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质粒载体 即，在由修饰过的质粒DNA序列中插入外源的，以质粒为载体，将目的基因通过转化或转导的方法导进，进行重组、筛选、扩增的过程。
质粒载体简介
质粒是小型环状DNA分子，在基因工程中作为最常用，最简单的载体，必须包括三部分：遗传标记基因，复制区，目的基因。 质粒在所有的细菌类群中都可发现，它们是独立于细菌染色体外自我复制的分子。自然界中，质粒是在营养充足时出现的，它在结构、大小、复制方式，每个细菌的拷贝数，在不同的细菌体内的不同，在菌种之间的转移力等方面都会变化，可能最重要的是质粒所携带的特征的改变。大多数原核生物的质粒是双链环状的DNA分子；但是无论是在革兰氏阳性还是阴性菌体内都可以发现。质粒大小变化很大，可从几个到数百个kb。质粒依靠宿主细胞提供的蛋白质进行复制，但也可以使宿主细胞获得质粒编码的功能。质粒复制可以与细菌的细胞周期同步，导致菌体内质粒的拷贝数较低，质粒复制也可独立于细胞周期，使每个菌体内扩增了成百上千个质粒拷贝。一些质粒在菌种间可自由地转移它们的DNA分子，另一些只转移质粒给同种细菌，而有些却根本不转移它们的DNA。质粒带有具有许多功能的基因，这些功能包括对抗生素和重金属道德抗性、对诱变原的敏感性、对噬菌体的易感或抗性、产生限制酶、产生稀有的氨基酸和毒素、决定毒力、降解复杂有机分子，以及形成共生关系的能力和在生物界内转移DNA的能力。
质粒载体基本特征
质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。其特点如下：
是染色质外的双链共价闭合环形DNA
（covalently closed circular DNA,cccDNA），可自然形成超螺旋结构，不同质粒大小在2-300kb之间，&15kb的小质粒比较容易分离纯化，&15kb的大质粒则不易提取。
能自主复制，是能独立复制的复制子
（autonomous replicon）。一般质粒DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂而传给后代。按质粒复制的调控及其拷贝数可分两类：严紧控制（stringent control）型质粒的复制常与宿主的繁殖偶联，拷贝数较少，每个细胞中只有1个到十几个拷贝；另一类是松弛控制（relaxed control）型质粒，其复制宿主不偶联，每个细胞中有几十到几百个拷贝。每个质粒DNA上都有复制的起点，只有ori能被宿主细胞复制蛋白质识别的质粒才能在该种细胞中复制，不同质粒复制控制状况主要与复制起点的序列结构相关。有的质粒的可以整合到宿主细胞染色质DNA中，随宿主DNA复制，称为附加体，例如细菌的性质粒就是一种附加体，它可以质粒形式存在，也能整合入细菌的DNA，又能从细菌DNA上切下来。F因子携带基因编码的蛋白质能使两个细菌间形成纤毛状细管连接的接合（conjugation），通过这细管遗传物质可在两个细菌间传递。
质粒对宿主生存并不是必需的
这点不同于线粒体，也是环状双链分子，也有独立复制的调控，但线粒体的功能是细胞生存所必需的。线粒体是细胞的一部分，质粒也往往有其表型，其表现不是宿主生存所必需的，但也不妨碍宿主的生存。某些质粒携带的基因功能有利于宿主细胞的特定条件下生存，例如，细菌中许多天然的质粒带有抗药性基因，如编码合成能分解破坏四环素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，这种质粒称为抗药性质粒，又称R质粒，带有R质粒的细菌就能在相应的抗生素存在生存繁殖。所以质粒对宿主不是寄生的，而是共生的。医学上遇到许多细菌的抗药性，常与R质粒在细菌间的传播有关，F质粒就能促使这种传递。
分子生物学使用的质粒载体都已不是原来细菌或细胞中天然存在的质粒，而是经过了许多的人工的改造。从不同的实验目的出发，人们设计了各种不同的类型的质粒载体，发展很快，新的有特定用途的质粒不断被创建。图20-2给出最常用的大肠杆菌克隆用质粒pUC19的图谱，此质粒的复制起点处序列经过改造，能高频率起动，使一个细菌pUC19的可达500-700个；质粒携带一个抗氨芐青霉素基因，编码能水解环，从而破坏氨芐青霉素的酶，当用pUC19转化细菌后放入含氨芐青霉素的培养基中，凡不含pUC19者都不能生长，结果长出的细菌就是都含有pUC19的；pUC19还携带细菌lac操纵元中的lacI和lacZ基因编码，N端状146个氨基酸的段落，当培养基中含有IPTG和Xgal时，lacz ' 基因被诱导表达产生的β-半乳糖苷酶N端肽与宿主菌表达的C端肽互补而具有β-半乳糖苷酶活性（质粒和宿主编码的肽段各自都没有酶活性，两都融为一体而具酶活性，称为，α-complementation），半乳糖苷酶水解Xgal而使呈现蓝色；在lacz '中间又插入了一段人工设计合成的DNA序列，其中密集多个常用的的位点，使外来的基因和序列能很方便地被插入此位置，当外来序列插入后则破坏了lac 'z编码的半乳糖苷酶活性，生长的菌落就呈白色，这种颜色标志的变化就很容易区分和挑选含有和不含有或基因的转化菌落，称为法。
除常用的大肠杆菌质粒载体外，还发展了许多人工构建的其它能用于微生物、酵母、植物等的质粒载体。含有不止一个ori、能携带插入序列在不同种类中繁殖的载体称为（shuttle vectors）。
质粒载体分类
按复制形式
分为严紧型和松弛型复制。
根据质粒DNA复制与宿主之间的关系或在宿主细胞的拷贝数的多少，可以将质粒分为两种不同的复制类型：严紧型和松弛型。严紧型质粒复制受宿主染色体DNA复制的严格控制，拷贝数较小一般只有1~3个拷贝。疏松型质粒的复制宿主的控制比较松，在宿主中的拷贝数比较多，一般有10~200个拷贝，有时可达到700个。[1]
按基因转移性
分两类：（1）传递性质粒：常为大型、严紧型质粒；
（2）非传递性质粒：多为小型、松弛型质粒。
按遗传性状、产物分类
（1）抗生素抗性：如、氯霉素抗性；
（2）限制酶-修饰酶（R-M）系统：如hsdR-菌株可使，但不限制外源DNA；hsd-菌株为限制和甲基化双缺陷型。
人工构建的质粒载体分类
高拷贝数的质粒载体
ColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点。适合大量增殖克隆基因，或需要大量表达的。
低拷贝数的质粒载体
由 pSC101派生来的载体特点是分子量小的拷贝数。它有特殊的用途：当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌的死亡时，就需要低拷贝的载体。
失控的质粒载体
这是一类温度敏感型复制控制质粒。如pBEU1、 pBEU2。
插入失活型克隆载体。载体的位于其某一个基因内部。如pDF41、pDF42。
正选择的质粒载体
直接选择转化后的细胞。只有带有选择的转化才能在上生长。
质粒载体筛选特征
选择质粒载体的要素是要了解可用到的载体的特征和预测重组克隆所用于的实验。
所有的质粒载体都有三个共同的特征：一个复制子、一个选择性标志和一个克隆位点。复制子是含有DNA复制起始位点的一段DNA（ori），也包括表达由质粒编码的复制必需的RNA和蛋白质的基因。对于质粒在细胞内持续存在时必不可少的。克隆位点是切割位点，外源性DNA可由此插入质粒内，而且并不影响质粒的复制能力，或为宿主提供选择性表型。
选择性标志：编码抗生素抗性的基因对质粒载体来说是最普遍的细菌选择性标志（如pBR322）；主要的抗生素选择基因有：氨苄青霉素，氯霉素，四环素和卡那霉素四种。转化的宿主菌一般都是抗生素敏感型的，获得质粒后，它能在有抗生素的平板上生长，从而达到筛选的要求。另一个显性的选择标志就是对感染的免疫（也就是λ阻抑物）。有时也会用的一些隐性标志，如leuB-（亮氨酸存在时就不能生长）。
质粒载体多位点
如今的载体都含有一多克隆位点（Multiple cloning site, MCS）或多位点接头[包含约20个串联排列的位点（如pUC19）]这些位点在载体内通常是独一无二的，这样就可以防止插入片段插入不恰当的位置，如载体其他的特征导致破裂的位点。的存在可以确保载体合适大部分的DNA片段，可以针对提供特定的酶切位点图谱，在质粒重组操作方面具有更大的灵活性。在选择质粒载体时既要考虑在多接头处出现的是何位点，又要考虑到这个位点的顺序，因为必须确保特定的位点存在于多接头里。
质粒载体载体大小
大的质粒（大于15kb）不会很好转化而且DNA产量通常很低。在设计实验时要考虑到加入的最终载体大小，尽量用更小的载体。
当多于一个质粒载体必须同时存在于同一个细菌细胞中，这两个质粒的复制子必须是兼容的。当他们不能稳定地共存时，则认为这两个质粒是不兼容的。
选择/检测插入片段：
为了鉴别质粒中是否含有插入片段，对一些载体进行了工程改造，这样产生的多位点接头的分离会引起可见的表型。例如：lacZ的应用（多位点接头的分离会引用白细胞的生长而抑制蓝细胞的生长，如pU19）和cccdB基因（调控细胞死亡）的应用（分离会促进细胞存活）。
参考资料：
质粒载体的定向克隆
陈宏．基因工程．北京：中国农业出版社，2011.6：52
企业信用信息DNA重组技术的基本工具_百度文库
DNA重组技术的基本工具
DNA重组技术的基本工具
【本节重难点】
重点：DNA重组技术所需的三种基本工具的作用
难点：基因工程载体所需要具备的条件
【知识精讲】
基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。
注意：对本概念应从以下几个方面理解：
基因工程的基本工具
1.限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
（1）限制性内切酶的来源：主要是从原核生物中分离纯化来的。
（2）限制性内切酶的功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并能将每一条链上特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键切开。
（3）限制性内切酶的切割方式：①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。
注意：比较有关的DNA酶
（1）DNA水解酶：能够将DNA水解成四种脱氧核苷酸，彻底水解成膦酸、脱氧核糖和含氮碱基
（2）DNA解旋酶：能够将DNA或DNA的某一段解成两条长链，作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。注意：使DNA解成两条长链的方法除用解旋酶以外，在适当的高温（如94℃）、重金属盐的作用下，也可使DNA解旋。
（3）DNA聚合酶：能将单个的核苷酸通过磷酸二酯键连接成DNA长链。
（4）DNA连接酶：是通过磷酸二酯键连接双链DNA的缺口。注意比较DNA聚合酶和DNA连接酶的异同点。
2.DNA连接酶——“分子缝合针”
（1）DNA连接酶的分类：E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。
（2）作用及作用部位：E.coliDNA连接酶作用于黏性末端被切开的磷酸二酯键，T4DNA连接酶作用于黏性末端和平末端被切开的磷酸二酯键。
3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
（1）分子运载车的分类：①质粒：常存在于原核细胞和酵母菌中，是一种分子质量较小的环状的裸露的DNA分子，独立于拟核之外。②病毒：常用的病毒有噬菌体、动植物病毒等。
（2）运载体使用的目的：①是用它做运载工具，将目的基因转运到宿主细胞中去。②是利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
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贡献者：nevin47
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载体（vector）是携带靶DNA（目的DNA）片段进入宿主细胞进行扩增和表达的运载工具。常用的载体是通过改造天然的细菌质粒、噬菌体和病毒等构建而成。目前已构建成的载体主要有质粒载体、噬菌体载体、病毒载体和人工染色体等多种类型，亦可根据其用途不同分为克隆载体和表达载体二类。
载体的构建和选择应考虑以下几个主要的条件：①在宿主细胞中具有自主复制能力或能整合到宿主染色体上与基因组一同复制的能力；②有合适的限制性酶切位点供外源DNA片段插入，多种酶单一位点使载体在使用上具有较大的灵活性；③分子量不宜过大，以便于容纳较大的外源DNA片段并获得较高的拷贝数，也有利于体外重组操作。④具有合适的筛选标记，以便区分阳性重组体和阴性重组体，常用的筛选标记有抗药性、酶基因、营养缺陷型或形成噬菌斑的能力等。⑤配备与宿主相适应的调控元件，如启动子、增强子和前导序列等。
一、质粒载体
质粒是细菌染色体以外具有自主复制能力的小型双链环状DNA分子。在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的天然质粒有ColE1、RSF2124和 pSC101等。鉴于天然质粒作为克隆载体存在着不同程度的局限性，各实验室便对其进行修饰改造，并逐步完善。依复制是否受宿主细胞蛋白质合成控制分紧密型质粒（stringent plasmid）和松驰型质粒（relaxed plasmid）。质粒载体大多是在天然松驰型质粒的基础上经人工改造拼接而成。这类质粒在宿主蛋白质合成及染色体复制停止后尚能继续复制至上千个拷贝。利用这一原理，在质粒扩增时，通过加入氯霉素抑制大肠杆菌蛋白质合成，达到进一步扩增质粒的目的。
一种用作克隆载体的理想质粒一般具备下述特点：①具有松驰型复制子（如ColE1），复制子（replicon）是质粒自我增殖所必不可少的基本条件，并可协助维持使每个细胞含有一定数量的质粒拷贝。②在复制子外存在几个单一的酶切位点（或多克隆位点），以便目的DNA片段插入。③具有插入失活的筛选标记，理想的质粒载体应具有两种抗菌素抗性标志，如氨苄青霉素抗性基因（Ampr）和四环素抗性基因（Tetr）等，以便从平板中直接筛选阳性重组子。④分子量相对较小和较高的拷贝数。此外，质粒的缺点是容量较小，一般只能接受小于15kb的外来DNA，插入片段过大会导致重组子扩增速度减慢，甚至使插入片段失活。
下面介绍几种有代表性的质粒载体。
㈠ pBR332质粒载体
pBR332质粒就是按这种设想构建的一种大肠杆菌质粒载体。pBR332是最早被广泛应用于分子克隆的载体之一，至今尚在使用。pBR332的结构如图7-1所示，是研究得最清楚的质粒，为一个4.36kb的环状双链DNA。pBR332由三个不同来源的部分组成：①来源于ColE1的派生质粒pMB1的复制起始位点（ori）；②来源于pSF2124质粒易位子Tn3的Ampr；③来源于pSC101质粒的Tetr。
pBR332质粒载体具有下述特点：
1．带有一个复制起始位点 保证该质粒能在大肠杆菌中复制。
2．具有二个抗性基因（Ampr和Tetr）作选择标记和数个单一的限制性酶切位点 其中三个单一的酶切位点BamHⅠ、HindⅢ和SalⅠ均在Tetr基因内，PstⅠ识别位点在Ampr基因内。当外源基因插入这些抗性位点时，就分别成为Amp敏感（Amps）或Tet敏感（Tets），即插入失活。
3．具有较小的分子量 pBR332质粒载体的这种小分子量特征，不仅易于自身DNA的纯化，而且能有效地克隆6kb大小的外源DNA片段。
4．具有较高的拷贝数 而且经氯霉素扩增后，每个细胞可累积1 000~3 000个拷贝，这为重组DNA的制备提供了极大的方便。
图7-1 pBR332质粒结构示意图
㈡ pUC质粒载体系列
pUC质粒是在pBR332基础上改建而成的。它们保留了pBR332的一部分，组入了一个来自M13噬菌体在其5&-端带有一段多克隆位点的LacZ&基因，而发展成为具有双重检测特征的新型质粒载体系列。一个典型的pUC系列的质粒载体包含如下4个组成部分：①来自pBR332 质粒的复制起始位点（ori）；②Ampr基因，但其DNA序列已不再含有原来的核酸内切酶单一识别位点；③大肠杆菌&-半乳糖苷酶基因（LacZ）的启动子及其编码&-肽链的DNA序列，此结构称为LacZ&基因；④位于LacZ&基因中靠近5&-端的一段多克隆位点区段，但并未破坏该基因的功能。
pUC系列的多克隆位点一一对应于M13mp系列。PUC系列大多数是成对的，如pUC8/pUC9、pUC18/pUC19，即每对间含有大致相同的多克隆位点（个别切口又可不同），但整个多克隆位点反向倒装（故称其为一对）。不同对的pUC系列质粒载体的多克隆位点的数目和种类不同。
与pBR332质粒载体相比，pUC系列具有许多方面的优越性，是目前基因工程研究中最通用的大肠杆菌克隆载体之一。其优点有：①具有更小的分子量和更高的拷贝数，在构建pUC系列时仅保留了pBR332的复制子和Ampr；②适应于组织化学筛选重组体，pUC质粒结构中具有来自大肠杆菌LacZ操纵子的LacZ&基因，其编码的&-肽链可参与&-互补作用。目的基因插入后，破坏LacZ基因的完整性。在重组实验中，可用异丙基-&-D-硫代半乳糖（IPTC）诱导LacZ基因表达&-半乳糖苷酶(&-galactosidase)，该酶能消化5-溴-4-氯-3-吲哚-&-D-硫代半乳糖（X-gal）产生蓝色产物。若LacZ基因插入失活，则缺乏&-半乳糖苷酶表达，也就不能消化X-gal，菌落为白色即阳性重组体克隆，此称作蓝白斑实验；③pUC系列的多克隆位点与M13mp系列对应，因此克隆的外源DNA片段就可以在二类载体系列之间来回&穿梭&，这使克隆序列的测序极为方便。
pUC18/pUC19质粒载体
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