当前位置：
＞＞＞(选做题)人类在预防与诊疗传染性疾病过程中，经常使用疫苗和抗体..
(选做题)人类在预防与诊疗传染性疾病过程中，经常使用疫苗和抗体。已知某传染性疾病的病原体为RNA病毒，该病毒表面的A蛋白为主要抗原，其疫苗生产和抗体制备的流程之一如下图：
请回答：(1)过程①代表的是_________。(2)过程②构建A基因表达载体时，必须使用_______和_______两种工具酶。(3)过程③采用的实验技术是________，获得的X是________。(4)对健康人进行该传染病免疫预防时，可选用图中基因工程生产的________所制备的疫苗。对该传染病疑似患者确诊时，可从疑似患者体内分离病毒，与已知病毒进行______比较；或用图中的________进行特异性结合检测。
题型：读图填空题难度：中档来源：山东省高考真题
(1)逆(反)转录(2)限制性核酸内切酶(限制酶)&&&& DNA连接酶(注：两空顺序可颠倒)(3)细胞融合&&& 杂交瘤细胞(4)A蛋白&& 核酸(基因)序列&&& 抗A蛋白的单克隆抗体
马上分享给同学
据魔方格专家权威分析，试题“(选做题)人类在预防与诊疗传染性疾病过程中，经常使用疫苗和抗体..”主要考查你对&&基因工程的基本操作程序，基因诊断与基因治疗，生物技术药物与疫苗，DNA重组技术的基本工具，单克隆抗体&&等考点的理解。关于这些考点的“档案”如下：
现在没空？点击收藏，以后再看。
因为篇幅有限，只列出部分考点，详细请访问。
基因工程的基本操作程序基因诊断与基因治疗生物技术药物与疫苗DNA重组技术的基本工具单克隆抗体
基因工程的基本操作程序：1、目的基因的获取（1）目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因。（2）获取方法：①从基因文库中获取；②人工合成（反转录法和化学合成法）；③PCR技术扩增目的基因。2、基因表达载体的构建（1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。（2）组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。如图：①启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。②终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。③标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。（3）基因表达载体的构建过程：3、将目的基因导入受体细胞（1）转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。（2）常用的转化方法：
（3）重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。4、目的基因的检测和表达（1）首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。（2）其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。（3）最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原--抗体杂交。 （4）有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。知识点拨：1、构建基因文库的目的为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。 2、PCR技术：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。PCR扩增是获取目的基冈的一种非常有用的方法，也是进行分子鉴定和检测的一种很灵敏的方法。目的：通过指数式扩增获取大量的目的基因。 3、基因文库中不是直接保管相应基因，基因文库中的基因保存在受体菌中。 4、在基因工程的四个操作步骤中，只有第三步将目的基因导入受体细胞不需碱基互补配对，其余三个步骤都涉及碱基互补配对。5、原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，有利于目的基因的复制与表达，因此常用大肠杆菌等原核生物作为受俸细胞。 6、植物细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程成为完整植物体，因此受体细胞可以是受精卵也可以是体细胞；动物基因工程中的受体细胞一般是受精卵。7、转化的实质是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中，从而使受体生物获得了新的遗传特性的现象，从其变化的实质看，这种变异属于可遗传变异中的基因重组。 知识拓展：1、基因文库的构建：（1）概念①基因组文库：含有一种生物的全部基因。将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因组文库。 ②cDNA文库：只包含了一种生物的部分基因。 （2）构建过程
2、人工合成目的基因（1）反转录法：（2）人工合成目的基因3、PCR技术扩增目的基因①原理：DNA双链复制②过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链；第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。基因诊断与基因治疗：1、基因诊断技术的原理（1）基因诊断：是用放射性同位素（如32P）、荧光分子等标记的DNA分子做探针，利用DNA分子杂交原理，鉴定被检测样本上的遗传信息，从而达到检测疾病的目的。（2）基因诊断的对象主要包括病原微生物的侵入，先天遗传性疾病和后天基因突变引起的疾病等方面。目前，基因诊断已在病毒性肝炎、艾滋病等传染病的诊断中发挥了不可替代的作用。（3）通过基因诊断的方法检测其发生突变的基因，对于临床诊断、了解发病机理和疾病治疗都具有重要的意义。（4）基因诊断的应用：传统诊断遗传疾病的方法是通过表现型来推测基因型。基因诊断则是从基因着手来推断表现型，这种方法不受细胞类型和发病年龄的限制，可用于一切遗传病的诊断。如半乳糖血症是一种先天性糖代谢缺陷症，通过基因诊断，发现病人缺少一个合成半乳糖转移酶的基因。如果把半乳糖转移酶的基因转入缺乏这一基因的人体中，便可以使他的缺陷症状得到改善。2、基因治疗的发展前景（1）基因治疗：就是把特定的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，从而达到治疗疾病的目的。（2）基因治疗恶性肿瘤的方案有两种：①杀死肿瘤细胞——将抑制癌细胞增生的基因转入到癌细胞内，不仅可以阻断癌细胞繁殖，还可以诱导它自杀死亡；或将一段可以抑制癌基因转录的DNA序列导入癌细胞，使癌基因不能表达，癌细胞也就不能增殖。②将提高人体免疫力的基因导入免疫系统，以提高人体防御功能，由人体免疫系统杀死癌细胞。（3）基因治疗的步骤：选择治疗基因→将治疗基因和运载体结合导入到患者体内→治疗基因在细胞内正常表达。知识拓展：1、基因芯片：是将大量特定序列的DNA片段有序的固定在尼龙膜、玻片或硅片上，从而能大量、快速、平行地对DNA分子的碱基序列进行测定和定量分析。2、基因芯片的应用：用于寻找和鉴定与疾病相关的基因；用于传染病的检测。例肿瘤细胞的检测、预测老年痴呆、糖尿病，艾滋病、前列腺癌等。生物技术药物与疫苗：1、生物技术药物：（1）概念：一般是指利用DNA重组技术或其他生物技术生产的药物。（2）内容：包括基因工程药物、酶工程药物、发酵工程药物、细胞工程药物等。2、基因工程药物（1）生产过程：获得目的基因→构建基因工程菌→工程菌大规模培养→产物分离纯化→除菌过滤→半成品检测→成品加工→成品检测。（2）例子：大肠杆菌合成人胰岛素、干扰素等。3、细胞工程药物（1）制取过程：植物细胞株→固体培养→液体悬浮培养→收集细胞→提取纯化产物→药物制剂 。（2）例子：人参、甘草、红豆杉、黄连、隐形、紫草和长春花等植物药物已经细胞培养成功；乙肝疫苗狂犬病疫苗和脊髓灰质炎疫苗等，以及干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子等动物细胞培养药物。4、生物技术疫苗：指基因工程疫苗。将病原体的某个或几个抗原基因转入适当的宿主细胞进行表达，获得的表达产物就可以作为疫苗使用。5、DNA疫苗的应用前景广阔。（1）DNA疫苗：又称核酸疫苗，是将致病微生物中，能够编码引起机体免疫反应的抗原基因与适当的载体结合，通过基因工程方法导入宿主细胞，并与宿主染色体整合，通过宿主细胞的转录、翻译表达出抗原，诱导宿主产生免疫应答，从而达到预防和治疗疾病的目的。（2）DNA疫苗在某些肿瘤、艾滋病和肝炎等疾病的预防上可以发挥独特的作用。知识拓展：1、基因工程药物的生产中，最主要的环节是构建工程菌，即通过转基因技术将目的基因转入细菌中，形成基因重组工程菌。利用工程菌可以高效地生产出各种高质量、低成本的药品。2、在动物细胞培养中，培养的细胞通常取自动物胚胎或出生不久的幼龄动物。3、生物技术疫苗的载体不仅可以是微生物、动物细胞，还可以是动物体和植物体。目前美国已经在14个州试种了300多种“制药”作物，如生产乙型肝炎疫苗的转基因药用西红柿、香蕉等。这种转基因植物为疫苗的接种和普及提供了方便。利用生物技术不仅可以生产抗原蛋白起到疫苗的作用，还可以利用生物技术敲除病原体中的某些致病基因，获得减毒更彻底、安全性更高的减毒活疫苗，如腺病毒疫苗等。DNA重组技术的基本工具：1、基因工程的概念：
2、基本工具：（1）“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。②功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。③结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。即&当限制性内切酶作用于特定的DNA时，把这段序列沿着特定的切点切开的这个过程分两种情况：a、沿着中轴线切口（即沿着DNA双链中对应的磷酸二酯键）切开，得到的就是两个平末端；b、在中轴线的两端切口切开，得到的就是两个黏性末端。例如：EcoRⅠ限制性内切酶就可以识别G/AATTC的DNA序列，然后在G和A间切开，得到的就是两个黏性末端（之间可以根据碱基互补配对原则重组）限制酶的切口不都是一长一短的，一长一短的叫黏性末端，一样长的叫平末端。“粘性末端”在高中教材中也作“黏性末端”。如图：（2）“分子缝合针”——DNA连接酶
&（3）“分子运输车”——载体①载体具备的条件：能在受体细胞中复制并稳定保存；具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入；具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。②最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。③其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒知识点拨：1、限制酶识别的序列的特点：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如图，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。如以中心线为轴，两侧碱基互补对称；以为轴，两侧碱基互补对称。2、获取目的基因和切割载体时使用同种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。3、获取一个目的基因需限制酶剪切两次，共产生 4个黏性末端或平末端。 4、限制酶切割位点的选择必须保证标记基因的完整性，以便于检测。 单克隆抗体：1、抗体：一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。2、单克隆抗体的制备（1）制备产生特异性抗体的B淋巴细胞：向免疫小鼠体内注射特定的抗原，然后从小鼠脾内获得相应的B淋巴细胞 （2）获得杂交瘤细胞①将鼠的骨髓瘤细胞与脾细胞中形成的B淋巴细胞融合；②用特定的选择培养基筛选出杂交瘤细胞，该杂种细胞既能够增殖又能产生抗体。（3）克隆化培养和抗体检测（4）将杂交瘤细胞在体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖（5）提取单克隆抗体：从细胞培养液或小鼠的腹水中提取 3、单克隆抗体的应用(1)作为诊断试剂，具有准确、高效、简易、快速的优点。(2)用于治疗疾病和运载药物。 血清抗体与单克隆抗体的比较：
知识点拨：1、融合的结果是有很多不符合要求的；如有2个B淋巴细胞融合的细胞等，所以要进行筛选。2、筛选出能够分泌所需抗体的杂种细胞。3、杂交瘤细胞的特点：既能大量繁殖，又能产生专一的抗体。4、单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并能大量制备。5、单克隆抗体的作用：作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合，具有准确、高效、简易、快速的优点。用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症治疗，可制成“生物导弹”，也有少量用于治疗其它疾病。知识拓展：制备单克隆抗体过程中的筛选：筛选是将未融合的B淋巴细胞、骨髓瘤细胞以及BB融合、瘤瘤融合的细胞通过选择培养基淘汰，筛选出B瘤融合的细胞。筛选是将产生特定抗体的B瘤细胞通过细胞培养用相应抗原检测的办法筛选出来。因为从体内取免疫过的B淋巴细胞时取出很多种，形成的杂交瘤细胞有很多种，所以需筛选出产生特定抗体的杂交瘤细胞。
发现相似题
与“(选做题)人类在预防与诊疗传染性疾病过程中，经常使用疫苗和抗体..”考查相似的试题有：
729937259870058791148152073350请问稳定转染挑取单细胞克隆的方法(转染,单细胞,克隆,单克隆) - 细胞实验 - 生物秀
标题: 请问稳定转染挑取单细胞克隆的方法(转染,单细胞,克隆,单克隆)
摘要: [请问稳定转染挑取单细胞克隆的方法(转染,单细胞,克隆,单克隆)] 我做了细胞的稳定转染，一个月后用流式筛选阳性克隆。在G418筛选后约二周，我用枪头挑取的单克隆细胞。扩增二周后做的流式。结果6个中有两个有阳性结果，但峰形不好，我想知道：是同一株细胞在增殖后会出现表达量的差异？还是同一株细胞的表达不会发生变化，峰形的分离是由于当初挑取的细胞不是单克隆？请各位多多指教！ 关键词:[转染 克隆 单细胞 单克隆 表达量 阳性结果 筛选阳性克隆]……
我做了细胞的稳定转染，一个月后用流式筛选阳性克隆。在G418筛选后约二周，我用枪头挑取的单克隆细胞。扩增二周后做的流式。结果6个中有两个有阳性结果，但峰形不好，我想知道：是同一株细胞在增殖后会出现表达量的差异？还是同一株细胞的表达不会发生变化，峰形的分离是由于当初挑取的细胞不是单克隆？请各位多多指教！
回复各位师兄师姐，你们用什么方法挑取单克隆呀？
相关热词：
..........
生物秀是目前国内最具影响力的生物医药门户网站之一，致力于IT技术和BT的跨界融合以及生物医药领域前沿技术和成功商业模式的传播。为生物医药领域研究人员和企业提供最具价值的行业资讯、专业技术、学术交流平台、会议会展、电子商务和求职招聘等一站式服务。
官方微信号：shengwuxiu
电话：021-您现在的位置：&&>&&>&&>&&>&正文
丁香园论坛
我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单克隆化鉴定。有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方，大家补充。筛选之前确定G418浓度：1，由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。2，G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。3，汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50% 4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。一个具体试验：3*106个细胞电转后，分别接种1/0，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。这时药物浓度可以降至200ug/ml。2，加抗生素的时机，主要是考虑插入到细胞的抗性基因是否已经得到表达。一般是转染48小时后加入抗生素。挑出单克隆后就可以用维持浓度，一般是筛选浓度的1/2。关于维持浓度，有人说细胞会出现对抗生素的抗性，应不断提高其浓度。而且，如果你要挑选到几个阳性克隆中较高表达的克隆的话，可以调整抗生素的浓度。当然，抗性基因高表达，目的基因不一定就跟着高表达。筛选时的培养液加药筛选约6天左右，细胞会大量死亡，孔中只剩下的细胞寥寥无几。这时会出现两个问题：1， 死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有neo表达的阳性细胞死亡，即非选择性死亡，因此要及时换液2 ，孔中细胞数目很少，细胞之间的信号会变得很弱，也会导致阳性细胞的状态不佳甚至死亡。这个时候需要一种特殊的培养液：假如你要转染3T3细胞，在3T3细胞汇合度达到80%的时候，换液，培养过夜之后收集培养液，通过滤器消毒，和新鲜的培养液按1：1混合备用。再转染后筛选过程中就可以应用这种培养基。3，适当增加血清浓度。筛选时出现的问题及其解决办法：1， 问题1。做hela细胞的筛选，现在已经筛选3周，在6孔板中已经长出一些细胞簇，想把它挑到96孔板中，就用2ul胰酶消化，在消化过程中，胰酶扩散，细胞已经四散开，和周围的其它细胞簇融合在一起（我的细胞簇离的很近），就是说几个细胞簇被胰酶融合在一起，那样根本没有办法做下去了，该怎么办？ a、可以减少胰酶量；胰酶在加入之前要用37度温箱预热，并且PBS润洗细胞层，以减少可能残存的血清的影响；b、加入胰酶后，稍过几秒钟就可以吸走消化液了，不用吸干净，然后放到37度温箱中继续作用1MIN，这时，消化酶可以继续作用的，又可避免胰酶扩散；c、显微镜下观察细胞完全松散开，就可以在你感兴趣的局部加培养基，并吸走你的可隆了呀d、具体消化的时间，你注意摸索一下，如果在步骤2中显微镜下见细胞尚未完全松散开，可以再重复的，直到松散开，能够被吸走为止。我的建议：1、在100mm dish中挑克隆，细胞分的稀一点。2、把细胞全部消化下来，在96孔板中逐步稀释获得单克隆2，问题2。筛选成功的概率：只要有抗性加压筛选，挑选到的机率还是比较大的。一般能挑到稳定表达的概率我认为大概有70－80％，但是想挑到表达量高且能稳定表达的，不大容易。这个可能是在染色体上，合适的整合位点太少的缘故。3，问题3。细胞形态的改变：稳定转染后阳性克隆均出现不同程度的细胞形态的改变。想请教各位有经验的高手，你们做稳定转染时有此发现吗？我的也是，而且好象还有好几种不同类型的细胞。不过，我转的是一种抑癌基因。4，问题4。单克隆化的时机和个数：加药筛选时, 一般等到确认的转染细胞长到70%以上时,再做有限稀释法, 以克隆出阳性细胞, 同时要保持适当的药物浓度,以防突变和污染。若细胞长好了,如有40%以上,就可以有限稀释了一般，筛选5，6个克隆就有需要的克隆，但保险起见，筛10个吧。5，从单克隆化时开始，就要加大营养，清和生长因子。单克隆化的操作方法；1.方法1。单克隆细胞的培养就是这样的,我现在作了15个96孔板的单克隆,总共才得到大约50株单克隆在做时候应保证每个孔中的细胞是一个,因此,我一般在200毫升的培养液中加入小于96个的细胞,这样平均到每个孔中因该可以由满意的结果你所说的现象我也遇到过,我也百思不得其解,只好做多一点的96孔板来补充。培养SPC-A1（人肺癌细胞），转染了EGFP，然后进行了G418抗性筛选和96孔板单克隆筛选，最终获得了成功将我的实验步骤写出来，希望对你有所帮助。2.方法2。实验步骤大致为：预先对96孔板除第一排之外的所有孔加含15%胎牛血清的液，0.1ml/孔，并放于箱中温育，然后胰酶消化稳定表达GFP的细胞，细胞液稀释至密度为1000cell/ml的单细胞悬浮液，上述细胞液接种于96孔板的第一排，0.2ml/孔，从中吸取0.1ml细胞溶液接种于第二排，混合后，从第二排中吸取0.1ml接种于第三排……，一直到第八排，最后一排都丢弃0.1ml细胞液，操作示意图见下图。一般来说，每一列都会有某个孔中只有1~2个细胞。3.方法3。我的改进之处：我在显微镜下观察，标记孔中小于10个细胞的孔，然后在显微镜下用记号笔在皿底把单个荧光细胞圈住，然后在操净台里用灭过菌底牙签将圈外的细胞戳死，这样留在孔中的就是单克隆了，通过这样的，我一共获得了6株单克隆。但需注意的是：时间不能超过30min，否则细胞极容易死亡。解决操作时间长的方法：拿一个96板，在里面随便种一些细胞，然后用牙签练习，我练了5～6次后非常熟练了培养液：最好是含15％的胎牛血清，加大营养，有利于细胞生长；另外一种方法是对还没有变黄的细胞液进行过滤，过滤后的培养含有很多生长因子，可以作为单克隆的培养液。4.方法4。我曾经帮同事做过挑单克隆，直接将倒置显微镜搬到操净台内紫外照射30分钟，然后先在显微镜下把要挑的单克隆初看一遍，算一下大概要挑几个，然后在96孔板内先加好培养基，再将6孔板内的培养基吸出，加入少量的胰酶，大概能盖住板底即可，然后在显微镜下观察细胞状态，在有些变圆时，即用10ul枪在显微镜下直接吸克隆，放入事先准备好的加了培养基的96孔板内，先吸大的克隆，在胰酶完全起到作用使细胞松散扩散开了时，已经吸了将近十个克隆了，动作快一些时能吸十几个克隆，我做过几次了效果很好，没有出现污染。（在要进行操作时，用酒精将手好好擦擦，将显微镜用新洁尔灭也擦一下，一般不会有什么问题），你可以试试，只要小心一些就行了。5.方法5。关于稳转的方法，好像园子里很多xdjm都用的是有限稀释法来作，但是我们实验室基本上都不用九十六孔做有限稀释来作单克隆的，一般的做法都是这样：1。3.5cm皿铺细胞，长到大概80％以上的时候作转染。2。转染后一天消化，传到一个大皿（1：6）或者两个大皿（1：12）。3。再过一天后加入带G418的培养基。4。依据细胞不同，大概从加入G418的第三天到第八天之间细胞开始出现大量死亡，活下来的细胞就形成单克隆。5，单克隆长到相对较大的集落后，于显微镜下用200ul枪挑取细胞集落，一般挑上48个，种在两块24孔板上。6。于24孔板上继续培养，约4、5天后即可消化传代，取部分作收蛋白western之用，根据western结果确定真阳性。我们基本上都是这样pick stable的，除非一些对细胞生长抑止作用强大或者apoptosis的inducer之类的基因比较难挑到stable外，一般还都能挑到stable。当然，转染效率不能太低，超过50％就相对比较容易了，10％以上的可能最后形成的细胞集落就少，而且真阳性也较少。对于那些转染效率很低的细胞，我会连续转染三次（中间如果细胞长满了就传代），好像比较有效。除非是类似带GFP这样能直接观察到是否真阳性的基因，我们才用有限稀释法来作，要不好像也太麻烦了吧？耗时也多单克隆化后细胞特点和处理：1.单克隆后细胞生活习性改变：考虑质粒的表达对细胞的生长有一定的影响，查文献确认一下。2.单克隆后的培养需要多加些血清，再传代时保证板子不影响细胞贴壁，避免出现传代后细胞浮起来后死亡的现象。3.筛选成单克隆后，不加药培养2代，再加药继续筛选两代，此时如果不出现死亡细胞则可以认为是稳定细胞系。复苏后加G418传代2次，然后按部就班。4.过一段时间再筛选时，G418的浓度有人认为需要比稳转时小写，此外，加药后对蛋白质的表达，细胞形态有影响，因此做功能时要停药培养合适时间后再做。5.稳转PA317细胞后再此筛选（需要隔一段时间再加压筛一次），细胞也是死的厉害，不过还是可以筛到，不过需要用合适的浓度。可以在细胞传几代后，分出一小部分，不加G418培养一段时间，然后再加你维持细胞的抗性的G418浓度培养一天看细胞会不会死亡，如果死亡，说明外源基因还没有丢失。6.有人这样做的：转染加药一段时间后，板子上出现了几个克隆，如果有几十个克隆，然后挑其中七八个克隆到24孔板里继续加药筛选，等24孔长满后再转到6孔板继续加药筛选，6孔板里长差不多满后，每孔消化下来大概一半做WB鉴定目的基因表达，剩一半留着继续加药培养，等WB结果出来有阳性的孔就保留下来，阴性的丢掉。单克隆化后鉴定：1.稳定转染细胞，通过PCR鉴定，发现目的基因并不上调，瞬时转染表达是增高的。原因：瞬转是在强启动子下,稳转时你得到的可能失去了此启动子,或者是改变了细胞的生理特性!用WB和瞬转对照鉴定一下!2.转染后质粒整合到基因组是随机的，一般两月后（传代10代以上）还表达你想要蛋白的单克隆可以认为是整合了质粒的。
上海、北京及广州生物技术相关行业最新的职位信息，尽在生物招聘。
成功的秘诀
为你的职业拓宽道路
Eppendorf 荧光定量 PCR仪
ABI Stepone TM 实时定量PCR仪，最新的软件系统，界面友好，操作简单
各种厂家和各种规格的PCR产物纯化试剂盒
最全的定量PCR试剂
从引物设计到实验全程服务如何进行稳转株筛选
本文主要介绍了稳定转染的原理，常用方法以及如何进行稳转株筛选得到高表达的细胞株，同时包括稳定转染的应用及其影响因素，从而满足活性蛋白的大量制备。
利用哺乳动物系统生产蛋白的方式有两种：和稳定转染。稳定转染通过筛选出能够稳定表达的细胞株。针对瞬时转染，外源基因在短时间转录翻译得到的蛋白量少，1mg质粒得到1mg蛋白，能够满足小量蛋白制备，大量生产成本很高。稳定转染的是将外源基因整合到细胞自身的基因组上，随着细胞的生长分裂外源基因可以稳定转染表达，同时经过抗生素加压筛选，最终得到能够稳定转染表达蛋白的细胞株。实验室经常使用的转染细胞有中国仓鼠卵巢细胞（CHO）以及人胚肾细胞（HEK293），而HEK293由于贴壁强度不高，主要用于瞬时转染，因此CHO细胞常常用于细胞的稳定转染。
稳定转染过程
细胞复苏是将保存在液氮或-80℃冰箱中的细胞株解冻并重新培养的过程。细胞复苏的关键是快复，防止在解冻过程中，产生的水珠形成冰晶损伤细胞。细胞复苏一般步骤如下：
预先加热水浴锅，温度至37-40℃，并在离心管中准备好10ml培养基；
从液氮罐或冰箱中取出细胞，迅速放进预热的水浴锅中，镊子夹住冻存管晃动，使其受热均匀；
当冻存管内完全融化时，注意用酒精擦拭冻存管消毒，将液体倒入含有10ml培养基的离心管中；
离心5min，去除上清，得到沉淀；
用培养基悬浮沉淀，并接种到培养瓶常规培养。
细胞复苏后，生长一段时间，95%的细胞贴壁生长，细胞状态良好，说明细胞复苏成功。
瞬时转染以脂质体转染为例的操作流程。
将复苏后常规培养的细胞按照1-3×10^5接种到6孔板中，加入2-4ml的完全培养基，混匀放置在二氧化碳培养箱中37℃过夜；
无菌状态下配置如下溶液：a 用100ul的无血清培养基稀释2ug的待转染的质粒; b 用100ul的无血清培养基稀释25ul的Lipofectamine转染试剂（血清的存在会影响转染效率，因此要使用无血清培养基转染）
将ab溶液混合并摇匀，室温下放置30min左右；
细胞培养至80%单层左右，用无血清培养基洗涤细胞2次，每孔加入1ml的无血清培养基，并将混合后的ab溶液逐滴加入到每孔，按十字方向轻摇混匀，二氧化碳培养箱中37℃培养24小时；
将转染液倒出，换为完全培养基继续培养。
稳转株筛选
24-72h加入选择性抗生素进行稳转株筛选，预实验确定抗生素的最佳浓度，确定抗生素对所选细胞的最低作用浓度。
提前一天接种细胞与24孔板中，待第二天长成25%单层为宜，二氧化碳培养箱中37℃过夜培养；
第二天将培养液换成含抗生素的培养基，抗生素浓度按梯度递增（0,50,100,200,400,800，1000ug/ml）；
培养15天左右绝大多数细胞死亡抗生素浓度为准，一般为400-800ug/ml，筛选细胞时刻适当提高浓度；
二氧化碳培养箱中37℃培养72h后按照1:10的比例将转染细胞传代，使用预实验得到的抗生素浓度的培养基培养。后挑选单克隆，有限稀释法挑取单克隆。
有限稀释法：将细胞消化下来做连续的10倍稀释，每稀释一梯度都在9孔板中培养，生长一周左右再次挑取单克隆进行培养，如此反复3次；
Western blot或ELISA检测蛋白的表达情况，挑取多个单克隆进行表达检测，筛选出表达量最高的克隆传代并保存。最终进行稳转株筛选高表达的稳定细胞株，相对于瞬时转染需大量的时间和成本，是满足活性蛋白大量制备的最好方法。
细胞筛选浓度预实验
G418的配置：取G418共1g溶于1mol/L的HEPES溶液1ml中，加蒸馏水至10ml，过滤除菌，4℃保存；
细胞培养：取处于对数生长期的细胞（未转染细胞，一般在铺满培养器皿底部的70%~80%时），用新鲜无抗生素无血清的培养基制成1×104
个/ml 的细胞悬液。按等量接种入多孔培养板中，培养6h左右开始加药；
制备细胞培养基：在100~1000ug/ml范围内确定几个梯度，按梯度浓度用培养基稀释G418制成培养基；
加G418筛选：吸除培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的培养基；
换液：根据细胞活力和培养基的颜色，每三天( 即每隔两天)更换筛选培养基一次。 如细胞生长过快，可以缩短换液时间（每隔一天）。有死细胞勤换液，可以减少对存活细胞的影响；
建立死亡曲线，确定最佳筛选浓度：筛选10～14天后，可见有抗性的克隆出现，停药用完全培养基培养。当有大量细胞死亡时，可以把 G418浓度减半维持筛选。
稳定转染应用
稳定转染应用
稳定转染适用原因
基因敲除以及基因插入突变筛选等修饰基因组的研究
外源基因要整合到细胞内
单克隆稳转株筛选
细胞之间存在个体差异，同一类型细胞，不同个体细胞基因组存在差异，会对实验结果造成干扰
需要在动物体体内注射已经表达外源基因的细胞
外源基因未整合到细胞会导致注射入动物体内后，外源基因片段很快丢失
需要通过稳转株筛选，实现更好的基因干扰效果
一些蛋白稳定性很强，瞬时RNA干扰作用周期短，无法去除已经表达的目的蛋白
在某些细胞中长期研究基因的功能
稳转株筛选很大程度上降低频繁转染或者病毒包装的成本，也很大程度上方便实验研究
获得外源片段的高效表达
通过稳转株筛选，能使那些病毒载体也无法达到高转导效率的细胞高效表达外源片段
得到过表达的目的基因或干扰拷贝数
避免引入人为因素影响实验结果的精确性
稳转株筛选有助于筛选出拷贝数适量的细胞
稳定转染影响因素
外源基因整合的几率
决定了稳转株筛选的简易程度，有利于稳定转染细胞的获得；
插入外源基因片段的拷贝数
一般情况下，低拷贝或者单拷贝可以降低人为因素的干扰；
整合位点转录活跃度
整合位点转录活跃度决定了稳转株筛选细胞后稳转株中外源基因片段的表达质量；
外源基因片段整合到细胞后的稳定性
不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性，有些区域易发生重组或者丢失，从而使稳转株筛选后出现丢失的现象；}