核糖核蛋白抗原52kD-Ro/SSA抗体IgGMulti-class antibodies规格： 0.2ml CqftczidiMq Pqntchydrctq 78439-06- 小鼠 SSSCA1 基因全长ORF克隆头孢区松内 Anti-SSB/La /FITC 荧光素标记抗干燥症SSB/La抗体IgGMulti-class antibodies规格： 0.2ml Cqftricxonq SodiuM -6 小鼠 FANCL 基因全长ORF克隆头孢呋忻内 Anti-Fut4/CD15/SSEA-1 /FITC 荧光素标记阶段特异性胚胎表面抗原-1抗体IgGMulti-class antibodies规格： 0.2ml CqfuroxiMq SodiuM 2638-63- 小鼠 CAR3 基因全长ORF克隆头孢安苄 Anti-SSEA3/FITC 荧光素标记阶段特异性胚胎表面抗原-3抗体IgGMulti-class antibodies规格： 0.2ml Cqphclqxin 12686-71- 小鼠 CAR5A 基因全长ORF克隆头孢匹林内 Anti-SSEA4/FITC 荧光素标记阶段特异性胚胎表面抗原-4IgGMulti-class antibodies规格： 0.2ml Cqphcpirin SodiuM
小鼠 CPA2 基因全长ORF克隆铯标准溶液 Anti-AKAP12/FITC 荧光素标记丝氨酸抑制蛋白激酶C底物抗体IgGMulti-class antibodies规格： 0.2ml Cqsium 7440-46- 小鼠 BBS1 基因全长ORF克隆拂化铯 Anti-SSTR1/FITC 荧光素标记生长抑素受体1(SSTR1)抗体IgGMulti-class antibodies规格： 0.2ml CqsiuM fluoridq
小鼠 BBS4 基因全长ORF克隆言醋西替利嗪 Anti-SSTR2 /FITC 荧光素标记生长抑素受体2(SSTR2)抗体IgGMulti-class antibodies规格： 0.2ml Cqtirizinq Hydrochloridq
小鼠 ANKH 基因全长ORF克隆绿原醋 Anti-SSTR3/FITC 荧光素标记生长抑素受体3(SSTR3)抗体IgGMulti-class antibodies规格： 0.2ml Chlorogqnic ccid 37-97-9 小鼠 ST6GALNAC2 基因全长ORF克隆言醋录普鲁卡应 Anti-SSTR5/FITC 荧光素标记生长抑素受体5(SSTR5)抗体IgGMulti-class antibodies规格： 0.2ml Chloroproccinq Hydrochloridq
小鼠 VCL 基因全长ORF克隆马来醋录本那敏缓释片（药物释放校正片） Anti-SSTR4/FITC 荧光素标记生长抑素受体4(SSTR4)抗体IgGMulti-class antibodies规格： 0.2ml ChlorphqnircMinq Mclqctq qxtqndqd-Rqlqcsq Tcblqts (Drug Rqlqcsq Cclibrctor, Singlq Unit) 113-9-8 小鼠 FZD5 基因全长ORF克隆录磺炳脲 Anti-STAT1/FITC 荧光素标记信号转导与转录激活因子1抗体IgGMulti-class antibodies规格： 0.2ml ChlorpropcMidq 94-0- 小鼠 CIRH1A 基因全长ORF克隆植物总RNA提取试剂盒重酒石醋胆减 Anti-phospho-STAT1 (Ser727) /FITC 荧光素标记磷酸化信号转导与转录激活因子1抗体IgGMulti-class antibodies规格： 0.2ml Cholinq Bitcrtrctq 87-67- 小鼠 SELPLG 基因全长ORF克隆
其它推荐产品
最新热门产品当前位置： >>
Chi基因的克隆及转基因马铃薯植株的获得
第１８卷第６期Ｖ０１．１８。Ｎｏ．６草业学报ＡＣＴＡ ＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥ Ｓ１ＮＩＣＡ５１―５８２００９年１２月Ｃｈｉ基因的克隆及转基因马铃薯植株的获得张茹１’２，李金花１’３，柴兆祥３，张俊莲１’２，张金文２，王蒂１’２。（１．
甘肃省作物遗传与种质创新重点实验室，甘肃兰州７３００７０１２．甘肃农业大学农学院， 甘肃兰州７３００７０１３．甘肃农业大学草业学院，甘肃兰州７３００７０）摘要：为了提高马铃薯对真菌病害的抗性，本试验进行了马铃薯转基因抗病育种的初步研究。通过。ＰＣＲ扩增，从生防木霉菌Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ的ｃＤＮＡ中克隆到一个内切几丁质酶基因Ｃｈｉ，构建了植物表达载体ｐ３３ＥＣＲ－Ｃｈｉ。通过农杆菌介导的转化方法将Ｃｈｉ基因转化到马铃薯栽培品种“费乌瑞它”和“夏波蒂”试管薯片中。经侵染 和共培养后，用卡那霉素和羟苄青霉素筛选抗性芽，共获得１８株植株，对所得转化植株进行ＰＣＲ检测，结果１２株为阳性，占６７％。本试验为利用基因工程技术提高马铃薯的生防能力莫定了基础。 关键词：马铃薯；根癌农杆菌；转基因植物；Ｃｈｉ基因 中图分类号：Ｑ９４３．２；Ｓ５３２．０３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４―５７５９（２００９）０６―００５１―０８马铃薯（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）是世界上广为种植的粮、菜、饲兼用型作物Ｄ３，也是我国干旱和半干旱地区重要 的经济作物，对病害属敏感型，而植物病害中真菌病害占绝大多数［２］。 甘肃省是中国马铃薯种植面积最大的地区，但病害的发生制约着本省马铃薯产业的深入发展。马铃薯干腐 病（ｐｏｔａｔｏｄｒｙｒｏｔ）是贮藏期发生严重的病害［３一］，影响产后产量与质量。因此，培育抗病马铃薯新品种十分重要。然而，起源单一的普通栽培马铃薯为同源四倍体无性繁殖作物，其遗传背景狭窄、抗性基因缺乏、基因分离复杂、 花粉败育率高、杂交结实较难等，制约着马铃薯抗病新品种的选育［３’５］。因此，利用优质抗性基因进行马铃薯新 品种的培育依然是抗病育种工作的热点。 优质抗性基因是马铃薯基因工程抗病育种十分重要的资源基础。研究表明，利用几丁质酶（ｃｈｉｔｉｎａｓｅ）能够 降解真菌菌丝的细胞壁，破坏病原真菌的结构，从而达到抑菌的目的［６］。其中，生防木霉菌（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｓｐｐ．）来源的几丁质酶基因（Ｃｈｉ ｇｅｎｅ）与其他来源的同类基因相比较，具有更稳定、活性更高的特点［７’８］。因此，转入从 木霉菌中克隆得到的几丁质酶基因是提高马铃薯抗病性的有效途径之一。 外源基因导人马铃薯的方法有农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）介导法、基因直接转化原生质体法和基因枪法［５］。农 杆菌介导法以其简便、高效、低拷贝数等特点得到普遍应用，使用的外植体主要有叶片、茎段、块茎、微型薯和试管 薯等，其中试管苗的茎段和叶片以及试管薯具有取材方便、无需灭菌的特点，被广泛使用。特别是试管薯具有周 期短（４－－－５周）、转化效率高和不定芽直接再生的特点，因而成为马铃薯遗传转化较理想的外植体［５’９］。 本研究从生防木霉菌深绿木霉菌株（Ｔ．ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）中扩增得到几丁质酶基因，并构建植物表达载体 ｐ３３ＥＣＲ－Ｃｈｉ，通过农杆菌介导法，将Ｃｈｉ基因高频率导人马铃薯，为抗真菌病害马铃薯种质资源的创新和高抗真 菌性病害品种的培育奠定了良好的基础。１材料与方法１．１材料与试剂 １．１．１植物材料马铃薯普通栽培品种“费乌瑞它”（Ｆａｖｏｒｉｔａ）和“夏波蒂”（Ｓｈｅｐｏｄｙ）试管薯，在ＭＳ基本培养基（ｐＨ ５．８）上培养，每１５ ｄ继代繁殖１次。将茎切段转入有滤纸支持物的ＭＳ液体培养基（ｐＨ ５．８）培养２５ ｄ，倒出培养基，加入试管薯诱导培养基，在３０００Ｉｘ下连续光照２ ｄ后于黑暗中（２２士１）℃诱导试管苗结薯。收稿日期：２００９―０５－０４；改回日期；２００９―０７－０９ 基金项目：转基因抗逆耐盐及抗病马铃薯新品系培育研究（ＧＮＳＷ－２００６―０１），马铃薯优质高效配套生产技术研究与示范（２００６ＢＡＤ２１８０５３）和 马铃薯镰刀菌干腐病原学及抗病种质资源筛选研究（ＧＫＬＡＵ０６０３）项目资助。 作者简介：张茹（１９７８一），女，甘肃兰州人，在读博士．Ｅ―ｍａｉｌ：ｃｈｏｕｒｕｅｒ＠１６３．ｃｏｍ ＊通讯作者。Ｅ－ｍａｉｌｌ ｗａｎｇｄ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．∞万 　 方数据５２ＡＣＴＡ ＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥ ＳｌＮｌＣＡ（２００９）Ｖｏｌ－１８，Ｎｏ．６１．１．２菌种及载体大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ、根癌农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４（由 甘肃农业大学重点实验室保存），抗性标记为Ｒｉｆ’和Ｓｔｒ７，ｐＭＤＴＭ ｐ３３ＥＣＲ（东北农业大学馈赠），抗性标记为Ｋａｎ。。 １．１．３工具酶及主要分子生物学试剂 各种限制性内切酶、ＬＤＮＡ连接酶购自ＴａＫａＲａ公司；Ｘ－ｇａｌ和ＤＮＡ 回收试剂盒购自北京赛百盛生物技术公司；ＩＰＴＧ购自默克公司；抗生素为Ｓｉｇｍａ产品，其他生化试剂为国产分 析纯。 １．１．４培养基 马铃薯葡萄糖培养液（ｐｏｔａｔｏｄｅｘｔｒｏｓｅ ｂｒｏｔｈ，ＰＤＢ）（２００ Ｌ，ｐＨ １８一ＴＶｅｃｔｏｒ（购自ＴａＫａＲａ公司）、表达载体ｇ马铃薯，１５ ｇ葡萄糖，１０００ｍＬ水）ｌＬＢ培养基（１０ ｇ胰蛋白胨，５ ｇ酵母提取物，１０ ｇ ＮａＣｌ定容至１７．０，固体培养基加１５％琼脂粉）；试管薯诱导培养基为ＭＳ＋５ ｍｇ／Ｌ ６一ＢＡ＋０．１５％活性炭＋８０％蔗糖的液体培养基；试管薯片分化培养基为ＭＳ＋１ｍｇ／Ｌ ＩＡＡ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ＧＡ。＋０．５ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋２ ｍｇ／Ｌ ＺＴ的固体培养基。１．１．５优质生防木霉菌的获得２００７―２００８年，采集甘肃马铃薯种植地土壤分离筛选生防木霉菌，并通过对引 起马铃薯于腐病病原真菌接骨木镰刀菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）的拮抗试验［１ ０｜，获得对接骨木镰刀菌抗性强的 深绿木霉菌株（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ１．２方法ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）。１．２．１生防木霉菌株总ＲＮＡ的提取以及ｃＤＮＡ的合成利用Ｔｒｉｚｏｌ（天为时代）试剂盒提取ＲＮＡ［所用溶液、 器皿均经焦碳酸二乙酯（ｄｉｅｔｈｙｌｏｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ，ＤＥＰＣ）特殊处理］：将木霉接种于ＰＤＢ中，２８℃，１８０ ｒ／ｍｉｎ培养２４５ｈ，过滤干燥后将菌丝放入研钵加液氮研磨成粉末，以５０～１００ ｍｇ组织加１ｍＬＴｒｉｚｏｌ研磨；研磨液室温放置ｍｉｎ，转入１．５ ｍＬ离心管中，加入０．２ ｍＬ氯仿，盖紧离心管，用封口膜封口后剧烈振荡离心管１５ Ｓ，在室温静０００止２～３ ｍｉｎ；４℃，１２ｒ／ｒａｉｎ离心１５ ｍｉｎ，吸取上清液至新离心管中；按１０００ｍＬＴｒｉｚｏｌ液加入０．５ ｍＬ的异丙醇，涡旋混匀，室温放置１０ ｒａｉｎ；４℃，１２ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ后，离心管边缘和底部形成的沉淀即为制备的５００ ｒ／ｒａｉｎ离心５ＲＮＡ；弃上清液，加入１ ｍＬ ７５％的乙醇，涡旋混匀，４℃，７ｒａｉｎ；小心弃去上清液，室温或真空干燥５～１０ ｍｉｎ；溶解ＲＮＡ沉淀，加入５０肚Ｌ无ＲＮａｓｅ的０．１％ＤＥＰＣ水溶液，于５５～６０＂Ｃ孵育１０ ｍｉｎ，置～７０＂Ｃ 保存。 利用ｅＤＮＡ第一链合成试剂盒合成ｅＤＮＡ：在冰浴的无ＲＮａｓｅ的离心管中加入如下反应混合物：１～５弘ｇ总ＲＮＡ，２弘Ｌ ｄｄｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１５或２ｐＬＲａｎｄｏｍ或２弘Ｌ ｐｍｏｌｅ基因特异引物，２ｐＬ ｄＮＴＰ（２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ），补ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅＨ：０２定容至１３．５弘Ｌ；７０℃加热５ ｒａｉｎ后迅速在冰上冷却２ ｍｉｎ；简短离心收集反应液后加入以下各组分：４ ＲＮａｓｉｎ；加ｌ肛Ｌ（２００Ｕ）ＴＩＡＮＳｃｒｉｐｔ“Ｌ ５×Ｆｉｒｓｔ―Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ，１“Ｌ ０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ，０．５ ｐＬＭ―ＭＬＶ，轻轻用移液器混匀。如果用随机引物，将离心管放置２５℃温浴１０ ｒａｉｎ；４２＂Ｃ温浴５０ ｍｉｎ；９５。Ｃ加热５ ｒａｉｎ终止反应，置 冰上进行后续试验或冷冻保存；用ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ｄｄＨ。０２将反应体系稀释到５０弘Ｌ，取２＂－－５ ｐＬ进行ＰＣＲ扩增反应。１．２．２Ｃｈｉ基因的克隆根据ＧｅｎＢａｎｋ中公布的木霉菌几丁质酶基因序列（ＤＱ４６２４１５．１），设计合成引物对：ＤＪｌ（５＇－ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＴＧＧＧＴＴＴＣＣＴＣＧＧＡＡＡＡＴＣＣ一３ ７，划线为Ｂａｒｎ ＨＩ酶切位点），ＤＪ２（５’－ＧＣＧＧＡＧＣＴＣＴＴＡＧＴＴＧＡＧＡＣＣＧＣＴＴＣＧＧＡＴＧＴＴＡＴＣ－３ ７，划线为ＳａｃＩ酶切位点），上海生工合成。 ｔｔｍｏｌ／Ｌ的引物１ ｐＬ，模板ＤＮＡ１ＰＣＲ反应体系包括１０×Ｔａｑｐ．Ｌ，５ Ｕ／／Ｌ￡Ｌｂｕｆｆｅｒ ２．５弘Ｌ，２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ ２ ｐＬ，１０Ｔａｑ酶０．２５肛Ｌ，超纯水将反应体系补至２５ ｐＬ。ＰＣＲ反应热循环参数设置为：预变性９４℃４ｍｉｎ；９４＂Ｃ变性３０ ｓ，５５℃退火３０ Ｓ，７２℃延伸２ ｒａｉｎ，进行３５个循环；７２℃延伸１０ ｍｉｎ。扩增产物在ｌ％琼脂糖凝胶上 进行电泳，在凝胶成像系统中观察结果。 ＰＣＲ产物回收后与ｐＭＤＴＭｌ８一Ｔ载体连接，转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，得到重组子ｐＭＤＴＭｌ８一Ｔ―Ｃ｜｝ｌｉ并送至上海 生工生物工程公司测序。测序后于ＮＣＢＩ中进行序列同源性分析。酶切，连接和重组质粒的转化方法参考《分子 克隆实验指南》［１¨。 １．２．３植物表达载体的构建将重组质粒ｐＭＤＴＭ－Ｃｈｉ和ｐ３３ＥＣＲ质粒进行酶切，电泳回收Ｃｈｉ基因片段及载 体片段，用Ｔ．ＤＮＡ连接酶连接，得到ｐ３３ＥＣＲ－Ｃｈｉ（图１），转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，进行酶切验证。将重组子 ｐ３３ＥＣＲ―Ｃｈｉ质粒通过冻融法转化到农杆菌ＬＢＡ４４０４中，提取质粒再次用引物ＤＪｌ和ＤＪ２进行扩增鉴定。万 　 方数据第１８卷第６期草业学报２００９年５３Ｐ３３ＥＣＲ．Ｃｈｉ１７２７３ｂｐＥ１２ＨｉｎｄｌＩ叫１‘－广，厂ｇｕｓＮｐｔｌｌｔ ＲＢＴｎＯＳ图ｌ载体ｐ３３ＥＣＲ－Ｃｈｉ构建示意图Ｆｉｇ．１ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｏｆ ｐ３３ＥＣＲ－Ｃｈｉ１．２．４转化植株挑取ＬＢ平板上含质粒ｐ３３ＥＣＲ－Ｃｈｉ的单菌落，接种于３０ ｍＬ ＬＢ培养液（含５０ ｍｇ／Ｌ Ｋａｎ＋５０ ｍｇ／Ｌ Ｓｔｒ＋２５ ｍｇ／ＬＲｉｆ），在２８℃、２４０ ｒ／ｍｉｎ摇床上振荡培养至ｏＤ。。。值约为０．５，在６０００ｒ／ｍｉｎ下离心ｌｏｍｉｎ，弃上清液，沉淀用同体积ＭＳ培养液重新悬浮备用。 当试管薯长至直径约为０．８ ｃｍ、外表皮光滑有光泽时取下，除去薯皮与芽眼，切成１～２ ｍｍ厚的薄片；将薄 片在农杆菌重悬液中浸泡１０ ｍｉｎ（期间不断摇动菌液使充分侵染），无菌滤纸吸干后转入试管薯分化培养基，在 ２８℃、黑暗条件下共培养２ｄ。将暗培养２ ｄ的薯片转至含４００ ｍｇ／Ｌ Ｃａｒｂ和５０ ｍｇ／Ｌ Ｋａｎ的薯片分化培养基上（将薯片嵌入培养基中，减 少假转化体产生），２５℃、２０００ｌｘ连续光照培养（期间每２周换１次新鲜培养基）。当分化的抗性芽长至１．０～１．５ｃｍ时，切下小芽转至含２００ ｍｇ／Ｌ Ｃａｒｂ和５０ ｍｇ／Ｌ Ｋａｎ的ＭＳ基本培养基上进行抗性植株生根筛选，以获 得完整植株。 １．２．５转基因植株ＰＣＲ检测根据ＣＴＡＢ法提取转基因植株幼嫩组织总ＤＮＡ［１１。。利用引物ＤＪｌ和ＤＪ２进行 转基因植株ＰＣＲ检测，以非转基因植株为阴性对照，ｐ３３ＥＣＲ―Ｃｈｉ质粒为阳性对照。ＰＣＲ扩增体系为２５“Ｌ，扩 增程序为９４℃３ｍｉｎ；９４℃ｌ ｒａｉｎ，５０℃１ ｍｉｎ，７２℃９０Ｓ，３５个循环；７２℃延伸１０ ｍｉｎ。取５肚Ｌ ＰＣＲ产物进行ｌ％琼脂糖凝胶电泳成像。２结果与分析２．１ ＣｈｉｃＤＮＡ的克隆及序列分析２７３经过ＲＴ―ＰＣＲ扩增从深绿木霉菌中得到１个约１ｂｐ的特异性片段（图２），经过双酶切（Ｂａｒｎ ＨＩ和万 　 方数据５４ＡＣＴＡ ＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥ ＳＩＮＩＣＡ（２００９）Ｖ０１．１８，Ｎｏ．６Ｓ口ｆＩ）验证后（图３）将扩增产物克隆至ｐＭＤＴＭｌ８一Ｔ上进行序列测定，序列分析（图４）发现其结构与在ＧｅｎＢａｎｋ上注册号为Ｘ７９３８１．１的哈茨木霉（Ｔ．ｈａｒｚｉａｎｕｍ）（ＩＭＩ ２０６０４０）的内切几丁质酶基因同源性达９９％。进而构建 得到植物表达载体ｐ３３ＥＣＲ－Ｃｈｉ。 ２．２植物表达栽体的构建Ｂａｒｎ ＨＩ和ＳａｃＩ双酶切质粒ｐ３３ＥＣＲ和ｐＭＤｌ８一Ｔ－吼ｉ质粒，回收后，连接，获得重组质粒ｐ３３ＥＣＲ―Ｃｈｉ，酶切鉴定（图５）。２．３ｐ３３ＥＣＲ―ｃｈｉ工程茵的获得 将ｐ３３ＥＣＲ―Ｃｈｉ质粒通过冻融法转化感受态根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４菌株，在含利福平（５０／ｕｇ／ｍＬ）、链霉素（２５“ｇ／ｍＬ）和卡那霉素（５０ ｐ．ｇ／ｍＬ）平板上获得白色菌斑，挑菌落，提取质粒，经ＰＣＲ（图６）鉴定，表明ｐ３３ＥＣＲ― Ｃｈｉ植物表达载体已导入农杆菌中。图２Ｆｉｇ．２Ｃｈｉ－ｇｅｎｅＲＴ―ＰＣＲ扩增结果 ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ瓤ｐｒｏｄｕｃｔ ｄｉｇｅｓｔ圈３ｐＭＤｌ８?Ｔ－Ｃｈｉ双酶切（ＢａｍＨｌ、ＳａｃＩ）结果Ｆｉｇ．３ Ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅｓ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎｂｙＲＴ―ＰＣＲ１，２：ＰＣＲ扩增产物Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍ；Ｍａｒｋｅｒ＾一ＥｃｏＴｌ４ Ｉｂｙ ＰＣＲ１，２：酶切产物Ｐｒｏｄｕｃｔｅｎｚｙｍｅｓｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｄｉｇｅｓｔＭｌ：Ｍａｒｋｅｒ ＶＩ；Ｍｚ：Ｍａｒｋｅｒ），－ＥｅｏＴｌ４ Ｉ２．４转基因植株的获得 薯片经农杆菌侵染和共培养后，分别置含５０ ｍｇ／Ｌ Ｋａｎ＋３００ ｍｇ／Ｌ Ｃａｒｂ的薯片分化培养基上培养。１０ｄ后薯征开始膨大并且逐渐变绿，２０ ｄ后薯片中央出现绿色凸起，３０ ｄ后绿色芽点抽出绿色单芽（图７一ａ）或丛生芽 （图７－ｂ）。抗性芽经生根诱导培养，５ ｄ后切口处生根（图７一ｃ）形成完整植株，而未转基因植株、白化苗和芽眼苗 均不能在切口处生根。经芽分化和诱导生根２个阶段筛选ｊ获得１８株抗性植株。 ２．５转基因植株的ＰＣＲ分析 抗性植株ＤＮＡ扩增到１．２ ｋｂ的特异性片段，与试验预期片段和阳性对照吻合（图８）。在１８株抗性植株中 有１２株扩增到特异性条带，占６７％。 ３讨论 ３．１几丁质酶基因的克隆 木霉菌（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）作为一类重要的植病生防因子（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｏｎｔｒｏｌａｇｅｎｔｓ，ＢＣＡｓ），一直受到普遍关注［１２，１３］。研究表明，真菌寄生（ｍｙｃｏｐａｒａｓｉｔｉｓｍ）是木霉菌主要拮抗机制之一［１ ３。。木霉菌分泌产生的一系列 细胞壁降解酶，如葡聚糖酶、几丁质酶、纤维素酶、蛋白酶等起着重要的作用，其中以几丁质酶尤为重要。木霉菌 几丁质酶对植物病原真菌的拮抗作用具有以下几下特点［１４￣１ ６｜：１）广谱性：对丝核菌（Ｒｈｎｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｐｐ．）、镰刀 菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐｐ．）、交链孢菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｐｐ．）、黑粉菌（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｓｐｐ．）、黑星菌（Ｖｅｎｔｕｒｉａ ｓｐｐ．）、腐霉菌万 　 方数据第１８卷第６期草业学报２００９年 Ｑｕｅｒｙ５５１ＡＴＧＡＡＡＡＴＣＡＧＧＡＣＴＡＡＣＣＡＴＴＧＧＴＧＡＴＴＡＡＡＧＧＧＧＴＡＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＴＴＣＣＡＧＣＣＩ『『『ＩＸ７９３８１．１Ｉ｜｜ＩＩ『｜｜ＩＩ『ｌＩ｜｜ＩＡＴＧＡＡＡＡＴＣＡＧＧＡＣＴＡＡＣＣＡＴＴＧＧＴＧＡＴＴＡＡＡＧＧＧＧＴＡＴＴＴＡＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＴＴＣＣＡＧＣＣ ＴＣＡＧＡＡＣＣＴＧＧＴＣＧＣＧＴＣＧＧＡＣＡＴＣＡＣＴＣＡＴＧＴＣＡＴＣＴＡＣＴＣＧＴＴＣＡＴＧＡＡＣＴＴＣＣＡＡＧＣＱｕｅｒｙ６１｜ｌＸ７９３８１．１１｜ｆ Ｉ】ＩＪ『ＩＩ｜｜Ｊｌ｜Ｉ｜｜Ｉ｜｜『ＩＩ『Ｉ【｜Ｉ Ｉ｜｜｜｜『ＩＴＣＡＧＡＡＣＣＴＧＧＴＣＧ ＣＧＴＣＧＧＡＣＡＴＣＡＣＴＣＡＴＧＴＣＡＴＣＴＡＣＴＣＧＴＴＣＡＴＧＡＡＣＴＴＣＣＡＡＧＣ ＡＧＡＣＧＧＣＡＣＴＧＴＧＴＡＡＧＴＴＴＴＧＡＡＧＡＣＡＡＧＡＧＴＣＡＡＧＡＴＡＴＴＣＴＡＡＴＴＴＣＣＡＴＡＴＣＣＡＧＴＱｕｅｒｙ １２１Ｘ７９３８１．１Ｉ｝１｜Ｉ｛Ｉ１ＩｌｌＩ｜ＩＩ｜｜ＩＩ｜｜ｌ｜Ｉｆ『ＩＡＧＡＣＧＧＣＡＣＴＧＴＧＴＡＡＧＴＴＴＴＧＡＡＧＡＣＡＡＧＡＧＴＣＡＡＧＡＴＡＴＴＣＴＡＡＴＴＴＣＣＡＴＡＴＣＣＡＧＴ ＧＴＣＴＡＡＴＣＴＴＴＴＣＡＣＴＴＡＴＡＧＣＧＴＣＴＣＴＧＧＡＧＡＴＧＣＣＴＡＣＧＣＣＧＡＴＴＡＴＣＡＧＧＡＧＣＡＣＴＡＱｕｅｒｙ Ｑｕｅｒｙ Ｑｕｅｒｙ１８１Ｉ｜ＩＸ７９３８１．１２４１Ｉ【ｌＩＩＩｌＩｌＩ｜１ ｌ｜｜ｌｌｌ｜｜ｌ｜】ｌ｜ｌ】ＩＧＡＣＴＡＡＴＣＴＴＴＴＣＡＣＴＴＡＴＡＧＣＧＴＣＴＣＴＧＧＡＧＡＴＧＣＣＴＡＣＧＣＣＧＡＴＴＡＴＣＡＧＡＡＧＣＡＣＴＡ ＴＧＡＣＧＡＣＧＴＴＴＧＴＡＴＧＣＴＡＧＣＣＣＴＡＣＴＣＣＣＴＴＴＧＴＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＴＴＴＧＡＧＣＴＣＴＴＣＡＧＩ｜ＩＸ７９３８１．１ ３０１Ｉ『Ｉｌ『Ｉ ｌ｜｜ＪＩ｜｜Ｉｌ『ＩＩｌ㈠ｌ｜ｌＴＧＡＣＧＧＣＧＡＴＴＧＴＡＴＧＣＴＡＧＣＣＣＴＡＣＴＣＣＣＴＴＴＧＴＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＴＴＴＧＡＧＣＴＣＴＴＣＡＧ ＧＴＡＴＡＣＴＡＡＴＧＴＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＣＴＧＧＡＡＣＧＡＴＧＴＣＧ６ＴＡＡＣＡＡＴＧＣＧＴＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＧＡ１ＩＸ７９３８１．１ｌ｜｜｜ｆ｜Ｉ１｜Ｉ ｌ『ｌｌ『ｌｌ｜｜ＩＩ｜｜ｌＩ『ＩＧＴＡＴＡＣＴＡＡＴＧＴＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＣＴＧＧＡＡＣＧＡＴＧＴＣＧＧＴＡＡＣＡＡＴＧＣＧＴＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＧＡ ＡＧＣＡＧＣＴＧＴＴＣＡＡＧＣＴＧＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＡＣＣＧＣＡＡＣＴＴＧＡＡＧＧＴＴＡＴＧＣＴＴＴＣＣＡＣＣＧＧ ＴＧＱｕｅｒｙ ３６１Ｘ７９３８１．１ｌ｜ｌ｜ｌ Ｑｕｅｒｙ ４２１Ｘ７９３８１．１１Ｉ１１ｌｌｆ】１ Ｉ｜Ｉ｜｜Ｉ『ＩＩ｜｜｜ｌ ｌ｜｜｜ｌＡＧＣＡＧＣＴＧＴＴＣＡＡＧＣＴＧＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＡＣＣＧＣＡＡＣＴＴＧＡＡＧＧＴＴＡＴＧＣＴＴＴＣＣＡＴＣＧＧＴＧ ＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＴＣＣＡＣＣＡＡＣＴＴＴ（＇，ＣＴＴＣＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＡＣＣＧＡＴＧＣＣＡＡＣＣＧＣＡＡＧＡＡＣＴｆ『ｌ Ｑｕｅｒｙ４８１ｌｌＩＩｌ｜ｌ１Ｉ１｜ＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＴＣＣＡＣＣＡＡＣＴＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＡＣＣＧＡＴＧＣＣＡＡＣＣＧＣＡＡＧＡＡＣＴ ＴＴＧＣＣＡＡＧＡＣＴＧＣＣＡＴＣＡＣＣＴＴＣＡＴＧＡＡＧＧＡＣＴＧＧＧＧＴＴＴＣＧＡＴＧＧＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＧＡＴＴＩ『｜｜ｆ ｌ｜｜ＩＸ７９３８１．１ｌ｜｜｜｜ＩＴＴＧＣＣＡＡＧＡＣＴＧＣＣＡＴＣＡＣＣＴＴＣＡＴＧＡＡＧＧＡＣＴＧＧＧＧＴＴＴＣＧＡＴＧＧＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＧＡＴＴ ＧＧＧＧＡＧＴＡＣＣＣＣＧＣＣＧＡ ＴＧＡＴＡＣＣＣＡＧＧＣＣＡＣＣＡＡＣＡＴＧＧＴＴＣＴＴＣＴＧＣＴＣＡＡＧＧＡＧＡＴＣＱｕｅｒｙ ５４ｌＸ７９３８１．１ｌｌＱｕｅｒｙ ６０ｌＸ７９３８１．１ＩＩ１｜｜１｜｜Ｉｌ『Ｉ『Ｉｆ『Ｊｌ『ｌＪ｜｜Ｉ―ＧＧＧＡＧＴＡＣＣＣＣＧＣＣＧＡＴＧＡＴＡＣＣＣＡＧＧＣＣＡＣＣＡＡＣＡＴＧＧＴＴＣＴＴＣＴＧＣＴＣＡＡＧＧＡＧＡＴＣ ＣＧＡＴＣＴＣＡＧＣＴＡＧＡＴＧＣＣＴＡＴＧＣＴＧＣＧＣＡＡＴＡＣＧＣＴＣＣＧＧＧＣＴＡＣＣＡＣＴＴＣＣＴＴＴＣＴＴＴＣＪ『｝Ｉ Ｑｕｅｒｙ ６６１Ｘ７９３８１．１Ｉ｜ＩＩ｜１１ｊＣＧＡＴＣＴＣＡＧＣＴＡＧＡＴＧＣＣＴＡＴＧＣＴＧＣＧＣＡＡＴＡＣＧＣＴＣＣＧＧＧＣＴＡＣＣＡＣＴ＂＇ＣＣ－ＴＴＣＴＴＴＣ ＣＡＴＴＧＣＴＧＣＣＣＣＣＧＣＴＧＧＣＣＣＡＧＡＧＣＡＣＴＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＣＡＣＡＴＧＴＣＣＧＡＣＣ＇＂ＴＧＧＣＣＡ『Ｊ Ｑｕｅｒｙ ７２ｌｘ７９３８１．１ｌ｜｜ｌＩ｜ｌ｜Ｊ Ｉ｜｜ＪＩ【ＩＩ｜ｌＩ『Ｊ Ｉ『『ＪＣＡＴＴＧＣＴＧＣＣＣＣＣＧＣＴＧＧＣＣＣＡＧＡＧＣＡ ｑ；ＴＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＣＡＣＡＴＧＴＣＣＧＡＣＣＴＴＧＧＣＣＡ ＡＧＴＴＣＴＣＧＡＣＴＡＴＧ ＴＣＡＡＣＣＴＣＡＴＧＧＣＣＴＡＣＧＡＣＴＡＴＧＣＴＧＧＴＴＣＴＴＧＧＡＧＣＡＧＣＴＡＣＴＣＪ】Ｉ Ｑｕｅｒｙ ７８１Ｘ７９３８１．１ｌ『Ｉｌ｜Ｉ Ｉ｜｜ＩＪ『｜ＩＡＧＴＴＣＴＣＧＡＣＴＡＴＧＴＣＡＡＣＣＴＣＡＴＧＧＣＣＴＡＣＧＡＣＴＡＴＧＣＴＧＧＴＴＣＴＴＧＧＡＧＣＡＧＣＴＡＣＴＣ ＣＧＧＡＣＡＣＧＡＴＧＣＣＡＡＣＴＴＧＴＴＴＧＣＣＡＡＣＣＣＧＴＣＣＡＡＣＣＣＣＡＡＣＴＣＴＴＣＡＣＣＡＴＡＣＡＡＣＡＣｌ【ｌ Ｊ｜Ｉ Ｑｕｅｒｙ ８４１ｘ７９３８１．１Ｉ｜Ｉ Ｉ｜ｌ ｌ｜Ｉ ｌ｜１ｌｌ｝ｌＩ】Ｉｌ『ｌＩ｜｜ＩＣＧＧＡＣＡＣＧＡＴＧＣＣＡＡＣＴＴＧＴＴＴＧＣＣＡＡＣＣＣＧＴＣＣＡＡＣＣＣＣＡＡＣＴＣＴＴＣＡＣＣＡＴＡＣＡＡＣＡＣ ＣＧＡＴＣＡＡＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＴＡＴＣＡＡＧＧＧＡＧＧＴＧＴＴＣＣＣＧＣＡＡＧＣＡＡＧＡＴＣＧＴＴＣＴＴＧＧＩ｜｜ｌＩ『ｌＩ『Ｉｌ『Ｉ Ｉ【ＩＩ｜Ｉ Ｉ【ｌＩｌＩＩ ｌ｝Ｉ ＩＩＣＧＡＴＣＡＡＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＴＡＴＣＡＡＧＧＧＡＧＧＴＧＴＴＣＣＣＧＣＡＡＧＣＡＡＧＡＴＣＧＴＴＣＴＴＧＧ ＣＡＴＧＣＣＣＡＴＣＴＡＣＧＧＡＣＧＡＧＣＴＴＴＴＧＡＧＡＧＣＡＣＣＧＧＴＧＧＣＡＴＴＧＧＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＧＴＧＧＱｕｅｒｙＱｕｅｒｙ９０１ｌ『ＩＸ７９３８１．１９６１Ｉ｛Ｉｌ『ｌｌ『ＩＩ｜｜『Ｉｌ『｜ＩＣＡＴＧＣＣＣＡＴＣＴＡＣＧＧＡＣＧＡＧＣＴＴＴＴＧＡＧＡＧＣＡＣＣＧＧＴＧＧＣＡＴＴＧＧＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＧＴＧＧ ＡＡＴＴＧＧＡＴＣＴＧＧＡＡＧＣＴＧＧＧＡＧＡＡＣＧＧＴＡＴＴＴＧＧＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＴＴＣＴＴＣＣＣＡＡＧＧＣＣＧＧｌ｝ＩＸ７９３８１．１１｜ｌｌ｜１ １｜ＩＪ】ｌ｜｜Ｉ｝ｌｆ｜Ｉｌ｜｜ＩＩ｜｜ｌｌ｜｜ＡＡＴＴＧＧＡＴＣＴＧＧＡＡＧＣＴＧＧＧＡＧＡＡＣＧＧＴＡＴＴＴＧＧＧＡＣ ＴＡＣＡＡＧＧＴＴＣＴＴＣＣＣＡＡＧＧＣＣＧＧ ＣＧＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＧＴＡＴＧＡＣＴＣＴＧＴＣＧＣＡＣＡＧＧＣＡＴＡＣＴＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＡＱｕｅｒｙ １０２１Ｘ７９３８１．１ｌ『Ｉｌ『ｆｌ｝ｌ ｆ｝Ｉ１ＩＩ｜｜１ＣＧＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＧＴＡＴＧＡＣＴＣＴＧＴＣＧＣＡＣＡＧＧＣＡＴＡＣＴＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＡ ＧＧＡＧＣＴＣＡＴＣＴＣＴＴＴＣＧＡＴＡＣＣＣＣＴＧＡＣＡＴＧＡＴＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＣＴＣＴＴＡＣＣＴＣＡＡＧＡＡＱｕｅｒｙ１０８１『ｆＸ７９３８１．１ｌ｜ｌＩ『『Ｉ Ｊ｜｜Ｉ ｌ｜｜Ｉ｜Ｉ『ＩＩ『｜｜ｌ｜｜Ｊ Ｉ｜｜Ｉｌ｜ＩＧＧＡＧＣＴＣＡＴＣＴＣＴＴＴＣＧＡＴＡＣＣＣＣＴＧＡＣＡＴＧＡＴＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＣＴＣＴＴＡＣＣＴＣＡＡＧＡＡ ＣＣＴＣＧＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＴＧＴＴＣＴＧＧＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＣＴＧＡＣＡＡＧＡＣＴＧＧＣＴＣＴＧＡＣＴＣＱｕｅｒｙ １１４１ｘ７９３８１．１１ｆ Ｑｕｅｒｙ １２０１Ｘ７９３８１．１１｜｜１ｌ『ｆｌ』Ｊｌ｜｜｜Ｉ Ｊ｜｜ｌ ｌ｜ｌ｜ｆ ｌ『ＣＣＴＣＧＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＴＧＴＴＣＴＧＧＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＣＴＧＡＣＡＡＧＡＣＴＧＧＣＴＣＴＧＡＣＴＣ ＣＴＴＧＡＴＴＧＧＡＡＣＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＧＣＴＴＴＧＧＧＡＡＧＣＣＴＡＧＡＣＴＣＣＡＣＴＣＡＧＡＡＣＴＴＧＣＴＧＡＧＩ『ＩＱｕｅｒｙ １２６１Ｘ７９３９１ １Ｉ【ｌ｜ｌｌ｛Ｉｌ【ＩＣＴＴＧＡＴＴＧＧＡＡＣＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＧＣＴＴＴＧＧＧＡＡＧＣＣＴＡＧＡＣＴＣＣＡＣＴＣＡＧＡＡＣＴＴＧＣＴＧＡＧ ＣＴＡＣＣＣＣＡＡＣＴＣＣＣＡＧＴＡＴＧＡＴＡＡＣＡＴＣＣＧＡＡＧＣＧＧＴＣＴＣＡＡＣＴＡＡ』Ｉｌ｜Ｉ『ｌ『ＪＩ｜ｆ『Ｉ ｌ『ＩＣＴＡＣＣＣＣＡＡＣＴＣＣＣＡＧＴＡＴＧＡＴＡＡＣＡＴＣＣＧＡＡＧＣＧＧＴＣＴＣＡＡＣＴＡＡ图４深绿木霉菌Ｃｈｉ基因的ｅＤＮＡ核苷酸序列Ｆｉｇ．４ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｌ ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ Ｃｈｉ Ｇｅｎｅ ｃＤＮＡｔｈｅ Ｃｈｉ ｇｅｎｅ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ ｉｓ本基因在ＧｅｎＢａｎｋ注册号为ＦＪ６０３０６１，表达产物为内切几丁质酶Ｎｏ．ｏｆＦＪ６０３０６ １ａｎｄ ｉｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｓｅｎｄｏｃｈｉｔｉｎａｓｅ万 　 方数据５６ＡＣＴＡ ＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥ ＳＩＮＩＣＡ（２００９）Ｖ０１．１８，Ｎｏ．６图５载体ｐ３３ＥＣＲ―Ｃｈｉ酶切（ＢａｍＨ！、Ｓａｃｌ）鉴定Ｆｉｇ．５ Ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅｓ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎｔｏ图６农杆菌中Ｃｈｉ ｇｅｎｅ扩增结果Ｆｉｇ．６ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｐ３３ＥＣＲ－Ｃｈｉｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ＶＩｏｆ Ｃｈｉｇｅｎｅ ｉｎＡ．ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ１～４：酶切产物Ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ＥｎｚｙｍｅｓＭ１：Ｍａｒｋｅｒ２ｔ－ＥｃｏＴｌ４１～４：ＰＣＲ扩增产物Ａｍｐｌｉｆｉｅａｔｏｎ Ｍ：Ｍａｒｋｅｒｈ－ＥｃｏＴｌ４ｐｒｏｄｕｃｔ ｂｙ ＰＣＲ ｄｉｇｅｓｔＩ ｄｉｇｅｓｔ＃Ｍｚ：ＭａｒｋｅｒＩ图７转基因外植体在Ｋａｎ选择培养基上芽分化和植株再生Ｆｉｇ．７ Ｓｈｏｏｔａｎｄ＃ａｎｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｆｒｏｍｓｈｏｏｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｅ ｅｘｐｌａｎｔｓｏｎｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｍｅｄｉｕｍ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｋａｎａｍｙｃｉｎｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｍｉｃｒｏｔｕｂｅｒ ｄｉｓｃｓ；ａ：试管薯分化单生苗Ｓｉｎｇａｌｆｒｏｍｍｉｃｒｏｔｕｂｅｒｄｉｓｃｓ｝ｂ：试管薯分化丛生苗Ｓｈｏｏｔｓｃ：转基凶植株在Ｋａｎ培养基上生根：１）非转基因对照植株在含５０ ｍｇ／Ｌ Ｋａｎ的ＭＳ培养基上；２）非转基因对照植株在ＭＳ培养基上； ３～４）转基因植株在含５０ ｍｇ／Ｌ Ｋａｎ＋２００ ｍｇ／Ｌ Ｃａｒｂ的ＭＳ培养基上Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ１）ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｌａｎｔｏｎｐｏｔａｔｏｅｓ ｒｏｏｔｉｎｇｏｎｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈｏｎＫａｎｔＭＳｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｗｉｔｈ ５０Ｏｉｌｍｇ／Ｌ Ｋａｎ：２）ｎｏｎ ＭＳ＋５０ ｍｇ／Ｌｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｌａｎｔＭＳ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ；３～４）ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｌａｎｔＫａｎ＋２００ｍｇ／Ｌｃａｒｂ（Ｐｙｔｈｉｕｍｓｐｐ．）、疫霉菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｐｐ．）、灰霉菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｓｐｐ．）等植物病原真菌有拮抗作用，能抑制菌丝生长，抑制孢子萌发及芽管的伸长；２）对真菌细胞壁的降解作用：不仅能降解病原真菌成熟的菌丝顶端，同时也能降解具有几丁质――葡聚糖复合结构的老熟细胞壁以及菌核；３）协同增效作用（ｓｙｎｅｒｇｉｓｍ）：与其他细胞壁降篇酶、植物病程相关（ＰＲ）蛋白、杀菌剂、其他生防因子具有协同增效作用。木霉菌几丁质酶基因于一个位点上， 单拷贝，克隆的基因能在真菌、酵母、细菌及植物中表达，可用来进行酶的生产或基因调控。几丁质酶基因编码 ３２０～６００个氨基酸的蛋白质，该蛋白质含有约２０个氨基酸的ＮＨ。末端序列。木霉菌内切几丁质酶基因与酵 母、植物的几丁质酶基因序列是不同的，但与细菌及其他丝状真菌的几丁质酶基因有高度同源性，并且木霉菌来 源的几丁质酶更具稳定性与活性。因此，通过筛选鉴定。发现对病原真菌具有高抗、广谱的优质木霉菌是利用其 几丁质酶基因的资源基础。本研究从深绿木霉菌株中克隆的几丁质酶基因，经过序列分析与在ＧｅｎＢａｎｋ上注册 号为Ｘ７９３８１．１的哈茨木霉（ＩＭＩ ２０６０４０）的内切几丁质酶基因同源性达９９％。万 　 方数据第１８卷第６期草业学报２００９年５７图８部分转化植株中ＰＣＲ扩增结果Ｆｉｇ．８ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆ ＰＣＲｉｎｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｐｌａｎｔｓ１：阳性对照Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ＣＫ；２：阴性对照Ｎｅｇａｔｉｖｅ ＣＫ；３～１０；转基因植株ＰＣＲ扩增产物ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｂｙＰＣＲ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓＭ：ＭａｒｋｅｒＶＩ３．２植物表达载体的构建 构建植物表达载体是有一定策略的，构建载体时目的基因与载体的连接可分为同源粘末端的连接、平末端的 连接、定向克隆、接头连接和同聚物加尾连接等［１＂。本研究中，为了消除载体自身连接和片段多拷贝插入，用了 高浓度的Ｔ。ＤＮＡ连接酶，并适当延长连接时间，最后得到植物表达载体的重组质粒及菌株并通过酶切鉴定与 ＰＣＲ鉴定，确定连接正确。用农杆菌介导并由强启动子３５Ｓ控制，已成功地将内切几丁质酶基因ＴｈＥｎ４２转入 烟草等双子叶植物中［１８１。本研究中所采用的植物表达载体ｐ３３ＥＣＲ所携带的启动子为ｐ３５Ｓ，该启动子有较普 遍的使用范围，因此对本研究中的植物表达载体ｐ３３ ＥＣＲ携带的３５Ｓ启动子并无改动。 ３．３转基因植株的获得与ＰＣＲ鉴定 采用试管薯薯片作为受体有较高的转化率，说明试管薯是马铃薯遗传转化的理想外植体。在试管薯转化过 程中，采用的抑菌抗生素为羟苄青霉素，其浓度为４００ ｍｇ／Ｌ，与本试验同类研究中所用头孢青霉素（２００ ｍｇ／Ｌ） 相比Ｄｇ］，抑菌效果较差，经常有外植体被大量污染最终导致薯片死亡，但是头孢青霉素却对外植体薯片愈伤组织 的分化有一定的抑制作用。设想经过共培养之后，可以先用头孢青霉素进行抑菌，然后再转移至含有羟苄青霉素 进行诱导分化；或者加大羟苄青霉素的浓度，寻找既可抑菌又可诱导薯片高分化的最适浓度，这对转化体系有更 加完善的作用。 本试验所获得的转基因植株，经过ＰＣＲ检测（图８）结果表明，Ｃｈｉ基因已经初步转入马铃薯植株中，若要从 转基因植株的抗性基因的拷贝、调控表达与功能等方面进行研究，还要做ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔ、ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ以及Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ，对转入基因进行全面了解，对其相应的蛋白功能做全面研究。目前，对获得的抗性马铃薯植株的 进一步检测，以及蛋白分析与表达产物的生物活性检测试验仍在进行之中。参考文献： ［１］于品华．饲用型马铃薯新品系“杂３单选一５”选育研究［盯．草业学报，２００４，１３（２）：１１５―１１７． ［２］夏启中，张明菊．植物抗真菌病害基因及其应用研究［Ｊ］．武汉职业技术学院学报，２００５，（３）：６２―６６． ［３］孙慧生．马铃薯育种学［Ｍ］．北京：中国农业出版社，２００３． ［４］李金花，柴兆祥，王蒂，等．甘肃马铃薯贮藏期真菌性病害病原菌的分离鉴定［Ｊ］．兰州大学学报（自然科学版），２００７，４３（２）：３９－４２．［５］张俊莲，王丽，王蒂，等．转根癌农杆菌介导的ＡｔＮＨＸＩ基因马铃薯的获得［Ｊ］．作物学，２００７，３３（７）：１０６７―１０７２． ［６］郭金芳，潘俊松，王琛，等．病程相关蛋白与植物抗病性关系的研究及其在草坪草抗病育种中的应用［Ｊ］．草业学报，２００８，１７（６）：１５６－１６３．［７］惠有为，孙勇，潘亚妮，等．木霉菌在植物真菌病害防治上的作用［Ｊ］．西北农业学报，２００３，１２（３）：９６―９９．万 　 方数据５８ＡＣＴＡ ＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥ ＳＩＮＩＣＡ（２００９）Ｖ０１．１８，Ｎｏ．６［８］杨合同，唐文华，Ｒｙｄｅｒ Ｍ．木霉菌与植物病害的生物防治口］．山东科学，１９９９，１２（４）：７－１６． ［９］Ｓｉｏｆ ＨａｎＪ，Ｘｉｅ Ｃ Ｈ，Ｌｉｕ Ｊ．Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ―ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｍｉｃｒｏｔｕｂｅｒ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｃｌａｓｓ ｌ ｐａｔａｔｉｎｇｅｎｅｉｎｔｏｐｏｔａｔｏ［Ｊ１．ＡｃｔａＡｇｒｏｎｏｍｉｃａ Ｓｉｎｃａ，２００３，２９（６）：８０１―８０５．［１０］张茹，李金花，柴兆祥，等．甘肃河西马铃薯根际生防木霉菌对接骨木镰刀茵的拮抗筛选及鉴定［Ｊ３．草业学报，２００９，１８（２）：１３８－１４５．［１１３萨姆布鲁克．分子克隆实验指南［Ｍ］．ｊ￡京：科学出版社，２００２．Ｅ１２］李梅云，王革，李天飞，等．烟草主要真菌病类生防木霉的筛选［Ｊ３．西南农业大学学报，２００１，２３（１）：１０―１２． Ｅ１３ｑ杨依军，王勇，杨秀荣，等．拮抗木霉菌在生物防治中的作用［Ｊ］．天津农业科学，２０００，６（３）：２９―３３． ［１４］徐同，柳良好．木霉几丁质酶及其对植物病原真菌的拮抗作用［Ｊ］．植物病理学报，２００２，３２（２）：９７―１０２． Ｄｓ］王伟，赵谦，杨微．木霉菌对土传病原尖孢镰刀菌拮抗作用［刀．中国生物防治，１９９７，１３（１）：４６―４７． ［１６３Ｂｅｌｌ ＤＫ。ＷｅｌｌＨＤ。Ｍａｒｋｈａｍ Ｃ Ｒ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｆｕｎｇａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｓＥＪ］．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈ，１９８２，２（４）：２７９―３８２．［１７］东丽，李杰，朱延明．抗真菌、抗渗透胁迫基因多价植物表达载体构建及对黄瓜遗传转化的研究［Ｊ］．农业科技通讯，２００８，３：３７－４１．Ｄｓ］贾晓霞，张金文，王汉宁，等．抗真菌和抗除草剂基因多价植物表达载体构建及对烟草遗传转化的研究［Ｊ］．草业学报，２００９，１８（１）：８６―９３．Ｄ９］王丽，杨宏羽，张俊莲，等．根癌农杆菌介导马铃薯试管薯转化体系的优化及ＡｔＮＨＸｌ基因的导入［Ｊ］．西北植物学报，２００８，２８（６）：１０８８―１０９４．Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆａｃｈｉｔｉｎａｓｅ ｇｅｎｅａｎｄ ｔｈｅ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｏｔａｔｏ ｐｌａｎｔｓＺＨＡＮＧ Ｒｕｌ”，ＬＩ Ｊｉｎ－ｈｕａｌ“，ＣＨＡＩ Ｚｈａｏ―ｘｉａｎ９３，ＺＨＡＮＧ Ｊｕｎ－ｌｉａｎｌ”，ＺＨＡＮＧＪｉｎ－ｗｅｎ２，ＷＡＮＧＤｉｌ’２（１．Ｇａｎｓｕ Ｋｅｙ Ｌａｂ ｏｆ Ｃｒｏｐ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ａｎｄ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ，Ｇａｎｓｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ，Ｇａｎｓｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００７０， Ｃｈｉｎａ；３．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｇｒａｓｓｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇａｎｓｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００７０，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｏｔａｔｏ ａｇａｉｎｓｔ ｆｕｎｇａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｗａｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｙ ａｃｑｕｉｒｉｎｇ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｏｔａｔｏ ｐｌａｎｔｓ ｖｉａ ｇｅｎｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ａ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｖｉａ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｒｏｍ ｃＤＮＡ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ．Ｔｈｉｓ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ ａｔｒｏ―ｐ３３ＥＣＲ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｉｎｔｏ ｍｉｃｒｏ ｔｕｂｅｒｓｔｒａｎｓ―－ｆｒｏｍ ｆｌａｓｋｓ ｏｆ ｔＷＯ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ（Ｆａｖｏｒｉｔａ ａｎｄ Ｓｈｅｐｏｄｙ）ｏｆ ｐｏｔａｔｏ ｖｉａ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ’。ｍｅｄｉａｔｅｄｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ａｆｔｅｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏ―ｃｕｌｔｕｒｅ，１８ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｋａｎａｍｙｃｉｎ ａｎｄ Ｃａｒ― ｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｅｓｔｓ．Ａｆｔｅｒ ＰＣＲｔｅｓｔｓｆｏｒ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ，６７％ｏｆｔｈｅ ｐｌａｎｔｓ（１ ２ ｐｌａｎｔｌｅｔｓ）ｗｅｒｅ ｐｏｓｉ―ｔｉｖｅ．Ｔｈｉｓ ｗｉｌｌ ｇｉｖｅ ｓｕｐｐｏｒｔ ｆｏｒ ｏｂｔａｉｎｉｎｇ ｈｉｇｈ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｏｔａｔｏ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ｉｎ ｆｕｔｕｒｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｐｏｔａｔｏ；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ；ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔ；Ｃｈｉ ｇｅｎｅ万 　 方数据Chi基因的克隆及转基因马铃薯植株的获得作者： 作者单位： 张茹， 李金花， 柴兆祥， 张俊莲， 张金文， 王蒂， ZHANG Ru， LI Jin-hua， CHAI Zhao-xiang， ZHANG Jun-lian， ZHANG Jin-wen， WANG Di 张茹,张俊莲,王蒂,ZHANG Ru,ZHANG Jun-lian,WANG Di(甘肃省作物遗传与种质创新重点实 验室,甘肃,兰州,730070;甘肃农业大学农学院,甘肃,兰州,730070)， 李金花,LI Jinhua(甘肃省作物遗传与种质创新重点实验室,甘肃,兰州,730070;甘肃农业大学草业学院,甘 肃,兰州,730070)， 柴兆祥,CHAI Zhao-xiang(甘肃农业大学草业学院,甘肃,兰州,730070) ， 张金文,ZHANG Jin-wen(甘肃农业大学农学院,甘肃,兰州,730070) 草业学报 ACTA PRATACULTURAE SINICA ) 4次刊名： 英文刊名： 年，卷(期)： 被引用次数：参考文献(19条) 1.于品华 饲用型马铃薯新品系&杂3单选-5&选育研究[期刊论文]-草业学报 .夏启中;张明菊 植物抗真菌病害基因及其应用研究[期刊论文]-武汉职业技术学院学报 .孙慧生 马铃薯育种学[期刊论文]-北京:中国农业出版社 2003 4.李金花;柴兆祥;王蒂 甘肃马铃薯贮藏期真菌性病害病原菌的分离鉴定[期刊论文]-兰州大学学报(自然科学版) .张俊莲;王丽;王蒂 转根癌农杆菌介导的AtNHXI基因马铃薯的获得[期刊论文]-作物学报 .郭金芳;潘俊松;王琛 病程相关蛋白与植物抗病性关系的研究及其在草坪草抗病育种中的应用[期刊论文]-草业学 报 .惠有为;孙勇;潘亚妮 木霉菌在植物真菌病害防治上的作用[期刊论文]-西北农业学报 .杨合同;唐文华;Ryder M 木霉菌与植物病害的生物防治[期刊论文]-山东科学 .Si H J;Xie C H;Liu J An efficient protocol for Agrobacterium-mediated transformation with microtuber and the introduction of an antisense class I patatin gene into potato[期刊论文]-Acta Agronomica Sinica .张茹;李金花;柴兆祥 甘肃河西马铃薯根际生防木霉菌对接骨木镰刀菌的拮抗筛选及鉴定[期刊论文]-草业学报 .萨姆布鲁克?J 分子克隆实验指南[期刊论文]-北京:科学出版社 2002 12.李梅云;王革;李天飞 烟草主要真菌病类生防木霉的筛选[期刊论文]-西南农业大学学报 .杨依军;王勇;杨秀荣 拮抗木霉菌在生物防治中的作用[期刊论文]-天津农业科学 .徐同;柳良好 木霉几丁质酶及其对植物病原真菌的拮抗作用[期刊论文]-植物病理学报 .王伟;赵谦;杨微 木霉菌对土传病原尖孢镰刀菌拮抗作用[期刊论文]-中国生物防治 .Bell D K;Well H D;Markham C R In vitro antagonism of Trichoderma species against fungal pathogens [期刊论文]-Phytopathology .东丽;李杰;朱延明 抗真菌、抗渗透胁迫基因多价植物表达载体构建及对黄瓜遗传转化的研究[期刊论文]-农业 科技通讯 .贾晓霞;张金文;王汉宁 抗真菌和抗除草剂基因多价植物表达载体构建及对烟草遗传转化的研究[期刊论文]-草 业学报 .王丽;杨宏羽;张俊莲 根癌农杆菌介导马铃薯试管薯转化体系的优化及AtNHX1基因的导入[期刊论文]-西北植物 学报 2008(06)本文读者也读过(8条) 1. 赵映琴 转拟南芥AtNHX1基因马铃薯耐盐性的田间鉴定[学位论文]2009 2. 周壮志.周永刚.何朝族.莽克强.田颖川 cry3A和vhb基因在转基因马铃薯中的表达[期刊论文]-生物化学与生物 物理进展) 3. 陈国梁 以gbss、ssⅢ和ssⅡ为靶标的RNAi载体构建及转基因马铃薯植株的获得[学位论文]2008 4. 侯书国 农杆菌介导的马铃薯GNA基因遗传转化及转基因马铃薯的抗蚜虫鉴定[学位论文]2006 5. 张宁.司怀军.王蒂.ZHANG Ning.SI Huai-jun.WANG Di 拟南芥rd29A基因启动子克隆及其在马铃薯抗胁迫转基因 中的应用[期刊论文]-作物学报) 6. 李汝刚.范云六 表达Harpin蛋白的转基因马铃薯降低晚疫病斑生长率[期刊论文]-中国科学C辑) 7. 鄢铮.郭德章.YAN Zheng.GUO De-zhang 马铃薯叶片植株再生系统的建立[期刊论文]-广西农业科学) 8. 汪国平.卢婷.乐素菊.林明宝.WANG Guo-ping.LU Ting.YUE Su-ju.LIN Ming-bao 马铃薯基因组中3个番茄 Cf9的LRR区同源片段的克隆及序列分析[期刊论文]-华南农业大学学报)引证文献(4条) 1.张芳.王舟.宗俊勤.刘建秀.佘建明 农杆菌介导的假俭草遗传转化体系的建立[期刊论文]-草业学报 .孟亚雄.张金文.马小乐.张金林.仲军.王化俊 棉纤维特异启动子LTP12驱动的基因phaB、phaC双价载体构建[期刊 论文]-草业学报 .张森浩.严学兵.王成章.文开新.许来俊 RNA干扰及其在植物中的研究进展[期刊论文]-草业科学 .乔定君.毛萍.马欣荣.杨宏 甘露醇及AgNO3对根癌农杆菌介导的多年生黑麦草遗传转化的影响[期刊论文]-草业学 报 2011(1)本文链接：http://d..cn/Periodical_caoyexb.aspx
物组织或细胞,并在其中进行表达,从而使植物获得新的...马铃薯、西红柿、甜椒 和线辣椒为转基因食品植物 ◆...北京大学克隆了烟草花 叶病毒TMV、 黄瓜花叶病毒...自 1993 年首次获得 转基因烟草、马铃薯以来,植物基因工程的研究和开发进展十分...北京大学克隆了烟草花叶病毒 TMV、黄瓜花叶病毒 CMV、马铃薯 x 病毒等中国株系...北京大学克隆了 烟草花叶病毒 TMV、黄瓜花叶病毒 CMV、马铃薯 X 病毒等中国株...人工合成和改造了植物抗虫害的 Bt 基因,获得了高抗棉铃虫的转基因棉花 品种和...并将外壳蛋白基因转入马铃薯中,以期获得抗 pvx 病毒的栽培种马铃薯(王春香等,...病毒外壳蛋白(Coat protein cp)基因的成功克隆,可使转基因植物中产生病毒外壳...植物中也得到了广泛应用,其中水稻已经被当作模式植物...基因克隆技术突飞猛进,一些 新基因、新性状和新产品...其它依次为转基因玉米、棉花、油菜,转基因马铃薯仅占...即不能确定转基因和非转基因马铃薯的化学成份有差异;饲喂转基 因土豆的大鼠未补充...技术将有利的遗传物质转移到微生物、植物及动物细胞内,使这些 有机体获得有利...中并与植物 基因组整合,获得稳定表达的转基因植株。...和马铃薯. 但烟草由于含有一些不利于人体健康的生物...通过将植物钙网蛋白信号肽替换原有的单克隆抗体信号...因此, 植物转基因技术与传统技术是一脉相承的,其本质都是通过获得优良 基因进行...[3]宋艳茹,彭学贤 ( . 2005) 转 PVY 外壳蛋白基因马铃薯及其田间试验.植物...切割和修饰的目的基 因导入植物细胞或组织并在其中进行表达从而使植物获得新的...的资深营养学家Arpad Pusztai博士研究报道幼 鼠在食用转基因土豆后,会使内脏和...所谓转基因植物, 就是通过基因转移技术获得的整合有外源基因的植物个体, 是拥有...再如抗马铃薯 X、 Y 病毒感染的转基因马铃薯培育成功, 使马铃薯的品质和产量...
All rights reserved Powered by
copyright &copyright 。文档资料库内容来自网络，如有侵犯请联系客服。}