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【求助】请问细胞核提取有没有什么经典方法？
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请问细胞核提取有没有什么经典方法？就是大家都认可的，用的最多的方法。谢谢！
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万分感谢！
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不要沉啊，求助求助
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请参照Pierce的EMSA protocal，里面有核质分离提取核蛋白的具体步骤
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cheff0412 edited on
我用过Thermo的试剂盒，不错，你要提细胞核的什么？蛋白还是RNA？
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夕雾云居雁 edited on
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[求助]如何提取细胞的上清？
查看完整版本请点击这里：
请教大家，想检测细胞上清中蛋白的活性，当细胞生长至对数生长期时，先用无血清的培养基处理细胞24小时后，再用药物处理，如何提取细胞上清呢？和提取细胞的蛋白有什么区别呢？查看完整版本请点击这里：
star#room ( 13:07:30)
我不是检测细胞中蛋白的活性，检测的是细胞分泌的蛋白的活性，所以要提起上清，还请大家多指教。谢谢!
sunnyB ( 13:07:57)
你可以看看这个:
蛋白抽提试剂盒-II (液体样品蛋白抽提和回收，100 extraction)
P 次提取 280 元
200 次提取 480 元
蛋白抽提试剂盒-II 用于液体样品中蛋白浓缩、提取、或脱盐、脱去垢剂、脱还原剂等。适用于各种液体样品(10 ul～1000 ml)，如蛋白溶液、胞浆胞核蛋白提取液、细胞或微生物培养基上清液、血液、尿液、脑脊液等各种体液。蛋白回收率95%，远高于经典的丙酮或三氯醋酸沉淀法，且可有效去除样品中的脂质，不影响后续SDS-PAGE和Western Blot实验。可用1.5ml离心管微量提取也可大规模制备，15分钟完成提取，简便高效。
次试剂盒也适于从细胞悬液提取总蛋白。实体组织和细胞总蛋白提取可用蛋白提取试剂盒I (Cat# P1250: Tissue/Cell Protein Extraction Kit)
(1). 溶液、血液、尿液、脑脊液、培养上清液、胞浆胞核蛋白提取液等各种体液的蛋白浓缩和提取。
(2). 原代或传代细胞悬液，可按液体方式提取总蛋白。
浓缩抽提试剂50ml。每0.5 ml浓缩试剂可处理100 ul溶液或5 x 106细胞。100次微量或10次大规模浓缩。
star#room ( 13:08:15)
非常感谢帮助！
我想知道不用试剂盒的方法，毕竟经费有限啊！
还请多指教，谢谢！
dotaaa ( 13:08:38)
细胞裂解液你可以自己配,但蛋白酶抑制剂(一般都用5种)你还是得买呀,而且不一定比买这个盒子便宜.不信你问问那5种蛋白酶抑制剂多少钱?!280够用100次不贵了,老大.
star#room ( 13:08:58)
谢谢，这几种蛋白酶抑制剂我们实验室都有，现在我主要想知道提取细胞培养液的上清和提起细胞的蛋白的区别? 谢谢 ！
xingyi08 ( 13:09:22)
我想,你提培养液上清,那这个提取试剂至少还有个浓缩的作用吧?还有或脱盐、脱去垢剂、脱还原剂等,提总蛋白的时候只是一点沉淀中加入裂解液.不能一样的对待的.
祝你实验顺利!
yes4 ( 13:09:44)
请教大家，想检测细胞上清中蛋白的活性，当细胞生长至对数生长期时，先用无血清的培养基处理细胞24小时后，再用药物处理，如何提取细胞上清呢？和提取细胞的蛋白有什么区别呢？
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第一步,将细胞上清转移到10毫升的试管,离心3000转5分钟,去掉死细胞和杂质
第二步,明确你的待查蛋白含量有多高,从你的说明看来,好象是细胞处理后分泌出来的蛋白.如果高,可以直接取样裂解后,跑WESTERN.如果含量很低,一般都要求浓缩.浓缩方法有很多种.我的实验直接使用MILLIPORE的超滤管(价格,4ml的40元).上面战友提供的试剂盒,价格还是很合理的,就是不知道质量怎么样.如果质量好,我也想试一试.此外还有很多化学浓缩方法,可以搜索蛋白质技术版块.另外,我也没有加蛋白质酶抑制剂,我的蛋白也没有降解.你可以试一试,如果也能测出来,就可以剩掉蛋白质酶抑制剂的钱了.很贵的,我们实验室有用罗式公司的,象药片,很好用.
u234 ( 13:10:04)
在药物处理的时候，使用无血清的培养液还是全培养液，是药物溶于培养液中吗？一般作用多长时间？谢谢！
star#room ( 13:10:29)
你好，我的确是检测细胞处理后分泌的蛋白质的活性，主要是用酶谱法检测基质金属蛋白酶的活性，我想知道的是细胞上清，指的是用无血清的培养基处理细胞24小时后，直接吸出培养基，离心除去死细胞以及碎片后的成分就是上清吗？但是这种情况下要加多少无血清的培养基呢？我所要检测的蛋白的浓度和这关系很大，如果量多的话，那得到的上清也多，但是蛋白的浓度也许不太大，一般说来，癌细胞分泌的MMP的浓度比较大，我没有检测过浓度，所以还不确定要不要浓度样品。我想知道上清的确切的来源？非常感谢帮助！
star#room ( 13:11:08)
怎么处理药物以及作用时间取决于你要做的实验，最好查权威文献支持，我们也可以多交流！
园丁## ( 13:11:29)
离心除去死细胞以及碎片后的成分就是上清。
显然是不能够通过蛋白定量来确定的。
最简单的方法就是严格控制你是实验条件，即细胞接种密度一致，处理药物量一致，处理的时候加的培养基也要一致。这样最后离心上清后，取等体积的上清进行实验。
另外，你可以参考文献做法。一般文献都会讲的。如果要做绝对含量，可能类似ELISA，还需要搞到他的纯化蛋白，做标准曲线。然后根据你的等体积后测量出来的值，换算成绝对含量值。
star#room ( 13:11:47)
你的建议非常有道理，但是我还有些不太明白，就是你说不能通过蛋白定量来确定，但是如果不进行蛋白定量的话，那上样的时候每个孔 的蛋白的上样量不一样，跑出来的带有可比性吗？在做western的时候不是要保证每个上样孔的蛋白总量是一样的吗，那跑出来的带的大小，深浅就说明目的蛋白的含量的差异造成的。当然我暂时先不做western，先做酶谱法检测MMP的活性。我很困惑，希望能得到大家的帮助啊！
star#room ( 13:12:25)
还希望大家多多帮助啊！
马上要做实验了，请大家多指导！
如果先用无血清培养基处理细胞后，再用药物干预的时候是用有血清的培养基还是用无血清的培养基呢？
qhyu ( 13:12:42)
其实这个问题很简单。你收集细胞上清的目的是要测定上清中蛋白的活性。你依然可采用常规蛋白的一些方法。其中稍微改变就行了
1、收集细胞上清，可通过透析浓缩或者PEG6000沉淀浓缩，因为你的蛋白含量肯定低，所以第一步是要富集蛋白，便于纯化收集。
2、当浓缩后，就是纯化蛋白，可通过柱层析纯化，或硫酸铵沉淀纯化，以前者较好。
3、检测活性。
园丁## ( 13:13:14)
你的建议非常有道理，但是我还有些不太明白，就是你说不能通过蛋白定量来确定，但是如果不进行蛋白定量的话，那上样的时候每个孔 的蛋白的上样量不一样，跑出来的带有可比性吗？在做western的时候不是要保证每个上样孔的蛋白总量是一样的吗，那跑出来的带的大小，深浅就说明目的蛋白的含量的差异造成的。当然我暂时先不做western，先做酶谱法检测MMP的活性。我很困惑，希望能得到大家的帮助啊！
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因为正常无血清培养的正常细胞上清,基本是没有蛋白的.如果要蛋白定量,你的上多大体积的样才能保证与处理组相同蛋白量.因此,较为科学的方法就是等体积检测.
园丁## ( 13:14:12)
还希望大家多多帮助啊！
马上要做实验了，请大家多指导！
如果先用无血清培养基处理细胞后，再用药物干预的时候是用有血清的培养基还是用无血清的培养基呢？
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应该还是无血清培养基
mamamiya ( 13:14:37)
我想请教大家，我的细胞是杂交瘤细胞，我要提取细胞上清抗体的含量，能使用huangxb010 说的方法吗？
mamamiya ( 13:14:55)
其实这个问题很简单。你收集细胞上清的目的是要测定上清中蛋白的活性。你依然可采用常规蛋白的一些方法。其中稍微改变就行了
1、收集细胞上清，可通过透析浓缩或者PEG6000沉淀浓缩，因为你的蛋白含量肯定低，所以第一步是要富集蛋白，便于纯化收集。
2、当浓缩后，就是纯化蛋白，可通过柱层析纯化，或硫酸铵沉淀纯化，以前者较好。
3、检测活性。
star#room ( 13:15:12)
谢谢大家的帮助！
还想请教大家上清的蛋白如何浓缩呢？具体常用的有哪些方法呢？其价格分别如何呢？有没有比较操作方便，简单价格又比较便宜的方法？（就是那种性价比好的）
再次谢谢大家了！
查看完整回复请点击这里：|/|/|/|/|/|
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【求助】请教：纯净细胞核的提取方法？
要求提取的核基因组不掺杂其他任何细胞器真核细胞基因组提取 一. 实验目的及背景 高等动物,高等植物的基因组相当宠大, 如人类细胞基因组由30亿个碱基对组成,果蝇基因组有1.4×108个碱基对,水稻基因组有1.4×109个碱基对.真核细胞基因组中,约1万-1.5万个可表达的结构基因,其它大量存在的是调控序列和内含子序列.可以说某特定物种的基因组,包含了该物种生长,发育,繁殖等各项生理活动的几乎全部信息量,因而对真核细胞基因组的结构,组成,以及表达调控的研究是至关重要的,而研究的起点就是要获得纯度高--不含蛋白质,糖类,酚,氯仿等污染;得率好--以便有足够量用于分析;基因组相对完整--断裂的基因组以便用于以后PCR分析,RFLP分析,基因文库的构建,基因探测等的研究.真核细胞基因组在提取过程中一般有以下几步,首先是机械法破细胞抽提;然后去除蛋白质,糖类等细胞内杂质污染;最后纯化出DNA,由于真核细胞基因组较大,在操作中应注意动作轻柔,且在低温下进行,以最大限度地减少机械和化学作用对DNA的剪切,从而获得相对完整的DNA.二.实验试剂及材料材料:幼嫩的植物材料0.5g左右.试剂:液氮CTAB抽提缓冲液:2%CTAB(cetyl trimethyl ammonium bromide, 十六烷基三甲基溴化铵) ,1%β-巯基乙醇 1.4mol/LNacl, 20mmol/L,EDTA, 100mmol/L, Tris-Hcl,pH8.03M NaAC50mM Tris-HCl pH8.020mM EDTA氯仿:异戊醇(24:1)异丙醇 70%乙醇 TE buffer三.实验方法 1.取0.5g植物材料,双蒸水洗净,并用滤纸吸干.2.植物材料剪成1cm左右碎片,放入预冷的瓷研钵中.3.加入液氮速冷,研磨成细粉(越细越好).4.在5ml离心管中加入抽提缓冲液2.5ml,60℃保温1小时.5. 15000rpm,离心10分钟.上清转入另一个新的离心管中. 6.加入等体积氯仿:异戊醇(24:1),混匀抽提至水乳胶融状.7. 15000rpm,离心10分钟. 8.上清转入另一个新的离心管中.9.加入2/3倍体积预冷异丙醇,-20℃保温30min―1hr,缓缓混匀DNA成絮状折出.10.15000rpm,离心10分钟,弃上清.11.DNA沉淀用 70%乙醇洗2次.12.加入400μl TE buffer溶解DNA.四.结果分析1. 为了获得较为完整的基因组DNA在实验中应注意什么问题可以申请斑竹加分不啊？我好不容易查到的哈希望有用哈1
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【求助】蛋白质提取方法
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这个帖子发布于9年零79天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
请教单层贴壁细胞蛋白质提取的详细步骤，谢谢
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1.将细胞培养液弃去,用细胞刮将细胞刮下,收集到1.5ml离心管中.2.12000rpm离心3-5min,弃去上清.3.加入50-100ul的蛋白裂解液,100mmol/l的PMSF0.5-1ul.4.冰上裂解30min,12000rpm离心15min.收集上清.5.考染检测蛋白含量,分装-80度保存备用.
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1、原料的选择早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料，- 105 - 蛋白质提取与制备 Protein Extraction and Preparation因而对提取要求更复杂一些。原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。2、前处理a、细胞的破碎材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。⑴机械方法主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度较高速捣碎机高，机械切力对分子破坏较小。小量的也可用乳钵与适当的缓冲剂磨碎提取，也可加氧化铝、石英砂及玻璃粉磨细。但在磨细时局部往往生热导致变性或pH 显著变化，尤其用玻璃粉和氧化铝时。磨细剂的吸附也可导致损失。⑵物理方法主要通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。Ⅰ反复冻融法于冷藏库或干冰反复于零下15～20℃使之冻固，然后缓慢地融解，如此反复操作，使大部分细胞及细胞内颗粒破坏。由于渗透压的变化，使结合水冻结产生组织的变性，冰片将细胞膜破碎，使蛋白质可溶化，成为粘稠的浓溶液，但脂蛋白冻结变性。Ⅱ冷热变替法将材料投入沸水中，于90℃左右维持数分钟，立即置于冰浴中使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。Ⅲ超声波法暴露于9～10 千周声波或10～500 千周超声波所产生的机械振动，只要有设备该法方便且效果也好，但一次处理量较小。应用超声波处理时应注意避免溶液中气泡的存在。处理一些超声波敏感的蛋白质酶时宜慎重。Ⅳ加压破碎法加一定气压或水压也可使细胞破碎。⑶化学及生物化学方法Ⅰ有机溶媒法粉碎后的新鲜材料在0℃以下加入5～10 倍量的丙酮，迅速搅拌均匀，可破碎细胞膜，破坏蛋白质与脂质的结合。蛋白质一般不变性，被脱脂和脱水成为干燥粉末。用少量乙醚洗，- 106 - 蛋白质提取与制备 Protein Extraction and Preparation经滤纸干燥，如脱氢酶等可保存数月不失去活性。Ⅱ自溶法将待破碎的鲜材料在一定pH 和适当的温度下，利用自身的蛋白酶将细胞破坏，使细胞内含物释放出来。比较稳定，变性较难，蛋白质不被分解而可溶化。利用该法可从胰脏制取羧肽酶。自体融解时需要时间，需加少量甲苯、氯仿等。应防止细菌污染。于温室30℃左右较早溶化。自体融解过程中PH 显著变化，随时要调节pH。自溶温度选在0～4℃，因自溶时间较长，不易控制，所以制备活性蛋白质时较少用。Ⅲ酶法与前述的自体融法同理，用胰蛋白酶等蛋白酶除去变性蛋白质。但值得提出的是溶菌酶处理时，它能水解构成枯草菌等菌体膜的多糖类。能溶解菌的酶分布很广。尤其卵白中含量高，而多易结晶化。1g 菌体加1～10mg 溶菌酶， pH6.2～7.01h 内完全溶菌。于生理食盐水或0.2mol 蔗糖溶液中溶菌，虽失去细胞膜，但原形质没有脱出。除溶菌酶外，蜗牛酶及纤维素酶也常被选为破坏细菌及植物细胞用。表面活性剂处理较常用的有十二烷基磺酸钠、氯化十二烷基吡淀及去氧胆酸钠等。此外一些细胞膜较脆弱的细胞，可把它们置于水或低渗缓冲剂中透析将细胞胀破。b、细胞器的分离制备某一种生物大分子需要采用细胞中某一部分的材料，或者为了纯化某一特定细胞器上的生物大分子，防止其他细胞组分的干扰，细胞破碎后常将细胞内各组分先行分离，对于制备一些难度较大需求纯度较高的生物大分子是有利的。尤其近年来分子生物学、分子遗传学、遗传工程等学科和技术的发展，对分布在各种细胞器上的核酸和蛋白质的研究工作日益增多，分离各种细胞器上的各类核酸和特异性蛋白质已成为生物大分子制备工作重要内容之一。各类生物大分子在细胞内的分布是不同的。DNA 几乎全部集中在细胞核内。RNA 则大部分分布于细胞质。各种酶在细胞内分布也有一定位置。因此制备细胞器上的生物大分子时，预先须对整个细胞结构和各类生物大分子在细胞内分布匹有所了解。以肝细胞为例整理如表1表1 蛋白质、酶及核酸在肝细胞内分布情况细胞器名称 主要蛋白质及酶类 核酸类细胞核 精蛋白、组蛋白、核酸合成酶系 RNA占总量10%左右DNA 几乎全部粒线体 电子传递、氯化磷酸化、三羧酸循环、脂肪酸氧化、氨基酸氧化、脲合成等酶系RNA 占总量5%左右DNA 微量内质网（微粒体） 蛋白质合成酶系、羟化酶系 RNA占总量50%左右溶酶体 水解酶系（包括核酸酶、磷酸脂酶、组织蛋白酶及糖苷及糖苷酶等）高尔基氏体 糖苷转移酶、粘多糖及类固醇合成酶系细胞膜 载体与受体蛋白、特异抗蛋、ATP 酶、环化腺苷酶、5’-核苷酸酶、琥珀酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸酶等细胞液 嘧啶和嘌呤代谢、氨基酸合成酶系、可溶性蛋白类RNA（主要为tRNA）占总量30%- 107 - 蛋白质提取与制备 Protein Extraction and Preparation细胞器的分离一般采用差速离心法。细胞经过破碎后，在适当介质中进行差速离心。利用细胞各组分质量大小不同，沉降于离心管内不同区域，分离后即得所需组分。细胞器的分离制备、介质的选择十分重要。最早使用的介质是生理盐水。因它容易使亚细胞颗粒发生聚集作用结成块状，沉淀分离效果不理想，现一般改用蔗糖、Ficoll（一种蔗糖多聚物）或葡萄糖-聚乙二醇等高分子溶液。水溶液提取：大部分蛋白质均溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中。因此蛋白质的提取一般以水为主。稀盐溶液和缓冲溶液对蛋白质稳定性好、溶度大，也是提取蛋白质的最常用溶剂。盐溶液提取：以盐溶液及缓冲液提取蛋白质进常注意下面几个因素。 3/4
盐浓度等渗盐溶液尤以0.02～0.05mol/L 磷酸盐缓冲液和碳酸盐缓冲液常用。0.15mol/L 氯化钠溶液应用也较多。如6-磷酸葡萄糖脱氢酶用0.1mol/L 碳酸氢钠液提取等。有时为了螯合某些金属离子和解离酶分子与其他杂质的静电结合，也常使用枸橼酸钠缓冲液和焦磷酸钠缓冲液。有些蛋白质在低盐浓度下浓度低，如脱氧核糖核蛋白质需用1mol/L 以上氯化钠液提取。总之，只要能溶解在水溶液中而与细胞颗粒结合不太紧密的蛋白质和酶，细胞破碎后选择适当的盐浓度及PH，一般是不难提取的。只有某些与细胞颗粒上的脂类物质结合较紧的，需采用有机溶剂或加入表面活性剂处理等方法提取。 3/4
PH 值：蛋白质提取液的PH 值首先应保证在蛋白质稳定的范围内，即选择在偏离等电点两侧。如碱性蛋白质则选在偏酸一侧，酸性蛋白质选择偏碱一侧，以增大蛋白质的溶解度，提高提取效果。如细胞色素C 属碱性蛋白质，常用稀酸提取，肌肉甘油醛-3-磷酸脱氢酶属酸性蛋白质，用稀碱提取。某些蛋白质或酶与其分物质结合常以离子键形式存在，选择PH3～6 范围对于分离提取是有利的。 3/4
温度：多数酶的提取温度在5℃以下。少数对温度耐受性较高的蛋白质和酶，可适当提高温度，使杂蛋白变性分离且也有利于提取和进一步纯化。如胃蛋白酶等及许多多肽激素类，选择37～50℃条件下提取，效果比低温提取更好。此外提取酶时加入底物或辅酶，改变酶分子表面电荷分布，也能促进提取效果。 3/4
有机溶剂提取：有机溶剂提取用于提取蛋白质的实例至今是不多的。但一些和脂结合较牢或分子中非极性侧链较多的蛋白质，不溶于水、稀盐或稀碱液中，可用不同比例的有机溶剂提取。从一些粒线体（Mitochondria)及微粒体（Microsome)等含多量脂质物质中提取蛋白质时，采用Morton 的丁醇法效果较好。因丁醇使蛋白质的变性较少，亲脂性强，易透入细胞内部，与水也能溶解10%，因此具有脂质与水之间的表面活性作用，可占据蛋白质与脂质的结合点，也阻碍蛋白质与脂质的再结合，使蛋白质在水中溶解能力大大增加。丁醇提取法的pH 及温度选择范围较广（pH3～10，温度-2℃至40℃）。国内用该法曾成功地提取了琥珀酸脱氢酶。- 108 - 蛋白质提取与制备 Protein Extraction and Preparation丁醇法对提取碱性磷酸脂酶效果也是十分显著的。胰岛素既能溶于稀酸、稀碱又能溶于酸性乙醇或酸性丙酮中。以60—70%的酸性乙醇提取效果最好，一方面可抑制蛋白质水解酶对胰岛素的破坏，同时也达到大量除去杂蛋白的目的。 3/4
表面活性剂的利用：对于某些与脂质结合的蛋白质和酶，也有采用表面活性剂如胆酸盐及十二烷基磺酸钠等处理。表面活性剂有阴离子型（如脂肪酸盐、烷基苯磺酸盐及胆酸盐等），阳离子型（如氧化苄烷基二甲基铵等）及非离子型（Triton X-100 、TirtonX-114、吐温60 及吐温80）等。非离子型表面活性剂比离子型温和，不易引起酶失活，使用较多。对于膜结构上的脂蛋白和结构，己广泛采用胆酸盐处理，两者形成复合物，并带上净电荷，由于电荷再排斥作用使膜破裂。近年来研究膜蛋白使用表面活性剂的稀溶液提取时，较喜欢用非离子型表面活性剂。 3/4
对提取物的保护：在各种细胞中普遍存在着蛋白水解酶，提取时要注意防止由它引起的水解。前面所讲的降低提取温度其目的之一也是防止蛋白水解酶的水解。多数蛋白水解酶的最适PH 在3～5 或更高些，因在较低PH 条件下可降低蛋白质水解酶引起的破坏程度。低pH可使许多酶的酶原在提取过程中不致激活而保留在酶原状态，不表现水解活力。加蛋白质水解酶的抑制剂也同样起保护作用，如以丝氨酸为活性中心的酶加二异丙基氟磷酸，以巯基为中心的酶加对氯汞苯甲酸等。提取溶液中加有机溶剂时也能产生相类似的作用。蛋白水解酶的性质变化很大，上述条件均视具体对象而变化。有一些蛋白含巯基，这些巯基可能是活性所必需。在提取这种蛋白不要带入金属离子和氧化剂。前者可往提取液中加金属螯合剂如EDTA，后者可加入还原剂如抗坏血酸。有某些蛋白质带一些非共价键结合的配基。提取时要注意保护，不要使酸基丢失。
3．操作步骤
(1)单层细胞的培养，用室温PBS洗细胞一次，然后甩干；悬浮培养的细胞，400g离心10min，收集细胞弃上清液。
(2)对于单层细胞培养，将培养瓶置于冰上，每lOOmm培养瓶加入1 mL溶解缓冲液(4℃预冷)；对于悬浮培养，将盛细胞团的试管置于冰上。按107个细胞加入1．0ml裂解液(4℃预冷)。
保存在冰箱的裂解液可随时使用。
(3)冰上放置3min，不时敲击贴壁细胞培养瓶，或轻摇悬浮培养细胞。
(4)对于单层细胞培养，敲击培养瓶数次，混合均匀，在冰床上倾斜培养瓶使溶液集中于一侧，然后将裂解物移置另一支1．5mL圆锥形试管。有些研究者喜欢从瓶壁刮取细胞，但除特殊要求外此举并非必须。
(5)单层培养的细胞或悬浮培养的细胞均以10 000g，413离心10min，仔细吸取上清液盛于另一试管，不可搅动细胞团。置冰上。此时，上清液可用于下一步的预处理。
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【求助】分细胞质细胞核提取蛋白，有protocol探讨,求助问题出在哪儿？
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这个帖子发布于9年零29天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我用细胞提取质蛋白和核蛋白做western blot。各种药物处理后收集细胞,细胞养在6cm dish。方法是:倒掉培养基，用预冷的0.01M PBS 冲洗细胞三次，最后加1ml PBS 刮细胞，放进 1 ml microtube 里， 2700 rpm, 15 min 离心,
去上清夜，留沉淀物。在沉淀物里加20 ul cytosol extraction buffer, 配制是：
(pH 7.5)： 10 ul
CA-630( NP-40)：6 ul
NaCl ：50 ul
EDTA：2 ul
Protease Inhibitors：50 ul
D.W： 882 ul （总共1ml）加完之后混匀了在冰上放置5分钟，然后 4000 rpm, 5 min 离心，取上清夜为细胞质蛋白。取完上清夜后在沉淀物里再加15 ul nuclear extraction buffer,其配制是：
(pH 7.5)： 20 ul
100% glycerol：250 ul
3M NaCl ： 140 ul
MgCl2：12 ul
0.5 M EDTA： 4 ul
Protease Inhibitors：50 ul
D.W ：527.1 ul （总共 1 ml）加完混匀，在冰上放置30min, 每5分钟 vortex（混淆）一次，然后14000 rpm, 30 min 离心， 取上清夜为细胞核蛋白。加裂解液做了western blot, 细胞核的条带出来的挺好，不过细胞质的条带有拖下来的现象，条带边界不明显，定量困难无法分析。有人告诉我条带托下来可能是抗体问题或者跑电泳时间太长分得太开了，我缩短跑泳时间还是没有效果，至于抗体，以前我用过，别人也用过都没问题。求前辈高人指教！！ 怎样才能让cytosol条带出来的正常呢！！
不知道邀请谁？试试他们
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从您的描述来看，我认为你将这种条带的差异归因于提取方法。我认为从你的提取方法来看，这两者提取没有显著性差异，裂解液组成应该对蛋白的条带不会产生这类的影响。在提取蛋白的过程中可能应该更加注意蛋白的保存，整个操作过程应该快速的，在冰上进行，首先提出来的胞浆蛋白应该立即置于冰上或者立即定量后加上样缓冲液沸水浴。我认为你应该更多的从电泳上找问题。1. 根据分子量选择正确的SDS-PAGE凝胶浓度。2. 浓缩胶一定要有足够的高度，有利于条带的充分压缩。3. 适当减少上样量，有助于条带的清晰分离。除了以上几点之外还有就是可以适当减低一抗的浓度，在压片的时候减少曝光和显影的时间，我想这种情况是能够避免的。重复几次，如果总是出现这样的结果，可以再发帖上来继续讨论。by the way，图已经很不错了，继续努力！
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谢谢您的建议。再请教：分子量65，凝胶用10%是不是还可以？浓缩胶的高度指的是什么？浓缩胶离玻璃上口约有1ml左右还理想吧？有人说不要跑电泳时间太长让条带分得太开，您认为呢？上图中胞浆和细胞核上样量都是20 ug，胞浆条带拖下来而核正常，您认为是胞浆的上样量太多而导致的问题吗？在图中看确实显得cytosol的蛋白量比nuclear多，可是我定量后上的样，都一样是20 ug呀！再次非常感谢您的帮助，我已经做过有三四次了，都是这样。我已经无计可施了~~
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请问楼上的，关于图，我可能不知什么原因，但是我想请教你的提取胞浆，核蛋白的操作方法，第一个步骤可以提取胞浆蛋白，也就是可以裂解细胞膜，但是核膜不会被裂解，我想问的是如何可以保证这一点呢？能否告诉我吗？因为我现在也在提取细胞器的蛋白，但是总不成功，最大的一点就是污染，提取的核蛋白中可能也包含着浆蛋白，请问你是怎么处理的？
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分胞浆和胞核的实验我只做个几次，这个实验进程安排在后一阶段，现在做别的实验，但是我们实验室以前的人做过，所以有protocol, 我想他们也是按照别的论文做的实验，自己没有证实过这样分核到底分的彻不彻底。如果条件允许的话我推荐你一个分胞浆胞核的试剂盒， 产品号码是 78833，也有介绍详细的方法
另外，如果需要验证分的好不好，就可以买单在细胞核里存在的抗体，如nucleolin, 进Santa Cruz找 c23就可以。
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关于细胞核及细胞器的提取，我做过多次，最大的问题就是提的不彻底，如提取的核蛋白，不仅要用核特异性蛋白核仁素，另外Lamin-B也可以，这样用以来平衡，同时还要用actin或tublin用来鉴别是否有胞浆蛋白的污染。所以我想问的也是这个问题，提取倒是很容易做，但是有时候蛋白的污染也是个严重的问题。我有空的时候可以试一试这个方法，呵呵
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D.W 是什么啊 请问
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蒸馏水 是应该写DW吗？ 抱歉^^
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关于丁香园}