君，已阅读到文档的结尾了呢~~
植物组织培养实验91豆丁精品
扫扫二维码，随身浏览文档
手机或平板扫扫即可继续访问
【精品】植物组织培养实验91
举报该文档为侵权文档。
举报该文档含有违规或不良信息。
反馈该文档无法正常浏览。
举报该文档为重复文档。
推荐理由：
将文档分享至：
分享完整地址
文档地址：
粘贴到BBS或博客
flash地址：
支持嵌入FLASH地址的网站使用
html代码：
&embed src='/DocinViewer-4.swf' width='100%' height='600' type=application/x-shockwave-flash ALLOWFULLSCREEN='true' ALLOWSCRIPTACCESS='always'&&/embed&
450px*300px480px*400px650px*490px
支持嵌入HTML代码的网站使用
您的内容已经提交成功
您所提交的内容需要审核后才能发布，请您等待！
3秒自动关闭窗口君，已阅读到文档的结尾了呢~~
植物组织培养实验26豆丁精品
扫扫二维码，随身浏览文档
手机或平板扫扫即可继续访问
【精品】植物组织培养实验26
举报该文档为侵权文档。
举报该文档含有违规或不良信息。
反馈该文档无法正常浏览。
举报该文档为重复文档。
推荐理由：
将文档分享至：
分享完整地址
文档地址：
粘贴到BBS或博客
flash地址：
支持嵌入FLASH地址的网站使用
html代码：
&embed src='/DocinViewer-4.swf' width='100%' height='600' type=application/x-shockwave-flash ALLOWFULLSCREEN='true' ALLOWSCRIPTACCESS='always'&&/embed&
450px*300px480px*400px650px*490px
支持嵌入HTML代码的网站使用
您的内容已经提交成功
您所提交的内容需要审核后才能发布，请您等待！
3秒自动关闭窗口当前位置： >>
常用动物和细胞实验讲义
绪一、实验课目的言本学科是一门实验性很强的学科，其实验课教学是整个教学的重要组成部分。 目的有如下几方面： （一） 验证理论。通过对理论课所学理论的验证，进一步加深对教学内容的理 解、巩固和提高。 （二） 通过基本技能的训练以及对实验结果的观察分析，使学生了解并掌握细 胞生物学有关的实验技术方法，进而培养学生动手实践、观
察分析和解决问题的能 力。 （三） 培养学生实事求是的科学态度和科学的思维方法，为其后续课的实验及 今后的医学研究打下基础。二、实验课要求（一） 学生在实验前应认真预习实验指导及教材中与实验有关的章节，对实验 课的原理、内容及方法有初步的了解。 （二） 在实验中要认真操作、仔细观察、分析并及时做好记录。 （三） 要注重动手能力的培养。 （四） 在实验中要注重基本技能的训练及实验仪器、器械的使用方法。对基本 的实验技能要反复训练直至基本掌握。 （五） 实验结束后，要根据实验过程中的记录和实验指导的要求，实事求是、 认真的写好实验报告，不得抄书或借阅他人的报告参考。1三、实验室规则（一） 遵守实验纪律，不迟到、不早退或无故缺席。 （二） 进入实验室要穿好白大衣。 （三） 进实验室后要按学号对号入座，不能随意更换座位。要保持肃静。 （四） 要严肃认真地进行实验。实验期间不得进行任何与实验无关的活动。 （五） 实验中各种用品使用后应放回原处。示教标本应按顺序观察，不能任 意移动标本，以免妨碍他人观察。 （六） 要爱护仪器、标本和器械，如有损坏，应及时报告老师，以便修理或 更换。损坏仪器、器械和标本者应按规定进行赔偿。 （七） 要注意节约实验材料、药品和水、电等资源。 （八） 保持实验室内清洁整齐。实验废物及纸屑应放到指定地点，不得随意 乱丢。实验结束后要认真清理各自的实验台面，将器械清洗后点清数目并摆放整齐。 值日生负责清扫实验室，清扫结束后要关好水、电、门窗等，经教师允许方可离开 实验室。 附：实验课绘图要求学生每人准备一支 HB 铅笔、直尺和橡皮。2四、实验教学的内容实验顺序 实验一 实验二 实验三 实验四 实验五 实验六 实验七 实验八 实验九 实验十 实验十一 实普通光学显微镜的结构和使用 动物细胞的基本形态观察和显微测量 细胞组分的化学反应 线粒体的活体染色 液泡系的活体染色 细胞膜通透性的观察 细胞计数 细胞超微结构电镜照片的识别 细胞分裂 细胞的原代和传代培养 细胞融合验内容第一次实验： 普通光学显微镜的结构和使用 动物细胞的基本形态观察和显微测量 第二次实验： 细胞组分的化学反应 线粒体的活体染色 液泡系的活体染色 第三次实验： 细胞膜通透性的观察 细胞计数 第四次实验： 细胞超微结构电镜照片的识别 细胞分裂 细胞的原代和传代培养录像3常用实验动物的了解和解剖器械的使用一、常用实验动物 常用的实验动物有蟾蜍、小白鼠、大白鼠、豚鼠、猫、兔和狗等。在医学实验中， 常常根据不同的实验目的而选用不同的动物进行实验研究。例如，蟾蜍可以用于观察 离体心脏搏动情况的实验， 小白鼠常用于样本很大的实验(如药物的半数致死量的测定 等)，猫常用于测定脑内电位的实验，而狗是局解手术中常用的实验动物。 在我们细胞生物学实验中，除应用培养细胞外，最常用的动物是蟾蜍和小白鼠， 下面对其特点及基本处置做一简单的介绍。 蟾蜍 蟾蜍是两栖类动物，由于其取材方便，常用于各种实验。其细胞较哺乳类动物的 细胞大得多，因此常用于观察细胞形态的实验。 1．雌雄鉴别 通常雄性蟾蜍较雌性的为小，且在其前肢的 l～3 趾基部有被称为婚垫的黑疣。 2．捉拿及处死方法： 常用捣髓法处死蟾蜍，即用解剖针捣毁其脑组织和脊髓。具体方法是，左手握住 蟾蜍的身体和四肢，使其腹部贴着掌心，食指压住蟾蜍头部前端使其尽量腹屈。在头 与躯干之间可触及一凹陷(即枕骨大孔所在处)， 右手持解剖针直插入此凹陷约 l～2mm， 随即将针尖转向头侧插入颅腔捣毁脑组织。然后将解剖针抽回并转向尾侧刺入脊椎管 内捣毁其脊髓。如此直至其四肢松软，呼吸消失为止。 小白鼠 小白鼠是哺乳动物，是最为常用的实验动物。 1．捉拿方法： 将小白鼠放在鼠笼盖铁网上，用右手持其尾巴向后拉，小鼠则会尽力向前蹬。用 左手的拇指和食指抓住其头顶部皮肤，然后用左手小指与手掌之间夹住其尾巴。 2．处死方法： 处死应以安乐死为原则，即使之无痛苦而迅速死亡。常用的方法有颈椎脱位法， 断头法和二氧化碳吸入法等。断头法需用特殊的断头器，二氧化碳吸入法则将小鼠放 入盛有二氧化碳的容器内即可。颈椎脱位法的具体方法是：左手拇指和食指按住小白 鼠的头部，左手捉住其尾巴迅速向后猛拉，使其颈椎脱位而立即死亡。43．给药方法： 小自鼠的给药途径有经口给药、腹腔内注射、尾静脉注射、皮下注射、皮内注射 和肌肉注射等。我们常用的是腹腔注射。具体方法是：左手捉住小鼠(如前所述)，在 其腹正中线稍外侧(避开膀胱和血管)用酒精消毒后，首先将注射针头向头部方向刺入 皮下， 进针 1～2mm 后， 再以 45°角刺穿腹部肌肉而进入腹腔(刺穿腹肌时有一落空感)。 针头刺入腹腔后切勿左右摆动，以免损伤肠管或肝脏。注意每次注入的液体量应为 0.1～0.2ml／10 克体重。 二、常用手术器械及操作方法： 1．解剖针：用于挑、刺等。常用来捣髓处死蟾蜍，持法如执笔法。 2．解剖刀(即外科手术刀)：用于各种皮肤切口和组织切除等。持法有执弓法与执 笔法两种。前者用于较大力量切开较长距离的坚韧的组织，如大动物的皮肤切口等； 后者则用于小力量的短距离切开，或分离皮肤和肌肉等。 3．大剪刀：用于剪毛、皮肤、皮下组织和肌肉等。持法如图。 4．眼科剪刀：用于剪断神经、血管、筋膜等细软组织。 5．眼科镊子：用于提取神经、血管和筋膜等细软组织。 6．钝头镊子：用于提取脏器、组织等。 7．有钩镊子：用于提取皮肤切口等。常用手术器械5-执刀方法图3-7 执剪姿势（左）和执镊姿势（右）执剪姿势执镊姿势6实验一实验目的：普通光学显微镜的结构和使用1．熟悉普通光学显微镜的主要构造及其性能。 2．掌握低倍镜及高倍镜的使用方法。 3．初步掌握油镜的使用方法。实验用品：1．普通光学显微镜、二甲苯、香柏油、擦镜纸。 2．羊毛装片、蛙血涂片、神经细胞标本。实验内容： 一、光学显微镜的类型光学显微镜，简称显微镜或光镜，是利用光线照明使微小物体形成放大影像的 仪器。400 多年来，经不断改进，显微镜的结构和性能逐步完善，形成了品种繁多、 型号各异的光学显微镜系列（图 1―1） 。除了广泛使用的普通光镜外，还有相差显微 镜、暗视野显微镜、荧光显微镜和倒置显微镜等具有特殊功能或用途的光镜。形形 色色的光学显微镜虽然外形和结构差异较大，但其基本构造和工作原理是相似的。二、光学显微镜的结构1．机械系统 （1） 镜筒 是安装在光镜最上方或镜臂前方的圆筒状结构或方形结构，其上端装有目镜，下端与物镜转换器相连（图 1―2） 。 （2） 物镜转换器 又称旋转盘，是安装在镜筒下方的一圆盘状结构，可以按顺时针或逆时针方向旋转， 其上均匀分布有 3～4 个圆孔， 用以装载不同放大倍数的物镜。 转动旋转盘可使不同的物镜到达工作位置（即与光路合轴） ，此时能听到“咔”的一 声。7（3） 镜臂 是支持镜筒和镜台的弯曲状结构，是取用显微镜时握持的部位。目镜 镜筒物镜转换器 zhuanhuanqi 物镜 标本推进尺 载物台 聚光器 光阑 照明灯 镜座 电源插座 推进尺螺旋 粗调螺旋 细调螺旋 镜臂图 1-2普通光学显微镜的结构示意图8（4） 调焦器也称调焦螺旋，是调节焦距的装置，位于镜柱的下端，左右对称各一套。分粗调螺旋（大螺旋）和细调螺旋（小螺旋）两种。粗调螺旋可使载物台以 较快速度或较大幅度升降，能迅速调节好焦距，使物像呈现在视野中，适于低倍镜 观察时的调焦。细调螺旋只能使载物台缓慢或较小幅度地升降，升或降的幅度不易 被肉眼观察到，适用于高倍镜和油镜焦距的精细调节；也常用于观察标本的不同层 次，一般在粗调螺旋调焦的基础上使用。 有些类型的光镜，在左侧粗调螺旋的内侧有一窄环，称为粗调松紧调节轮，其 功能是调节粗调螺旋的松紧度。另外，在右侧粗调螺旋的内侧有一粗调限位凸柄， 当用粗调螺旋调准焦距后向上推紧该柄，可使粗调螺旋限位，此时镜台不能继续上 升，但细调螺旋仍可调节。 （5） 载物台 也称镜台，是位于物镜转换器下方的方形平台，用于放置被观察的玻片标本。载物台的中央有圆形的通光孔，来自下方的光线经此孔照射到标本上。 在载物台上装有标本移动器，也称推进器或推进尺，其上安装的弹簧夹用于固定玻 片标本，载物台的左下方的两个螺旋可以移动推进器，可使玻片标本在水平面上前 后左右移动，用来寻找目标。 （6） 镜柱 是连接镜臂与镜座的短柱，其上有调焦器。 （7） 镜座 位于最底部，是整台显微镜的基座，用于支持和稳定镜体。在镜座内装有照明光源。 2．光学系统 光学系统包括目镜和物镜。 （1） 目镜 又称接目镜，安装在镜筒的上端，起着将物镜所放大的物像进一步放大的作用。每个目镜一般由两个透镜组成，在上下两个透镜（即接目透镜和会聚透 镜）之间安装有能决定视野大小的金属光阑――视场光阑，此光阑的位置即是物镜 所放大实像的位置。因此，可将一小段细金属丝或头发粘附在光阑上作为指针，用 以指示视野中的某一部分供他人观察。另外，还可在光阑的面上安装目镜测微尺。 每台显微镜通常配置 2～3 个不同放大倍数的目镜， “5?” 如 、 “10?” “15?” 和 （数 字表示放大倍数）目镜，可根据不同需要选择使用，最常使用的是“10?”目镜。 （2） 物镜 也称接物镜，安装在物镜转换器上。每台光镜一般有 3～4 个不同放大 倍数的物镜，每个物镜由数片凸透镜组合而成，是显微镜最主要的光学部件，决定9着光镜分辨力的高低。常用物镜的放大倍数有“10 ?”“40 ?”和“100?”等几 、 种。一般将“10?”物镜称为低倍镜（而将“5?”及以下的叫做放大镜） ，将“40 ?”或“45?”物镜称为高倍镜，将“100?”物镜称为油镜（这种镜头在使用时其 顶端需浸在香柏油中） 。 在每个物镜的侧壁通常都标有能反映其主要性能的参数 （图 1―3） 主要有放大 ， 倍数和数值孔径（如 10/0.25、40/0.65、100/1.25） 、该物镜所要求的镜筒长度和标本 上的盖玻片厚度（160/0.17，单位为 mm） ；另外，在油镜上还常标有“油”或“oil” 字样。玻片上表面图 1-3 物镜的性能参数及工作距离 注：两箭头间距离为工作距离，单位为 mm 物镜头与玻片标本之间的介质一般为空气。由于玻璃与空气的折光率不同，光 线通过载玻片和空气进入物镜，部分光线产生折射而损失掉，导致进入物镜的光线 减少，分辨率降低。而油镜用香柏油或石蜡油作为介质，香柏油或石蜡油折射率与 玻璃近似（玻璃、香柏油和石蜡油的折射率分别为 1.52、1.51 和 1.46，空气为 1） ， 可减少光线的折射，增加视野亮度，提高分辨率。物镜分辨率还和数值孔径有关， 其数值越大，分辨率越高。 不同物镜有不同的工作距离，所谓工作距离是指显微镜处于工作状态（焦距调 好、物像清晰）时，物镜最下端与玻片上表面之间的距离（图 1―3） 。物镜的放大倍 数与其工作距离成反比。当低倍镜被调节到工作距离后，可直接转换高倍镜，只需 旋动细调螺旋，便可见到清晰的物像，这种情况称为同高调焦。不同放大倍数的物 镜可从长短上加以区分，一般来说，低倍镜最短，油镜最长，而高倍镜的长度介于 两者之间。10显微镜的放大倍数是目镜的放大倍数和物镜的放大倍数的乘积。 3．照明系统 （1）聚光器 位于载物台通光孔的下方，由 2～3 个透镜组合而成，其主要功能是 将光线集中到所要观察的标本上，增加视野的亮度。在聚光器的左下方，有一调节 螺旋，可使其上升或下降，从而调节光线的强弱。升高聚光器可使聚光作用增强， 反之则聚光作用减弱。 （2）光圈 也称彩虹光阑或孔径光阑，位于聚光器的下端，是能够控制进入聚光镜 光束大小的可变圆环结构。它由十几张金属薄片组合排列而成，其外侧有一小柄， 可使光圈的孔径开大或缩小，以调节光线的强弱。有的显微镜光圈的下方还装有滤 光片框，可放置不同颜色的滤光片。 （3）光源 包括电源线及其插头和灯泡及其开关。电源线在镜柱下面的镜座侧面。 用时将其插头插入电源插座中。灯泡在镜座上面中央位置，其开关在镜座上镜柱底 部的左侧（有的显微镜开关在镜柱上） 。可通过灯泡开关旋钮来调节光线亮度以适应 不同的观察需要。三、光学显微镜的使用方法1．准备工作和基本要求 取用显微镜时，一手握住镜臂，另一手托住镜座，将显微镜平稳地放置在实验 台上，镜座后缘离桌台边缘约 5cm。 用显微镜观察标本时，要求双眼同时睁开，双手并用；逐步养成左手调焦、右 手移动标本或绘图记录的良好习惯。 2．低倍镜的使用 （1） 调光 打开显微镜光源，转动粗调螺旋，使载物台稍下降，调节物镜转换器， 使低倍镜转到工作状态（即低倍镜头对准通光孔） ，当镜头完全到位时，可听到轻微 的顿挫声。侧面观察的同时用粗调螺旋使镜台上升到离物镜约 1 厘米处。 打开光圈并使聚光器上升到适当位置（以聚光镜上端透镜平面稍低于载物台平 面的高度为宜） ，然后双眼观察目镜，同时调节光源的亮度，使视野内的光线均匀、 亮度适中。 （2） 放片 取需要观察的玻片标本，先对着光线用肉眼观察标本的全貌和位置；再将其放置到载物台上，用推进器上的弹簧夹固定好，注意应使有盖玻片或有标签11的一面朝上；然后，旋动推进器的螺旋，使需要观察的标本部位处于通光孔的中央 位置。 （3） 调焦 用眼睛从侧面注视低倍镜，同时用粗调螺旋使载物台上升，直至低倍镜头距玻片标本的距离约 0.5cm （注意操作时必须从侧面注视镜头与玻片的距离， 以 避免镜头压坏玻片） ；然后，双眼观察目镜，同时慢慢转动粗调螺旋使载物台下降， 直至视野中出现较清晰的物像为止；最后，转动细调螺旋，使视野中的物像更清晰。 如果需观察的物像不在视野中央，甚至不在视野内，可用推进器前后、左右移 动标本片，使物像进入视野并移至中央。在调焦时，如果镜头与玻片的距离已超过 了 1 cm 还未见到物像，应严格按上述步骤重新操作。 如果不能确定视野中的物像是目标物像，可先移动一下标本推进尺，如果视野 中的物像不随之移动，说明此物像是目镜或物镜头表面上的异物，而不是要找的物 像，应继续调焦或移动标本推进器。 如果移动标本推进器物像随之移动，①转动细调节器，使镜台细微上升，使标 本上表面上的异物物像消失，进而出现真正要观察的标本物像；②如第①种方法仍 不能看到真正的标本物像，可继续用粗调节器缓慢下降镜台，使标本下表面上的异 物物像消失，直至看到真正的标本物像；③如果第①和第②种方法都不行，应重复 调焦。 3．高倍镜的使用 由于高倍镜放大倍数高于低倍镜，其观察视野小于低倍镜，所以在使用高倍镜 前，应先用低倍镜寻找到需观察的物像，并将其移至视野中央，同时转动细调螺旋， 使被观察的物像清晰。 转动物镜转换器，使高倍镜转到工作状态（高倍镜头对准通光孔） ，此时，视野 中一般可见到不太清晰的物像，只需调节细调螺旋便可使物像清晰。 有时在低倍镜准焦状态下，直接转换高倍镜时会发生高倍镜镜头碰擦玻片，而 使高倍镜不能转换到位的情况。此时不能硬转，应检查玻片是否放反、玻片是否过 厚以及物镜是否松动等情况。 4．油镜的使用 由于油镜头放大倍数高于高倍镜，与上述同样原理，油镜头观察视野小于高倍 镜，所以用高倍镜找到所需观察的标本物像，并将需要进一步放大的部位移至视野12中央。将聚光器上升至较高位置并将光圈开至最大（油镜所需光线较强） 。转动物镜 转换器，移开高倍镜，在玻片标本上需观察的部位滴一滴香柏油作为介质，然后在 眼睛的注视下，使油镜转至工作状态，此时油镜的下端应正好浸在油滴中或与油滴 接触。 双眼注视目镜的同时小心而缓慢地转动细调螺旋， 直至视野中出现清晰的物像。 操作时不要过度转动细调螺旋，以免镜头下降压碎标本或损坏镜头。在观察时，如 需同老师或同学讨论视野中的某一结构，可用推进器将该结构移至指针尖端处；如 果镜中未装指针，可将视野看成一个周缘带有刻度的钟面，说明该结构位于钟面的 几点钟位置（如 3 点、6 点、9 点、12 点等） 。 油镜使用结束后，必须及时将镜头上的油擦拭干净。擦试前，应将镜筒升高约 1 cm 并将油镜头转离通光孔；擦试时，先用擦镜纸蘸少许二甲苯擦 2 次，再用干净的 擦镜纸擦 1 次。至于玻片上的油，如果是有盖玻片的永久制片，可直接用上述擦油 镜头的方法擦净；如果是无盖玻片的标本，则用拉纸法除去载玻片上的油，即先把 一小片擦镜纸盖在油滴上，再往纸上滴几滴二甲苯，立即将纸往外上方提拉２～３ 次。如未擦净，应重复上述过程。 5． 显微镜用后放置方法 显微镜使用结束后应及时复原，使其处于非工作状态：先下降载物台，取下标 本片，物镜转离通光孔；然后，上升载物台，使物镜与载物台相接近；关闭光源， 下降聚光器，关闭光圈。最后，将显微镜罩上防尘罩，放在实验台正中央。 6．显微镜使用的注意事项 为了能看到、看清和不遗漏标本的物像，不损坏玻片标本和显微镜，培养良好 的科学作风，使用显微镜时应注意： （1） 严格按操作步骤使用 用前放置 检查 调光 放玻片标本 低倍镜观察 高倍镜观察油镜观察用后放置擦油（油镜头 和玻片标本） 13（2） 调整适当的视野亮度根据标本材料的厚薄、折光性大小、染色的深浅和选用的物镜放大倍数调节视野的亮度。当标本材料厚、折光性小、染色深、物 镜放大倍数高时，视野亮度应相对较大。反之视野亮度应较小。 （3） 切勿放反玻片标本 放反标本时，虽不影响低倍镜观察，但转换高倍镜和油镜时不但不能找到标本的物像，反而极易损坏玻片标本和物镜头。 （4） 牢记各种放大倍数物镜的工作距离。因为只有在工作距离附近调焦，才能找 见标本物像，并能在用高倍镜和油镜时注意防止玻片标本和物镜头相碰损坏。 （5） 转换物镜时，必须手指握在物镜旋转盘的周缘上，严禁用手指勾动物镜，以 防物镜松动，甚至脱落。从相对低等倍数物镜转换用高等倍数物镜前，应将 所需观察的标本物像移至视野的中心，并须在侧面观察的同时转动相对高等 倍数的物镜至工作位置。 （6） 眼睛注视目镜观察标本时，禁止用粗调节器上升镜台，以防物镜头与玻片标 本相碰损坏。用高倍镜和油镜时，只能用细调节器调焦，且只能转动正反 2~3 圈。如果不能找到或看不清标本物像，原因可能有：①物像未移到视野的中 心；②用前一个物镜观察时，物像未调得十分清楚（焦距未调准） ；③玻片标 本放反了；④转换用的物镜头脏了；⑤转换用的物镜松动了。 （7） 观察标本应全面，以便选择标本材料厚薄适宜、分散好、染色好和形态结构 典型的部位观察，尤其是能防止遗漏有意义的物像。 （8） 显微镜的光学和照明部分只能用擦镜纸擦拭；用完油镜后，一定将油镜头和 标本擦干净。二甲苯有毒致癌，应尽量少用，用后应立即盖好瓶盖，放回原 处或放在不易碰到和打碎的地方。 （9） 显微镜应平拿平放。使用前和使用中不能随意拆卸显微镜的零部件，如发现 玻片标本或显微镜的零件缺失或损坏等异常情况，应立即报告老师。 （10） 观察显微镜时应将座椅高度调适当，上身应挺直而放松；双眼应同时注视目 镜，不要将手放在眼睛或目镜的周围。 （11） 显微镜用后必须关闭电源和照明灯开关，按要求放置，并认真如实填写显微 镜使用卡。14四、操作练习1. 蛙血涂片 蛙血涂片上的的血膜经瑞氏染料染色后呈蓝紫色， 将蓝紫色的血膜对着通光孔， 低倍镜下，调焦后可看到大量密集的红细胞及少量散在的白细胞、血小板。换用高 倍镜或油镜仔细观察：红细胞有核、中央色淡；白细胞胞体大，核质比大，核形态 不一；血小板较小，形态不规则，由巨核细胞的胞质脱落而来。 2. 羊毛装片 先在低倍镜下仔细观察两根羊毛的交叉点，将交叉点移至视野中央后换用高倍 镜观察，利用细调螺旋分别对两根羊毛进行调焦，分辨出两根羊毛的上下位置。 3. 神经细胞标本 动物脊髓神经细胞在镜下较大、有多个突起，胞体呈三角形或星形，中央有一 没着色的圆形或椭圆形细胞核。有的可见核仁。散布于神经细胞之间的染色较深的 小的细胞是神经胶质细胞（图 1-4） 。图 1-4 神经细胞模式图按照上述操作程序反复练习低倍镜、高倍镜和油镜的使用方法。思考题：1． 使用显微镜观察标本时，为什么必须按从低倍镜到高倍镜再到油镜的顺序进 行？ 2． 在调焦时，为什么要先将低倍镜与标本表面的距离调节到 0.5cm？153． 如果标本放反了，可用高倍镜或油镜找到标本吗？ 4． 怎样才能准确而迅速地在高倍镜或油镜下找到目标？ 5． 如果细调螺旋已转至极限而物像仍不清晰，应该怎么办？ 6． 如何判断视野中所见到的污点的来源?作业：1． 填图：标注显微镜的部件名称。 2． 使用显微镜时应注意哪些问题？ 3． 显微镜使用后应如何放置？ 4． 在观察标本时，发现视野光线太暗，应如何调节显微镜视野中的光线强度？16实验二 动物细胞的基本形态观察和显微 测量实验目的：1． 掌握不同细胞临时制片的制作方法。 2． 观察不同细胞的基本形态。 3． 掌握显微镜和测微尺的基本使用方法。 4． 熟悉捣髓法处死蟾蜍的方法。 5． 熟悉各种常用解剖器材的使用及细胞生物学实验绘图方法。实验用品：1. 材料和标本 蟾蜍一只，人血液一滴 2. 器材和仪器 配有目镜测微尺的光学显微镜一台、载片若干、盖片若干、吸水纸、手术器材 一套、解剖盘一个、小平皿一个、表镊子、消毒牙签、镜台测微尺一个。 3. 试剂 1％甲苯胺兰、1％甲基兰、Ringer 氏液（两栖类用）理论基础细胞的形态结构与功能相关是很多细胞的共同特点，在分化程度较高的细胞更为 明显，这种合理性是生物漫长进化过程所形成的。例如：具有收缩机能的肌细胞伸展 为细长形；具有感受刺激和传导冲动机能的神经细胞有长短不一的树枝状突起；游离 的血细胞为圆形、椭圆形或圆饼形。 不论细胞的形状如何，细胞的结构一般分为三大部分：细胞膜、细胞质和细胞核。 但也有例外。例如：哺乳类红细胞成熟时细胞核消失。 生物学临时制片的一般步骤是： 取材； 将材料放在载玻片上； 固定； 染 1． 2． 3． 4． 色。因材料的来源、性质和制片的目的不同，各种制片的四个步骤的方法、用料等不17尽相同，并且有的制片可省略固定或染色的步骤。 测微尺是用来测定显微镜下细胞等微观结构的大小的。测微尺分目镜测微尺和镜 台测微尺，两尺配合使用。目镜测微尺是一个放在目镜像平面上的玻璃圆片。圆片中 央刻有一条直线，此线被分为若干格，每格代表的长度随不同物镜的放大倍数而异。 因此，用前必须测定。镜台测微尺是在一个载片中央封固的尺，长 1 毫米(1000μ m)， 被分为 100 格，每格长度是 10 微米。实验内容 一、细胞基本形态观察（一）蟾蜍脊髓压片的制备和脊髓前角运动神经细胞的观察 1.取蟾蜍一只，破坏脑和脊髓，在口裂处剪去头部，除去延脑，剪开椎管，可见乳白 色脊髓。 2.取下脊髓放在平皿内，用 Ringer 氏液洗去血液后放在载片上，剪碎。 3.将另一载片压在脊髓碎块上，用力挤压。 4.将上面的载片取下即可得到压片。在压片上滴一滴甲苯胺兰染液，染色 10 分钟。 5.盖上盖片，吸去多余染液。在显微镜下观察。 实验结果：染色较深的小细胞是神经胶质细胞。染成兰紫色的、大的、有多个突起的 细胞是脊髓前角运动神经细胞，胞体呈三角形或星形，中央有一个圆形细胞核，内有 一个核仁。 （二）蟾蜍骨骼肌细胞的剥离与观察 1.剪开蟾蜍腿部皮肤，剪下一小块肌肉，放在载片上。 2.用镊子和解剖针剥离肌肉块成为肌束，继续剥离，可得到很细的肌纤维(肌细胞)。 3.尽可能拉直肌纤维。在显微镜下观察。 结果：肌细胞为细长形，可见折光不同的横纹，每个肌细胞有多个核，分布于细胞的 周边。 （三）蟾蜍肝脏压片的制备与观察 1.剪开蟾蜍腹腔，取一小块(约 2～3mm )肝放在平皿内，用 Ringer 氏液洗净，用镊子 轻压将肝中的血挤出。1832.将肝组织放在载片上，制片方法同脊髓压片。 3. 用甲基兰染液染色 5min。显微镜下观察。 结果：可见肝细胞核染成兰色，肝细胞紧密排列，挤成多角形。 （四）蟾蜍血涂片及人血涂片的制备与观察 1.剪开蟾蜍胸腔。 2.取一张载玻片，用左手拇指和食指夹持载玻片的两端，右手取一张推片，用其一角蘸 取一滴蟾蜍心脏血液，滴放于载玻片的一侧。 3.然后，用推片的一端紧贴在血滴的前缘，载玻片与推片之间角度以 30′～45′为宜 （角度越大血膜越薄，角度越小血膜越厚） ，用力均匀向前推，使血液在载玻片上形成 均匀的薄层，(图 2-1 和图 2-2)室温中晾干。显微镜观察。 结果：可见蟾蜍红细胞为椭球形，有核。白细胞数目少，为圆形。图 2―1 血涂片的制备19图 2-2 血涂片制作流程4．人血涂片的制备与观察 取人血一滴，制片方法同上。显微镜观察可见人 红细胞为凹圆盘形，无核。白细胞数目少，为圆形。 （五）人口腔上皮粘膜细胞临时制片（图 2-3） 1．取载玻片和盖片各一片，擦拭干净，置于实验台 的适当位置，并在载玻片中央滴加一滴生理盐水， 再取一根已消毒的牙签（用较粗的一端）在自己口 腔的颊部粘膜上刮取少量上皮细胞，轻轻涂于载玻 片的水滴中。刮取前最好先用清水漱口。 2．加一小滴甲苯胺兰染液，染色 5 分钟，使粘膜上 皮细胞染色，然后盖好盖玻片，用小镊子取吸水纸， 将盖片周围多余的染液吸干。 3．因此时细胞的折光性强、染色浅，所以视野应相20图 2-3 口腔上皮临时制片方法对较暗，才能观察到细胞。 先用低倍镜找到物像，可见在视野中有许多被染成浅蓝色的小片片，挑选其中着 色均匀，比较分散的细胞作高倍镜观察。 在高倍镜下，可见口腔粘膜上皮细胞呈扁平的不规则的多边形，表面有一层很 薄的细胞膜（光镜下难与细胞质区分） ，内部有染成深蓝色的细胞核，细胞核以外至 细胞膜以内为浅蓝色的细胞质，使用细调节器进一步观察可见细胞质中有大小不等 的颗粒状物质。 4．按生物绘图要求，绘制高倍镜下 1～2 个口腔粘膜上皮细胞，并标明各部分 结构的名称。二、显微测微尺的使用方法： 1．将镜台测微尺放在显微镜的载物台上夹好，小心转动目镜测微尺和移动镜台测 微尺使两尺平行，记录镜台测微尺若干格所对应的目镜测微尺的格数。 2．按下式求出目镜测微尺每格代表的长度 目镜测微尺每格代表的长度(μ m)=X10三、测量人口腔上皮细胞从显微镜载物台上取下镜台测微尺，换上人口腔上皮细胞标本，测量细胞、细胞 核的长短径。作业1. 分别求出使用低倍镜(10X)，高倍镜(40X)时目镜测微尺每格代表的长度： 低倍镜：目镜测微尺每格代表的长度= 高倍镜：目镜测微尺每格代表的长度= XlO(μ m)= XlO(μ m)= μ m μ m2. 分别绘制所观察的 6 种细胞并注明基本结构。 3. 计算蟾蜍红细胞的核质比例。 计算细胞、细胞核体积的公式： 圆 形 V=4/3π r (r 为半径) 椭圆形 V=4/3π ab (a、b 为长、短半径)212 3核质比 N／D=Vn／(Vc―Vn)(Vn 为核的体积，Vc 是细胞质的体积)附录：生物绘图生物绘图是医学生必备的基本功，包括绘制肉眼观察到的活体生物、制作的各 种不同类型的标本和显微镜下所观察的标本。显微镜下生物绘图的基本方法和要求：（1） 生物绘图工具：HB 铅笔、绘图橡皮、直尺 （2） 绘图纸应放在显微镜旁边、绘图人执笔手一侧的桌面上。 （3） 图的位置、大小应与绘图纸相适。因图的右侧和下方需写文字说明，所以图应 绘在绘图纸上偏左上方的位置。 （4） 应找到最典型、最能说明绘图目的的物像来绘图。 （5） 绘图内容应真实、工整干净。图中各结构的形态、位置、大小比例和深浅一定 要真实合理。 （6） 物像中的明暗部分要用疏密不同的铅笔尖点成的细小点表示在绘图中。 （7） 图中的名称标写应尽量从图中向右引出直线后水平右延，各引线末端在同一垂 线上。名称应用汉字写在引线末端的右侧。 （8） 在图的正下方写出所绘标本的名称；在图的右下角写明放大倍数、绘图时间和 绘图人。所有文字一定要工整清晰。22实验三实验目的：细胞组分的化学反应1.了解核酸、蛋白等细胞化学反应原理。 2.掌握细胞中 DNA、RNA、碱性蛋白的细胞化学染色方法实验用品：一、材料和标本 蟾蜍一只。 二、器材和仪器 光学显微镜、解剖器材、蜡盘、载玻片、推片、吸水纸、染色缸、盖玻片、废液 缸、恒温水浴箱。 三、试剂 甲基绿一哌洛宁混合液、纯丙酮、70％乙醇、5％三氯醋酸、0.1％碱性固绿、酸 性固绿。实验原理：细胞的组织化学方法，是研究细胞成分常用的方法之一。它是利用化学试剂与细胞内 的某些物质进行化学反应，从而在细胞局部形成有色沉淀物，再通过显微镜对组织内 的生物化学成分进行定性、定位、定量研究。实验内容和方法： 一、Brachef 反应一显示细胞内的 DNA 和 RNA（一）原理 细胞经甲基绿一哌洛宁染液处理后，其中 DNA 和 RNA 出现不同的呈色反应 （Brachef 反应） ，一般认为这是由于带有阴电荷的核酸与碱性染料哌洛宁及甲基绿具 有不同的亲和力而进行选择性染色。 甲基绿可使聚合程度较高的 DNA 染成蓝绿色， 而 哌洛宁与聚合程度较低的 RNA 结合， 呈浅红色， 因此可达到对细胞内的 DNA 与 RNA 进行定位定性分析 （经过 Braehef 反应的标本可进一步在扫描分光光度计中测定核酸的23含量，进行定量分析） 。 (二)方法 1. 制作血涂片：捣髓法处死蟾蜍，腹部朝上放人蜡盘中，剪开胸腔，打开心包。小心 将心脏剪一小口，取心脏血一滴，制作血涂片（方法见实验二） ，室温晾干。 2. 固定：在晾干的涂片上滴加 70％的乙醇（或将涂片浸入 70%的乙醇中） ，固定 5～ 10 分钟，然后用水冲干净，室温中晾干。 3. 染色：在晾干的血涂片上滴加甲基绿一哌洛宁染液，染色 30 分钟，用水冲净，用吸 水纸吸去多余水分（不必吸得过干） 。 4. 镜检：蟾蜍红细胞为椭圆形有核，在高倍镜下，可见细胞核呈蓝绿色，细胞质呈浅 红色。 5.分析上述实验结果，写实验报告。 结果：细胞质被染成浅红色，细胞核被染成蓝绿色，而其中核仁被染成紫红色。二、细胞内碱性蛋白和酸性蛋白的显示（一）原理 由于不同的蛋白质分子所带的碱性和酸性基团的数目不同， pH 值不同的溶液中， 在 蛋白质分子所带的净电荷多少不同。如在生理条件下，整个蛋白质所带负电荷多，则 为酸性蛋白质；带正电荷多，则为碱性蛋白质。据此，可将标本经三氯醋酸处理提出 核酸后，用不同 pH 值的固绿染液分别染色，细胞内的酸性蛋白和碱性蛋白质就会显示 出来。 （二）方法 1．同上述方法制备二张血涂片，室温晾干。 2. 将涂片作好标记放在 70％乙醇中固定 5 分钟，室温晾干。 3．浸入 5％三氯醋酸中 60℃30 分钟，抽提出核酸。 4．清水冲洗多次（3 分钟以上） ，吸水纸吸干玻片上水分。 5. 一张片浸入 0.1％碱性固绿(pH8.0～8.5)中染色 15 分钟,另一张片放入 0.1％ 酸性固绿(pH2.0～2.5)染色 5～10 分钟。 6．清水冲洗，盖上盖片，吸取多余水分，镜检。 结果： 经碱性固绿染色片中，胞质、核仁不着色，细胞核大部分被染成绿色，是为碱性24蛋白质存在处。经酸性固绿染色片中，因胞质和核仁中有酸性蛋白，被染成绿色。思考题：1． 为什么蟾蜍红细胞的细胞质和细胞核可被甲基绿一哌洛宁染液染成不同颜 色？ 2． 酸性蛋白和碱性蛋白染色的原理是什么？作业题：1． 用铅笔绘出 Brachef 反应的镜下所见。 2．说明着色的碱性蛋白可能是什么物质?25实验四实验目的：线粒体的活体染色1. 掌握线粒体的活体染色原理及方法。 2. 熟悉在耳缘静脉用空气栓塞法处死兔子的方法。 3. 了解光学显微镜和电子显微镜下线粒体基本形态结构。实验原理：线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的各项活动 所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。活体染色是应用无毒或毒性较 小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方 法。詹纳斯绿 B（Janus green B）是线粒体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素 氧化酶系使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色 状态。 不同细胞中线粒体的形态和数目不同。在电子显微镜下，线粒体的外形多样，如 圆形、椭圆形、哑铃形和杆状。线粒体的数目与细胞类型和细胞的生理状态有关，线 粒体多聚集在细胞生理功能旺盛的区域。 线粒体脊的数目与分布方式是多种多样的。一般与线粒体长轴垂直排列，但也可 见到与线粒体长轴平行排列的脊。脊的横切面呈囊状或管状。脊的数量与细胞呼吸机 能的强度有很大关系。实验用品：一、材料和标本 兔子一只、线粒体的电镜照片。 二、器材和仪器 普通光学显微镜、手术器材一套、解剖盘、腊盘、小平皿、载片、盖片、吸水纸、20ml 注射器、吸管。 三、试剂 l／300 詹纳斯绿 B 染液、0.9%Ringer 氏液(哺乳类用)。26实验内容和方法： 一、兔肝细胞线粒体的活体染色（一）方法 1.用空气栓塞法处死兔子（见图 4-1） ，置于解剖盘内，迅速打开腹腔，取兔肝边 缘较薄的肝组织一小块（约 2～3mm 大小） 。 2.放入盛有 Ringer 氏液的平皿内洗去血液(用镊子轻压)，再用吸管吸去 Ringer 氏液。 3.在平皿内滴加 1／300 詹纳斯绿 B（Janus green B）染液， ，让组织块上表面露 在染液外面，使细胞内线粒体的酶系可进行充分的氧化，这样才有利于保持染料的氧 化状态，使线粒体着色。当组织块边缘染成蓝色时即可，一般需要染色 30 分钟。染色 期间翻动组织块几次，使其各表面均有机会接触空气和染液。 4. 染色后，将组织块移到载片上，用镊子将组织块拉碎，去除大组织块，就会有 一些游离的细胞或细胞群从组织块脱离留在载片上。 5.滴加一滴 Ringer 氏液，盖上盖片，吸去多余水分，镜检。3图3-1 兔耳缘静脉注射法图 4-2 肝细胞 线粒体超活染色图 4-1 兔耳缘静脉注射法结果：显微镜观察，肝细胞质中许多线粒体被染成蓝绿色，呈颗粒状。27二．线粒体的电镜照片观察观察三张线粒体超薄切片的电镜照片：第一张是小鼠肾小管上皮细胞中线粒体的 电镜照片，可见线粒体呈椭圆形和杆状，由双层膜包围，内膜向内突起成平板状脊， 脊与线粒体长轴垂直排列，肾小管上皮细胞重吸收作用需要能量，线粒体数目多。第 二张是恒河猴脊髓突触内线粒体。可见线粒体体积小、数目多，脊与线粒体呈同心圆 排列。第三张是小鼠睾丸间质细胞线粒体，线粒体的脊为分支的管，在照片上呈单层 膜泡状。作业：绘制光镜下肝细胞活体染色所见的线粒体及电镜下肾小管上皮细胞中线粒体的形态结构。28实验五 液泡系的活体染色实验目的掌握一种活体染色方法，了解光学显微镜和电子显微镜下液泡系的基本形态结 构。实验用品一、材料和标本 蟾蜍一只。 二、器材和仪器 吸水纸。 三、试剂 l／3000 中性红染液、0.65%Ringer 氏液(两栖类用)。 光学显微镜一台、手术器材一套、解剖盘一个、载片、盖片、实验内容 一、蟾蜍胸骨剑突软骨细胞液泡系活体染色及观察(一)原理 在动物细胞内，凡是由膜所包围的小泡和液泡除线粒体外都属于液泡系，包括高 尔基体、溶酶体、过氧化物酶体、消化泡、自噬小体、残体、胞饮液泡和吞噬泡，都 是由一层单位膜包围而成。现在我们又将液泡系称为内膜系统。软骨细胞内含有较多 的粗面内质网和发达的高尔基复合体，能合成与分泌软骨粘蛋白及胶原纤维等，因而 液泡系发达。 中性红是液泡系特殊的活体染色剂，只将液泡系染成红色，在细胞处于生活状态 时，细胞质及核不被染色，中性红染色可能与液泡中的蛋白有关。 (二)方法 1.取一只蟾蜍，破坏脑和脊髓，剪开胸腔，取胸骨剑突软骨最薄部分的一小片， 放在载片上。 2.滴加 1／3000 中性红染液，染色 8～lO 分钟。 3.用吸水纸吸去染液，加一滴 0.65%Ringer 氏液，盖上盖片，吸去多余液体。 4.镜检。 结果： 显微镜下观察， 可见软骨细胞为椭圆形， 细胞核周围有许多染成玫瑰红色． 大 小不一的小泡，即软骨细胞液泡系。29作业：绘制光镜下软骨细胞液泡系。30实验六实验目的：细胞膜通透性的观察1. 了解细胞膜对物质通透性的一般规律。 2. 了解溶血现象及其发生机制。实验原理：细胞膜是细胞与环境进行物质交换的选择通透性屏障。它是一种半透膜，可选择 性控制物质进出细胞。水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗 透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，这种现象就是渗透。 将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白 释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为 溶血。 将红细胞放在某些等渗盐溶液中，由于红细胞膜对各种溶质的通透性不同，膜两 侧的渗透压平衡会发生改变，也会发生溶血现象。因此，发生溶血现象所需时间长短 可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。本实验选用红细胞作为细胞膜通透性的 实验材料，将其放入不同的介质溶液中，观察红细胞的变化。实验用品：1. 10ml 试管、试管架、吸管。 2. 70%乙醇、0.17M 氯化钠溶液、0.17M 氯化铵溶液、0.32M 葡萄糖、0.32M 甘 油、蒸馏水。 3. 动物血细胞实验内容和方法：1. 制备 10%动物红细胞悬液：把一份动物血液和 10 份 0.17M 氯化钠溶液加入到3150ml 烧杯中即为稀释的动物红细胞悬液（不透明的红色液体） 。 2. 溶血实验，取 0.3ml 动物红细胞悬液加入到 3ml 蒸馏水的试管中，晃动试管使 之混合均匀，溶液由不透明的红色变为透明的红色， 此为溶血所致（可以通 过试管壁看清实验指导上的字为标准） ，记录发生溶血的时间。 3. 观察不同物质配成的等渗液发生溶血的时间。 在装有不同物质的等渗液 （均为 3ml）的一排试管中，分别加入 0.3ml 红细胞悬液，轻轻振荡，仔细观察是否 发生溶血并记录发生溶血的时间。 4. 分析上述实验结果，写实验报告。思考题：分析每种溶液中红细胞发生溶血的时间为什么不同？作业题：记录实验结果（是否发生溶血以及溶血发生的时间、原因） 。32实验七实验目的：1. 掌握细胞计数的方法。 2. 了解区分细胞存活状态的方法。细胞计数实验用品：1. 0.4％台盼蓝溶液、无水乙醇或 95％乙醇溶液、脱脂棉 2. 普通显微镜、试管、吸管、毛细吸管、细胞计数板、绸布。实验原理：在细胞培养工作中，常需要了解细胞生活状态和鉴别细胞死活，确定细胞接种 浓度和数量以及了解细胞存活率和增殖度，如用酶消化制备的细胞悬液中细胞活力 的鉴别，冻存细胞复苏后的活力检测等。细胞悬液制备后，常用活体染料台盼蓝对 细胞进行染色，进行细胞计数。台盼蓝不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细 胞不着色。 而死亡细胞的细胞膜通透性增高， 可使染料进入细胞内而使细胞着色 （蓝 色） 。细胞计数一般用血细胞计数板，按白细胞计数方法进行计数，便于确定细胞的 生活状况。实验内容与方法：（一）制备动物细胞悬液 将动物细胞用生物盐水制备成适当浓度的细胞悬液备用。 （二）细胞计数 1． 计数板处理 用无水乙醇或 95％乙醇溶液擦拭计数板后，用绸布擦净，另擦净盖玻片一张， 把盖片覆在计数板上面。 2． 染色 用滴管吸取 0.4％台盼蓝染液，按 1∶1 比例加入细胞悬液中。从计数板边缘缓 缓滴入，使之充满计数板和盖片之间的空隙中。注意不要使液体流到旁边的凹槽中33或带有气泡，否则要重做。稍候片刻，将计数板放在低倍镜下（10?10 倍）观察计 数。 3． 计数方法 按图计算计数板的四角大方格（每个大方格又分 16 个小方格）内的细胞数。计 数时，只计数完整的细胞，若聚成一团的细胞则按一个细胞进行计数。在一个大方 格中，如果有细胞位于线上，一般计下线细胞不计上线细胞，计左线细胞不计右线 细胞。二次重复计数误差不应超过±5％（图 7-1） 。镜下观察，凡折光性强而不着色 者为活细胞，染上蓝色者为死细胞。 4． 计数的换算 计完数后，需换算出每 ml 悬液中的细胞数。由于计数板中每一方格的面积为 0.01cm2， 高为 0.01cm， 这样它的体积为 0.0001 cm3， 0.1 mm3。 即 由于 1ml＝1000 mm3， 所以每一大方格内细胞数?10,000＝细胞数/ml，故可按下式计算： 细胞悬液细胞数/ml＝4 个大格细胞总数/4?10,000 如计数前已稀释，可再乘稀释倍数。 计数细胞后，计算细胞悬液浓度并求出存活与死亡细胞数的比例。加样图 7-1 细胞计数方法（白圈：计数；黑圈：不计）注意事项：1． 向计数板中滴细胞悬液时要干净利落，加量要适当，过多易使盖片漂移，或淹过 盖片则失败，需重做，过少易出现气泡；不理想时，应重做； 2． 镜下计数时，若方格中细胞分布明显不均，说明细胞悬液混合不均匀，需重新将34细胞悬液进行混合，再重新计数。思考题：实验中选用台盼蓝对细胞进行染色的原理是什么？作业题：计算细胞存活率四个大方格内活细胞的数量。按下式进行细胞浓度的计数：注① 4 大格中的每一大格体积为 0.1mm 。1ml=l，0000 大格，因此，1 大格细胞 数?10 =细胞数／ml。 注② 染色标本在 15 分钟内检查计数， 因为台盼兰染液可以迅速地使死细胞染上 蓝色，延长时间活细胞也将着色，用此方法来分辨死活细胞。 进行细胞计数时应力求准确，因此，在科学研究中，往往将计数板的两侧都滴加 上细胞悬液，并同时滴加几块计数板(或反复滴加一块计数板几次)，最后取结果的平 均值。4335实验八细胞超微结构电镜照片的识别 和细胞器的显微观察实验目的：1. 掌握细胞某些重要细胞器的超微结构。 2. 熟悉光镜下线粒体和高尔基复合体的形态特征及在细胞内的分布。实验用品：1. 动物肝脏切片（示线粒体） 、动物脊神经节切片（示高尔基复合体） 2. 甲基绿染液、中性红―詹纳斯绿 B 染液、洋葱。 3. 光学显微镜、载玻片、盖玻片、解剖刀、表镊子、培养皿、消毒牙签、吸水纸、 擦镜纸、水浴锅、染色架。 4. 细胞超微结构电镜照片册实验内容和方法： （一）光镜下细胞器的观察1. 线粒体（Mitochondrian） 肝脏切片（铁苏木精染色）中肝细胞体积较大，呈多边形；细胞核圆形，位 于细胞中央，染色较淡；细胞质呈天蓝色，其中分布有许多染成蓝黑色点状的线 粒体。由于肝细胞很密集，难以分清细胞边缘；可以先找细胞核，由细胞核往外 找细胞的边缘，找到边缘清晰的细胞后，移至视野中央，再转换高倍镜或油镜观 察。油镜下，可见肝细胞中线粒体数目不一，分布或疏或密，细胞核周围较多； 线粒体的形态呈颗粒状、线条状等（图 4-1） 。图 8-1肝细胞中的线粒体362. 高尔基复合体（Golgie Complex） 用镀银法染色的豚鼠脊神经节光镜切片:神经细胞因合成运输大量的蛋白质而含 有发达的内质网和高尔基复合体，低倍镜下，染成棕黄色的神经纤维束将神经节细胞 （卵圆形或圆形）分隔成群；换高倍镜观察，可见到淡黄色的神经节细胞中央着色较 淡，呈浅黄色或空泡状，此为细胞核所在部位。有时可在核中心见到一黄色核仁，核 周围细胞质被染成淡黄色，其中有被染成棕褐色的弯曲线状、网状、颗粒状的结构分 布，此即为高尔基复合体（图 8-2） 。图 8-2脊神经节细胞中的高尔基复合体3．尼氏小体(Nissl’s Body) 甲苯胺兰染色的牛脊髓涂片，尼氏小体即光镜下的粗面内质网。在低倍镜下观察， 染成蓝色的大三角形、星形细胞就是脊髓前角神经细胞，染色较深的小细胞为神经胶 质细胞。转换高倍镜观察，可见脊髓前角神经细胞的细胞质中许多蓝色颗粒或网状结 构即为尼氏小体（图 8-3） 。37图 8-3 脊髓前角神经细胞的尼氏小体 4．中心体(Centrosome) 铁苏木素染色的马蛔虫子宫切片，在低倍镜下观察可见许多受精卵细胞，细胞的 外面有卵壳，细胞与卵壳之间的腔叫卵壳腔。在某些卵细胞内，于核附近有圆形的小 粒――中心粒，它与周围致密的细胞质――中心球，组成中心体。转换高倍镜观察， 可见中心体的外围还有星状的放射细丝即星体（图 8-4） 。染色体中心体 图 8-4 马蛔虫受精卵细胞、分裂中期(示中心体)（二）细胞超微结构电镜照片的识别按照片册顺序观看细胞超微结构照片： 第一页 一个真核细胞较完整的超微结构照片 可见细胞膜、细胞质和位于中央较大的细胞核。胞质中有线粒体、内质网等细胞器。细胞核中，位于周边致密的（黑 色）部位是异染色质，中间疏松的（白色）部位是常染色质。中心致密区是核仁。 第二页 单位膜 从细胞切面上看到细胞膜呈现两层致密的深色带，中间夹一层疏松的浅色带即三层夹板式结构，具有这种结构的膜统称为单位膜。 第三页 线粒体纵切超微结构 呈长椭圆形，在周边可见两层单位膜结构。外层38膜光滑连续，围成密闭结构，内层膜向内突出形成许多嵴。膜间腔、嵴间腔和基质颗 粒清晰可见。 第四页 大照片示线粒体纵切面和横切面 小照片示一个线粒体嵴，嵴上有许多基粒，与嵴的长轴垂直排列，可见基粒的头和柄。 第五页 粗面内质网 呈平行排列的单层单位膜管道系统。局部呈管状、扁平囊状，末端膨大呈大囊泡状。表面有颗粒状核糖体附着，呈粗糙状态。 第六页 滑面内质网 无规则排列的单层单位膜管道系统。局部呈分枝管状、囊状，表面无核糖体附着呈光滑状态。 第七页 高尔基复合体 外周是以同心圆紧密重迭呈片层状的扁平囊，中央引线所指处为成熟面的大囊泡。 第八、九页 见。 第十页 溶酶体 近圆形的单层单位膜结构，内容物密度大。 第十一页 次生溶酶体 可见两个溶酶体内各有一个自噬体（线粒体） 。 第十二页 次生溶酶体 可见较大的溶酶体内有许多葡萄粒状结构，它们是胞饮 高尔基复合体 扁平囊重叠更紧密呈一束致密结构。大囊泡明显可小泡，使整个溶酶体呈多个囊状，称多囊体。在细胞周边，可见相邻细胞细胞膜间的 联结结构――桥粒，呈粗大颗粒状，间隔分布在两细胞膜之间。 第十三页 线粒体与溶酶体在切面上的比较。线粒体纵切为长椭圆形，横切为圆形或椭圆形，其内密度较小，嵴清晰可见。溶酶体各切面一般都呈圆形，大小与线粒 体横切面差不多，其内密度比线粒体大得多，且较均匀。 第十四页 过氧化物酶体 单层单位膜近圆形结构，其内密度较大、均匀。可见一个多边形的致密结构称类核体，它是与溶酶体区别之一。 第十五页 部分细胞核切面 两层单位膜的细胞核膜上有核孔（箭头所指处） 。外层核膜上局部可见有颗粒状核糖体附着。核周隙清晰可见。整个内层核膜内侧呈块状 致密区，是异染色质区，核内密度低区为常染色质区。此片未见核膜与内质网相连通。 第十六页 冷冻蚀刻的细胞核膜表面观 部分外层核膜被撕掉，被撕处呈大锯齿状，核孔贯穿两层核膜。39第十七页一个完整的间期细胞核两层核膜、核孔、异染色质区、常染色质区都清晰可见。位于细胞核内，偏于一侧的无膜大块致密区是核仁，其内密度不均，呈 海绵网状。 第十八页 多聚核糖体 颗粒状核糖体被 mRNA 串连成串珠状的多聚核糖体，呈 螺旋状态。下角小照片示多聚核糖体中呈细线状的 mRNA。 第十九页 中心粒 小照片中引线所指处为相互垂直排列的一对圆柱形小体（中心体） 。大照片示中心粒的圆柱形小体在横切面是由 9 束（每束三个）环状结构排列成 的风车旋翼状结构，称中心粒小轮。小轮中央透过度较高，呈中空状态。 第二十页 细胞骨架 箭头所指粗杆状结构是微管，细丝状结构是微丝，粗细在两者之间的是中间纤维。三者在细胞质中错综复杂地排列成网状结构。思考题：分别比较线粒体、 高尔基复合体在光镜下的显微结构和电镜下的亚显微结构的区别。作业：绘制光镜下脊神经节细胞图，示意高尔基复合体的分布及形态特征。40实验九实验目的：细胞分裂掌握光学显微镜下有丝分裂期中细胞的形态变化特征。实验用品：显微镜、洋葱根尖细胞切片、马蛔虫子宫切片、擦镜纸、香柏油实验内容：按细胞有丝分裂各期的特点观察洋葱根尖切片标本、马蛔虫子宫横切片标本。 应按显微镜使用程序找到具有各时期最典型特征（能与其它时期区别）的细胞进 行观察。细胞分裂是一个连续变化的过程，在观察中要注意这个连续变化过程中的动 态表现。注意动物细胞与植物细胞有丝分裂的不同点。 细胞有丝分裂各时期的形态结构特点 （1） 前期 细胞核膨大， 核内的染色质由原来分散状态开始凝集成丝状的染色丝， 并逐渐继续凝集成棒状的染色体。核仁、核膜逐渐消失。植物细胞质的两极有纺锤丝 形成。动物细胞质中，星状的中心体出现，并逐渐分开移向细胞两极，之间有纺锤丝 相连。 （2）中期 染色体达最大凝集状态，形成典型的结构――两条棒状的染色单体借 着丝粒相连。每条染色体的着丝粒分布在细胞赤道面上，共同形成赤道板。细胞两极 之间由纺锤丝形成典型的纺锤体，赤道板位于纺锤体两极正中央，可见纺锤丝牵拉着 染色体（动原粒部位） 。这种形态改变在与细胞两极为轴的纵切与横切的直径平面上观 察到的截然不同。此期动物细胞的中心体移到细胞两极。 （3）后期 分布在赤道板上的每条染色体因着丝粒纵裂两条染色单体开始分开， 形成两条染色体，在纺锤丝牵引下，分别移向细胞两极，使一个细胞中有两群染色体， 两群染色体移到细胞两极分别合并成团。两群染色体之间仍可见纺锤体纤维。 （4） 末期 移到细胞两极的两组子染色体开始解旋， 形成染色质丝， 至分散状态。41出现片段核膜，直至连续完整核膜。核仁重现。植物细胞中在母细胞的赤道板部位出 现由膜体融合成的细胞板及细胞壁，形成两个子细胞。动物细胞中，母细胞的细胞膜 在赤道板部位向内缢缩凹陷至中间体，形成两个子细胞。图 9-1 马蛔虫受精卵的有丝分裂过程 （1）前期； （2）中期； （3）后期； （4）末期42图 9-2 洋葱根尖的纵切面 1. 根毛区；2. 输导组织；3. 根毛 4. 延长区；5. 生长区；6. 根冠图 9-3 洋葱根尖细胞的有丝分裂过程 （1）间期； （3） （2） （4）前期； （6）中期； （8） （5） （7） （9）后期； （10）末期； （11）子细胞思考题：动植物细胞在有丝分裂过程中有哪些异同点？作业题：绘出光镜下洋葱根尖或马蛔虫受精卵细胞有丝分裂各时期典型细胞结构图。.43实验十 细胞的原代和传代培养【实验目的】 初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程，为生物工程在医 学上的应用打下基础。 【实验用品】 一、材料和标本 乳兔、HeLa 细胞(人宫颈癌细胞) 二、器材和仪器 手术器械、平皿、培养瓶、吸管、离心管(灭菌后备用)、酒精灯、烧杯、超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜。 三、试剂 含有 5％小牛血清的 MEM 培养液、0.01mol／L PBS，0.25％胰蛋白酶 一 0.02％EDTA 混合消化液、75％乙醇。 【实验内容】 一、原代细胞培养 (一)原理 细胞培养(Cell culture)是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工 条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问 题的研究。近年来，广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程 等领域，发展成一种重要生物技术，并取得显著成就。由体内直接取出组织或细胞进 行培养叫原代培养。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。一般 说来，幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。 (二)操作 1．取材 用颈椎脱位法使乳兔迅速死亡。然后，把整个动物浸入盛有 75％乙醇的烧杯中数 秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀剪开用碘酒和乙醇再次 消毒后的皮肤，剖腹取出肝脏或肾脏。置于无菌平皿中。 2．切割 用灭菌的 PBS 液将取出的脏器清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪 碎，直到成 1mm 左右的小块，再用 PBS 清洗，洗到组织块发白为止。移入无菌离心管 中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。 3．消化、接种培养443吸取 0.25％胰蛋白酶一 0.02％EDTA 混合消化液 1ml，加入离心管中，与组织块混 匀后，加上管口塞子，37℃水浴中消化 8～10 分钟，每隔几分钟摇动一下试管，使组 织与消化液充分接触，静止，吸去上清，向离心管中加入 5～10ml 含 5％小牛血清的 MEM 培养基，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养。 (三)结果 细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长，如接种的细胞密度适宜，5 天到 一周即可形成单层。 二、传代细胞培养 (一)原理 体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的 细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合以后， 由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以 1:2 或 l:3 以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。 细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。 在一代中，细胞培增 3～6 次。细胞传代后，一般经过三个阶段：游离期、指数增生期 和停止期。 常用细胞分裂指数表示细胞增殖的旺盛程度，即细胞群的分裂相数／100 个细胞。 一般细胞分裂指数介于 0.2％～0.5％，肿瘤细胞可达 3～5％。细胞接种 2～3 天分裂 增殖旺盛，是活力最好时期，称指数增生期(对数生长期)，适宜进行各种试验。 (二)操作 1．将长成单层的原代培养细胞或 HeLa 细胞从二氧化碳培养箱中取出，在超净工 作台中倒掉瓶内的培养液，加入少许消化液。(以液面盖住细胞为宜)，静置 5～10 分 钟。 2.在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变圆，相互之间不再连接成片，这时 应立即在超净台中将消化液倒掉，加入 3～5ml 新鲜培养液，吹打，制成细胞悬液。 3．将细胞悬液吸出 2ml 左右，加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加 3ml 左右 培养液，盖好瓶塞，送回二氧化碳培养箱中，继续进行培养。 (三)结果 一般情况，传代后的细胞在 2 小时左右就能附着在培养瓶壁上，2～4 天就可在瓶 内形成单层，需要再次进行传代。 三、器材及液体的准备和无菌操作的注意事项45(一)器材和液体的准备 细胞培养用的玻璃器材，如：培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和铁筒 中，120℃，2 小时干烤灭菌后备用；手术器材、瓶塞、配制好的 PBS 液用灭菌锅 15 磅，20 分钟蒸气灭菌；MEM 培养液、小牛血清、消化液用 G6 滤器负压抽滤后备用。 (二)无菌操作中的注意事项 在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁。为此，在操作前要认真地洗手并 用 75％乙醇消毒。操作前 20～30 分钟起动超净台吹风。操作时，严禁说话，严禁用手 直接拿无菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如止血钳、镊子等去拿。培养瓶要在超 净台内才能打开瓶塞，打开之前用乙醇将瓶口消毒，打开后和加塞前瓶口都要在酒精 灯上烧一下，打开瓶口后的操作全部都要在超净台内完成。操作完毕后，加上瓶塞， 才能拿到超净台外。使用的吸管在从消毒的铁筒中取出后要手拿末端，将尖端在火上 烧一下，戴上胶皮乳头，然后再去吸取液体。总之，在整个无菌操作过程中都应该在 酒精灯的周围进行。 【作 业】 一、原代细胞和传代细胞培养有哪些区别? 二、总结一下你自己的经验，怎样才能既迅速，又保证无菌操作。46实验十一实验目的细胞融合掌握细胞融合原理、应用 PEG 融合细胞的方法以及细胞融合率的计算。实验用品1. 材料 鸡红细胞 2. 器材和仪器：普通光学显微镜、普通低速离心机、恒温水浴箱、刻度离心管、 试管、载玻片、盖玻片 3. 试剂 50％PEG(MW4,000)、Hanks 液(pH7.4)、生理盐水实验内容一、原理 细胞融合(Cell fusion)，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学 的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。人工诱导的细胞融合，在六十 年代作为一门新兴技术而发展起来。由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间 细胞的融合， 因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。 细胞融合的诱导物种类很多．常用的主要有灭活的仙台病毒(Sendai virus)，聚 乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)和电脉冲。目前应用最广泛的是聚乙二醇，因为它 易得、简便，且融合效果稳定。PEG 的促融机制尚不完全清楚，它可能引起细胞膜中磷 脂的酰键及极性基团发生结构重排。 二、方法 1. 取新鲜鸡血以 0.85％生理盐水制成 10％的悬液。 2. 称取 0.5 克 PEG(MW=4,000)放入试管内，在酒精灯上融化之，迅速加入 0.5ml 预热的 37℃Hanks 液混匀制成 50％的 PEG 溶液。放入 37℃水浴中备用。 3. 取上述 10％的鸡红细胞悬液 1ml 放入离心管中， 沿离心管壁滴加 50％PEG 溶液， 边加边晃动试管使之混匀，37℃水浴 20min。 4. 取出离心管，缓慢滴加 9ml Hanks 液以终止 PEG 的作用，800g 离心 3min，弃 上清。 5. 用贴壁的液体重悬细胞，取一滴制成滴片，加盖片镜检。47结果：在高倍镜下可以看到有两个或两个以上的鸡红细胞膜融合在一起，形成一 个异核体细胞。要注意辨别融合细胞与重叠的鸡红细胞。 三、融合率的计算 在高倍镜下随机计数 200 个细胞(包括融合的与未融合的细胞)， 以融合细胞(含两 个或两个以上的细胞核的细胞)的细胞核数除以总细胞核数(包括融合与未融合的细胞 核)即得出融合率。公式如下：作业l．在显微镜下按顺序绘制所观察到的细胞融合各阶段，并注明主要特点。 2．你测定的细胞融合率为多少?48附 医学遗传学实验实验一实验目的：ABO 血型分析掌握人类 ABO 血型检测原理和方法实验用品：标准血清 A 和 B、载玻片、玻璃笔、70%酒精棉球、镊子、无菌采血针、无菌玻 片。实验原理：人类的 ABO 血型是由位于 9q34 上的一组复等位基因（IA、IB、i ）决定的。 基因 IA 和基因 IB 对基因 i 是显性， 基因 IA 与基因 IB 之间是共显性。 每个人一对 基因位点上基因的组成即基因型决定他的红细胞膜抗原和血型。基因型 IA IA、IA i IB IB、IB i IA、 IB ii红细胞膜抗原 A B A、B 无 A、BABO 血型 A B AB O 表 1-1 血型与基因型凝集素 β α 无 α 、β标准血清 A B凝集素是使红细胞凝集的物质，β 凝集素使有 B 抗原的红细胞凝集，α 凝集素使 有 A 抗原的红细胞凝集．所以用 A、B 两种标准血清检查个体的血液，就可以分别检 测出 A、B、AB、O 四种血型。49实验内容和方法：1．准备 取一张洁净玻片，用玻璃笔在中央画一竖线，一侧写上 A，另一侧写上 B。分别 在 A、B 两侧玻片上滴 1～2 滴标准血清 A 和 B。 2．取血和检测 常规消毒耳垂，用无菌采血针刺破皮肤表层，挤压出血，用无菌玻片的两角各 取一滴血． 用消毒棉花压迫针眼处止血。 将玻片两角的血液分别涂在 A 和 B 血清中， 注意不要混合两侧血清，或将玻片一角的血液涂在两侧血清中。静置 3~5 分钟，观 察凝集现象是否发生。 3． 填写表格 1-2 并判断血型姓名性别民族标准血清 A标准血清 B血型表 1-2 血型的判断思考题：1. 人类 ABO 血型的基本原理是什么？ 2. 如何根据血型来推测父母或子女的血型？ 3. 根据血型进行亲子测定的依据是什么？作业：1. 根据实验结果，判断自己的血型及可能的基因型。 2. 根据自己的血型，推测你父母可能有的所有的血型组合。50实验二人类外周血淋巴细胞染色体 标本的制备实验目的：了解人外周血淋巴细胞培养和常规染色体标本制备的方法实验用品：（1） 冰箱、恒温培养箱、恒温水浴锅、离心机、无菌培养瓶、15ml 离心管、2ml和 5ml 注射器、吹打管、酒精灯、吹风机、量杯、天平、试管架、酒精棉球、染 色架、废液缸。 （2） RPMll640 完全培养基（包括小牛血清（FCS） 、PHA、抗生素等） 、秋水仙素、0.075M KCl、甲醇、冰醋酸、肝素、Giemsa、pH6.8 PBS。实验原理：外周血淋巴细胞是暂不增殖的分化细胞群，在体外培养条件下，若于培养基中加 入植物凝集素（PHA）则可刺激处于 G0 期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，重新获得有 丝分裂的能力，经一段时间的培养即可获得大量分裂期细胞以供染色体分析。 秋水仙素（或秋水酰胺）可通过干扰微管组装而抑制纺锤丝形成，使细胞分裂不 能顺利进入后期而停滞于中期，从而可在短期内积累大量最适于进行染色体分析的中 期分裂相。此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈现明显的外形而 利于辨认。 染色体标本制备过程中有两个重要环节，其原理是： （1）低渗处理：目的是使水分通过细胞膜向细胞内渗入，导致转化的淋巴细胞膨 胀，染色体进一步分散而利于分析。同时，低渗处理还可使红细胞质膜破裂，经离心 后血影浮于上清中被去除。后续的固定过程主要针对淋巴细胞，改善了淋巴细胞的固 定质量及标本质量。 （2）固定：目的在于尽快使细胞的结构固定于接近存活的状态，以便作进一步处 理，若不固定则可因细胞内蛋白质分解而导致结构变化。染色体研究中常用固定液为51甲醇―冰醋酸（3∶1）固定液。冰醋酸渗透力强，固定迅速，但易使组织膨胀。而甲 醇则可使组织收缩，两者混合使用能抵消各自的缺点，得到较好的固定效果。实验内容和方法：（1） 采血： 用肝素润湿注射针筒 （0.2m1） 转动针筒混匀肝素,常规取静脉血约 1～ 后， 2ml。 （2） 接种： 在每个培养瓶（含 RPMI1640 完全培养液 5ml， pH7.2）中注入全血 0.25～ 0.30ml，轻轻摇匀。 （3） 培养：将培养瓶放在 37℃恒温培养箱内培养 72h。终止培养前 2～4h，加入适量 0.01％秋水仙素溶液（100pg／ml） ，使终浓度为 0.2pg／m1 培养液。轻轻摇匀 后，放回培养箱继续培养 2～4h。 （4） 收获：将培养后的血细胞收集在离心管中，每两管用天平平衡后 1,000r／min 离 心 8min，弃去上清。 （5） 低渗： 向离心管中加入 37℃ 0.075mol／L KCI 溶液至 6ml， 用吸管轻轻吹打 1～ 2min，混匀细胞，置于 37℃水浴箱温育 20min。 （6） 预固定：向离心管中滴加新配制的甲醇―冰醋酸固定液 1～2ml，用吸管轻轻吹 打 1～2min，混匀后配平，1,000r／min 离心 8min，弃去上清。 （7） 固定：加入新配制的固定液至 7ml，室温静置 30min。1,000r／min 离心 8min， 弃去上清。 （8） 第二次固定：加入新配制的固定液至 8ml，室温静置 30min。1,000r／min 离心 8min，弃去上清。 （9） 滴冰片：根据沉淀细胞的多少，加入适量新鲜固定液（≤0.5 ml） ，轻轻吹打制 成细胞悬液。用滴管吸取少量细胞悬液，滴至冰冷的载玻片上，轻轻吹散，冷 风吹干或空气干燥。 （10） 染色：1∶10 Giemsa 染液（pH 6.8）染色 10～20min。流水冲洗，吹风机吹干， 镜检。注意事项：（1） PHA 是成败关键，如保存不善，效价低或数量不足，则作用差，但浓度过大， 使红细胞凝集，这些都会影响细胞生长。 （2） 秋水仙素用量过大，染色体过度收缩，乃至染色单体离散；用量过小则影响分52裂相。 （3） 低渗处理极为重要，低渗不够，则染色体聚在一起，分散不好。低渗过度，则 造成细胞破碎，染色体丢失。 （4） 离心速度太高，细胞团块不易打散；速度太低，则会丢失细胞。 （5） 细胞太多或太少亦能影响分裂相的多少及标本质量。 （6） 机械打散细胞团时，用力要适度，若用力过猛，细胞易破碎，染色体不完整。 （7） 固定液纯度要高，临用时新鲜配制，沿管壁慢慢加入后打匀，如果固定液加入 太快，会使固定作用过强，染色体扭转；固定液作用不足，染色体出现毛刷状。图 2-1 人类外周血淋巴细胞中期染色体思考题：1. 2. 3. 为什么在淋巴细胞培养过程中早期要加 PHA，在晚期要加秋水仙素？ 在染色体标本制备过程中为什么在固定前要进行低渗？ 如果染色体分散不好或染色体太短，可能是什么原因造成的？作业题：影响染色体制备结果的主要因素有哪些？53实验三实验目的：人类染色体常规核型分析1. 初步掌握人类染色体编号、分组的依据及各条染色体的形态特征。 2. 了解核型分析在检测染色体病中的意义。实验用品：正常人类细胞中期分裂相照片、剪刀、表镊子、胶水、牙签。实验内容和方法：首先将照片中染色体计数。将图片中的染色体分裂相一个个剪下（注意不要紧贴 染色体剪，应留有明显的空边） 。按照各组染色体的特征，将剪下的染色体放在报告纸 上，注意保管，不要将染色体丢失。根据表 11-1 中各染色体的特点和鉴别的要求，将 剪下的染色体分组编号排列在实验报告纸相应位置上，经过反复核对调整直至正确。 粘贴时一定注意将每个染色体的着丝粒排在一条水平线上，短臂朝上，长臂朝下。最 后将核型分析的结果写在报告纸上。核型分析结果的表示方法： 染色体总数，性染色体组成 正常男性核型（图 11-1） ：46，XY 正常女性核型（图 11-2） ：46，XX思考题：人类染色体分组的依据是什么？各组染色体的特点是什么？作业：正常人类染色体常规核型分析54表 3-1人类染色体 Denver 体制图 3-1正常男性常规核型55图 3-2正常女性常规核型实验四观看人类遗传病录像56附一离心机转数与离心力的换算表r 为离心机转轴中心与离心套管底部内壁的距离；rpm(revolution per minute) 为离心机每分钟的转数；RCF(relative eentrifugal force)为相对离心力，以地心引 力，即重力加速度的倍数来表示，一般用 g 表示。 利用下表，已知离心机 r 和 g 就可求出 rpm；反之，r 和 rpm 已知，也可求出 g。 例如，在 r 标尺上取已知的 r 半径值和在 g 标尺上取已知相对离心力值，这两点间线 的沿长线在 rpm 标尺的交叉点即为 rpm。 注意，若已知的 g 值处于 g 标尺的右边，则应读取 rpm 标尺的右边数值，否则反 之。g 和 rpm 也可通过下边公式来换算： RCF=1.119?10 ?rx(rpm)5 257附二一、常规溶液溶液的配制(一)1/15mol/L PBS(磷酸缓冲液 Phosphate Buffer Solution，PBS) 甲液：1/15mol/L Na2HPO4 溶液 Na2HPO4 蒸馏水 乙液：l/15mol/L KH2PO4 溶液 KH2P04 蒸馏水 9.07g 加至 .465g 加至 1000ml分装在棕色瓶内，于 4℃冰箱中保存，用时甲、乙两液各按不同比例混合，即可得 所需 pH 的缓冲液,见下表: pH 5.29 5.59 5.91 6.24 6.47 6.64 甲液 ml 2.5 5.0 10.0 20.0 30.0 40.0 乙液 mI 97.5 95.0 90.0 80.0 70.0 60.0 pH 6.81 6.98 7.17 7.38 7.73 8.04 甲液 ml 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0 95.0 乙液 mI 50.0 40.0 30.0 20.0 10.0 5.0(二)0.3％台盼兰染液 称取台盼兰(Trypan blue)粉 0.3 克， 溶于 100ml 生理盐水中， 加热使之完全溶解， 用滤纸过滤除渣，装入瓶内室温保存。 (三)0.5％酚红指示剂 酚红 0.1N(0.4％)NaOH 双蒸水 0.5g 15ml 85ml将 0.5 克酚红置研钵中，缓漫滴加 0.1NNaOH 溶液边加边磨，并不断吸出已溶解的58酚红液，直至全部溶解，然后加入 85ml 双蒸水，颜色为深红，经粗滤纸过滤后使用， 室温保存。 (四)5.6％NaHCO3 溶液 称 NaHCO35.6 克，溶于 100ml 蒸馏水中，室温保存即可(如需要也可 10 磅 15 分钟 高压灭菌，4℃冰箱保存) (五)10μ g／ml 秋水仙素 秋水仙素 生理盐水 lOmg 100ml装入茶色瓶中，为贮备液，4℃冰箱中保存。甩时取贮备液 1ml 加生理盐水 9ml 即 可。 (六)0.4％KCl-0.4％柠檬酸钠低渗液 将 0.4％KCl 和 0.4％柠檬酸钠两液等量混合即可，室温保存。 (七)2％柠檬酸钠 称取柠檬酸钠 2 克，加 100ml 双蒸水即可，室温保存。 （八）0.2％次甲基兰染液 称次甲基兰(Methylene blue)0.2 克，加蒸馏水 100ml，室温保存。 (九)0.5％醋酸洋红(Aceio Carmine)染液 洋红 醋酸 蒸馏水 lg 90ml 110ml将 90ml 醋酸加入 110ml 蒸馏水煮沸，然后将火焰移去，立即加入 1 克洋红，使之 迅速冷却过滤，加饱和氢氧化铁(媒染剂)水溶液数滴，直到呈葡萄酒色。室温保存。 加铁使洋红沉淀于组织而着色。此染液室温存放时间越长效果越好，室温保存。 (十)1％甲苯胺兰(Toluidine blue) 称取甲苯胺兰 1 克，加蒸馏水 lOOml。 (十一)1/3000 中性红染液 取中性红(Neutral red)0.1 克，加蒸馏水 300ml。室温保存。 (十二)Giemsa 染液 1．贮备液 Giemsa 粉 纯甘油 1g 66ml59甲醇66ml先将 Giemsa 粉置于研钵中加少量甘油，充分研磨，呈无颗粒的糊状。再将全部甘 油加入，放入 56℃温箱中 2 小时，然后加入甲醇，保存于茶色瓶中。一般两周后使用 为好。 2．工作液 临用时将贮备液与 pH6.8 的磷酸缓冲液按照 1:20 混合。 (十三)埃利希(Ehrlich)苏木精染液 苏木精 乙醇 醋酸 甘油 硫酸铝钾 蒸馏水 1.0g 50ml 5ml 50ml 5g 50ml将苏木精溶于少量的乙醇中，再加醋酸并搅拌，以加速其溶解。当苏木精溶解后 将甘油加入并摇动容器，同时加入其余的乙醇；硫酸铝钾需研磨并加热，然后溶解于 蒸馏水中，将其一滴滴地加入上边的溶液，并不断摇动，此液配好后，将瓶口用纱布 盖好，置通风处，经常摇动以加速其成熟，成熟约需 4 周左右，成熟的染液为深红色。 二、细胞化学和细胞组分分离溶液 (一)M 一缓冲液 眯唑(Imidazole) KCI MgCl2?6H2O ECTA EDTA 巯基乙醇 甘油 蒸馏水 用 lNHCl 调 pH 至 7.2 室温保存。 (二)2％Triton X 一 100 溶液 量取 2mlTriton X 一 100(聚乙二醇辛基苯基醚)液，加 M 缓冲液 98ml 即可。 （三）0.2％考马斯亮兰 R-250 染液603.404g 3.7g 101.65mg 380.35mg 29.224mg 0.07ml 297ml 加至 1000ml甲醇 醋酸 考马斯亮兰 蒸馏水46.5ml 7.0ml 0.2g 加至 100ml(四)A．0.1％碱性固绿染液(pH8.0～8.5) 1．0.1％固绿水溶液 固绿(Fast green) 蒸馏水 2．0.05％Na2C03 溶液 Na2C03 蒸馏水 用时按 1:1 体积混合即可。 B．0.1％酸性固绿染液(pH2.2) 1．0.1％固绿水溶液。 2．mol／L?75 盐酸液 盐酸(比重 1.19)0.109ml 加蒸馏水至 100ml 用时按 l:1 混合。 (五)甲基绿一哌咯宁染液 1.1mol／L 醋酸缓冲液(pH4.8)： (1)醋酸 蒸馏水 (2)醋酸水 蒸馏水 用时分别取两液 40ml、60ml 混匀即可。 2．甲基绿一哌咯宁(methyl green―Pyrcnln) 5％哌咯宁水溶液 2％甲基绿水溶液 蒸馏水 lmol/L 醋酸缓冲液 6ml 6ml 16ml 16ml 17ml 加至 200ml 13.5g 加至 lOOml 50mg 100ml 0.1g 100mllmol/L 醋酸缓冲液临用时才可加入染液中。 (六)Schiff 试剂61将碱性品红 0.5 克加入 lOOml 沸水， 持续煮沸 5 分钟， 并随时搅拌， 待冷却到 50℃ 时过滤到棕色瓶中，加 1N HC11O 毫升，冷却至 25℃时加入 1 克 NaHSO3，此时需很好的 振荡，避光过夜。次日取出(呈淡黄色)加 0.25 克活性炭剧烈振荡 1 分钟。过滤后即得 Schiff 试剂。避光低温保存。 (七)联苯胺混合液 联苯胺(4.4 Diamino benzidine) 95％乙醇 3％过氧化氢 此液临用时配制。 (八)l％番红水溶液 番红(Safranin) 蒸馏水 1.0g 100ml 0.2g lOOml 2滴(九)1％SDS(十二烷基硫酸钠 Sodium dodecyl sulfate,SDS) SDS 45％乙醇 10g 100ml( 十 )1mol ／ LTris( 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 / 盐 酸 缓 冲 液 Trihydroxy methylaminomethane Tris/HCL)pH7.8 Tris 蒸馏水 12.114g lOOml先将 Tris 溶于少量蒸馏水，用 HCI 调 pH 至 7.8，然后加水至 100ml (十一)Ringer Solution 氯化钠(冷血动物用 0．65 克) 氯化钾 氯化钙 蒸馏水 (十二)淀粉肉汤培养基 蛋白 淀粉 牛肉汤 用 10％NaHCO3 调 pH 至 7.0～7.2 (十三)0.25mol／L 蔗糖一 0.003mol／L 氯化钙溶液620.9 克 0.042 克 0.025 克 100ml2g 6g 100ml蔗糖 氯化钙 蒸馏水 (十四)1％詹纳斯绿 B 染液85.5g 0.33g 1000ml取詹纳斯绿(Janus green B)1.0g Ringer 氏液 100ml (十五)1％刚果红染液 刚果红 蒸馏水 (十六)Gomori 硝酸铅作用液 0.05mol／L 醋酸缓冲液(pH5) 0.6 醋酸加蒸馏水 200ml、取其 lOOml 42ml 1g 100ml醋酸钠 1.36g 加蒸馏水 200ml，取其 158ml 共 200ml B-甘油磷酸钠 醋酸铅 5％氯化镁 2g 2g 5ml以上作用液在临用时配制，最终在 pH5～5.2，过滤使用。 (王世藩 汇编) 二、细胞培养和细胞融合溶液 (一)0.01mol／LPBS(磷酸盐缓冲液 Phosphate Buffer Saline，PBS)pH7.2。 0.2mol／L 磷酸氢二钠液(甲液)： NaH2PO4?12H2O 双蒸水 0.2mol／L 磷酸二氢钠液(乙液): NaH2PO4?12H2O 双蒸水 15.601g 加至 500ml 35.814g 加至 500ml取甲液 36ml，乙液 14ml 和 NaCl8.2 克，加双蒸水至 1000ml。混匀待完全溶解分 装，经高压灭菌后保存于 4℃冰箱备用。 (二)50％PEG(聚乙二醇 Polyethyleneglycol mwl500) 称取 0.5 克 PEG， 用前放入试管中在酒精灯火焰上熔化， 加入等量 37℃予热的 MEM 培养液，混匀，保温在 37℃水浴中待用。 (三)MEM 培养液(含 10％小牛血清)63MEM 培养液(日本制药株式会社) 双蒸水 NaHCO3 谷氨酰胺(L-glutamin) 56℃灭活 30 分钟的小牛血清 110ml9.4g 1000ml 1.5g 0.292gMEM 粉末加水溶解后，用 NaHCO3 调 pH 到 7.1(因在抽滤过程中 pH 升高 0.2～0.3)， 然后加灭活的小牛血清和谷氨酰胺，待完全溶解后，立即用 G6 抽滤除菌，分装，置 4℃ 冰箱保存备用。 (四)0.25％胰蛋白酶一 0.02％EDTA 混合消化液 胰蛋白酶(Trypsin)粉 EDTA 粉 0.01mol／L PBS 0.25g 20.0mg 100ml先用少量 PBS 溶解胰蛋白酶， 然后将 EDTA 粉末和剩下的液体加入混合， 37℃水 置 浴中 1 小时左右(待彻底溶解，液体呈透明为止)，用 G5 抽滤，分装置 4℃冰箱中保存。 (五)Hanks 液 1．原液甲 NaCl KCl MgSO4?7H2O MgCI2?6H2O 溶于 800ml 馏水中。 CaCl2(无水) 溶于 100ml 蒸馏水中。 将两种液体混合后，加水至 1000ml 用滤纸滤过，再加 2ml 氯仿防腐，置 4℃冰箱 备用。 原液乙 Na2HPO4?12H2O KH2PO4 葡萄糖 3.04g 1.2g 20.0g 2.8g 160g 8g 2g 2g溶于 800ml 蒸馏水中，用滤纸过滤，然后加 0.5％酚红 80ml，再加水至 1000ml， 最后加入 2ml 氯仿防腐，置 4℃冰箱备用。642．使用液 甲乙两液各 1 份，双蒸水 18 份，混匀分装包扎好瓶口，经 10 磅 15 分钟高压灭菌 后置 4℃冰箱中保存。使用时用 5.6％NaHCO3 调 pH 值到所需要求。 (六)1640 培养液(含 lO％小牛血清) RPMI-1640 粉 双蒸水 10.39g 加至 1000ml通入适量的 C02 气体， 边通入 CO2 边慢慢搅拌， 使其(呈透明)完全溶解。 NaHCO31.5 用 克调 pH 值到 7.2。 双抗 1 万 u/ml 灭活小牛血清 10ml 110ml混匀上述液体，立即用 G6 抽滤除菌分装，置 4℃冰箱备用。 (七)青、链霉素溶液 青霉素钠盐(40 万 u／瓶) 链霉素(100 万 u／瓶) 5瓶 2瓶将两者溶于 200ml0.9％的无菌生理盐水，分装小瓶，-30℃保存。双抗在培养基中 的终浓度为各 lOOu 为宜。 (八)二甲基亚砜诱导 HL-60 细胞分化使用的终浓度为 1。4％。 (九)BrdU 溶液(200ug/m1) 用无菌青霉素瓶，在室温下称取 1.0mg，在无菌条件下加入灭菌生理盐水 9.0ml， 溶解，混匀，用黑纸包严，避光置冰箱冰格中保存。最好用时现配。 (十)2?SSC 溶液 用分析天平称取氯化钠 17.53 克， 柠檬酸钠 8.82 克溶于蒸馏水中， 加蒸馏水至 1000 毫升。 （十一）3％琼脂： 取琼脂粉 3 克，加入双蒸水到 100 毫升，搅匀，高压消毒后(15 磅 20 分钟)，冷藏 备用，使用前重新加热煮沸(贮存时间不宜过长)。 三、制备电镜标本的溶液 (一)2.5％戊二醛溶液 25％戊二醛 0.1mol／L 二甲砷酸钠缓冲液 装入茶色瓶中，保存于 4℃冰箱备用。65lOml(二)0.1mol／L 二甲砷酸钠缓冲液 二甲砷酸钠 蒸馏水 10.70g 500ml将二甲砷酸钠置于 500ml 容量瓶中，先加水约 400ml，震荡使其溶解，用 HCl 调 pH 到 7.4，加入剩余蒸馏水，4℃冰箱保存。 (三)包埋剂 环氧树脂 Epon812 56.30gDDSA(十二烷基琥珀酸酐 Dodecenyl succinic anhydride，DDSA) 14.60gMNA(甲基内次甲基邻苯二甲酸酐 Methyl Nadic) anhydride，MNA 29.00g混合上述三种包埋剂成分， 搅拌 30 分钟使其充分混匀。 再加加速剂 2,4,6 一三(二 甲氨基甲基)苯酚(2，4，6-tridimethyl aminomethylphenol，DMP-30)1.5ml，继续搅 拌 30 分钟，置于干燥罐中(室温)备用。 (四)2％单宁酸 单宁酸 双蒸水 2g 100ml溶解后过滤装茶色瓶中，4℃冰箱保存。 (五)高锰酸钾固定剂 柠檬酸三钠 氯化钾 氯化镁 高锰酸钾 60mmol/L 25mmol/L 35mmol/L 125mmol/LpH 为 7.4-7.8，装茶色瓶中，4℃冰箱中保存，有效期 2 个月左右。 (六)1％OsO4 溶液 OsO4 0.1mol/L 二甲砷酸钠缓冲液。 0.5g 50mlOsO4 一般为 0.5 或 1 克安瓶中封闭包装，配制时剥去商标，用自来水洗净，放洗 涤液中泡 4～12 小时后用水冲洗，在安瓶上划痕，用蒸馏水洗净，投入茶色瓶中，加 缓冲液，用玻璃棒在瓶中捣碎，轻轻摇动放冰箱中，48 小时后完全溶解。此药蒸气对 人眼、角膜、鼻腔和口腔粘膜有固定作用，用时特别小心，在通风橱内操作。66
常用细胞株_生物学_自然科学_专业资料。常用细胞株【...细胞是实验中非常常用的一个细胞株,在生物制 药中...比较容易转染,很适合用它来研究一般哺乳动物基因的功能...实验考试题总结_生物学_自然科学_专业资料。实验考试...(标准答案: 正确 ) 544、学生在动物实验中,抓取...实验废弃的生物活性实验材料特别是细胞和微生物(细菌...动物细胞培养技术实验指导(全面)_畜牧兽医_农林牧渔_专业资料。实验篇实验一 ...以配置 10000ml 常用清洁液为例介绍如下:先在搪瓷盆或塑料盆中加入蒸馏水 ...常用实验动物白细胞正常指标值表_生物学_自然科学_专业资料 暂无评价|0人阅读|0次下载|举报文档常用实验动物白细胞正常指标值表_生物学_自然科学_专业资料。常用...动物细胞工程试验讲义(学生版)_理学_高等教育_教育专区。实验一 细胞培养用品的...灭菌常用的方法有化学试剂灭菌法、射 线灭菌法、 干热灭菌法、 湿热灭菌法和...实验常用培养基及基本特性_生物学_自然科学_专业资料。常用培养基及基本特性 1、RPMI-1640 Medium RPMI-1640 广泛应用于哺乳动物、特殊造血细胞、正常或恶性增生的...动物细胞融合_实验报告_生物学_自然科学_专业资料。实验二:动物细胞融合一、实验目的 1、了解动物细胞融合的常用方法――聚乙二醇诱导细胞融合的基本 原理。 2、学习...常用实验动物介绍―豚鼠_畜牧兽医_农林牧渔_专业资料。常用实验动物介绍―豚鼠一...检查 雌鼠是否发情也可取阴道涂片,通过观察其角化上皮细胞是否积聚来确定。 雌...试卷_医药卫生_专业资料。习题二、刺激强度和频率对...阈电位 ( D )2、在动物实验中,给予肌肉一次电...引起可兴奋细胞产生动作电位的最小刺激强度 是___ ...2015 动物细胞培养技术实验报告_生物学_自然科学_专业资料。一、实验目的 1、...细胞培养常用器皿:培养瓶、培养板、培养皿,玻璃瓶、吸管,离心管、冻存管, ...
All rights reserved Powered by
copyright &copyright 。文档资料库内容来自网络，如有侵犯请联系客服。}