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包装材料中甲醛的测定.doc7页
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《食品卫生与安全》课程实习研讨笔记
班级：食品质量与安全102班
姓名：束传炳
学号：座机电话号码18
指导老师：桑宏庆、王丽包装材料中甲醛的测定
一、甲醛的来源
1．来自建筑材料、装饰物，主要是服醛树脂制成的脉一甲醛泡沫树脂隔热材料 urea一ofmraldehydeofmainsulation，UFFI ，可制成预制板作建筑物的围护结构，也可作填充材料起隔热保暖作用，国外的可移动房动就是大量使用UFF’I作为建筑材料。现在室内装饰常用的地板革、塑贴面、乳胶漆、合成纤维、粘合剂等释放出甲醛。检测表明家庭居室空气中甲醛浓度可达0.05%-2%/m3。
2.来自烟叶和燃料的不完全燃烧。香烟主流烟雾中甲醛平均浓度为212mg/m3，侧流烟雾为18-58mg/m3，每天吸一包烟主流烟雾甲醛累计暴露为0.158一2.382mg，平均lmg。在30m3的室内吸两支烟，可使室内空气中甲醛高达0.lmg/m3以上，每吸一口烟的容积约4omL，甲醛浓度可达81ug/40mL 即2.025mg/m3， 。
3．来自工业用甲醛。主要用做生产树脂的原料，如腮醛树脂、三聚氰胺甲醛树脂、酚醛树脂等，这些树脂主要用作粘合剂。各种人造板中使用了大量的粘合剂，故富含甲醛。新式家具的制作、墙面、地面的装饰辅设，化纤地毯、油漆涂料等都要使用粘合剂，因而，释放出甲醛是不可避免的。
4.来自化妆品、清洁剂、杀虫剂、印刷油墨、纺织纤维以及医院和科学实验室内使用的消毒剂和防腐剂。其中有些可能含有甲醛，尤以病理及解剖实验室常直接用福尔马林作防腐剂时甲醛对空气的污染尤甚。
5．来自室外工业废气、汽车尾气、光化学烟雾等等。据调查城市空气中甲醛年平均浓度在0.005-0.01mg/m3，一般不超过0.03mg/m3。美国、荷兰、.丹麦等国研究发现，使用UFFI的室内甲醛为3.35mg/m3，，最
正在加载中，请稍后...10.5mg/ml的甲醛标准物质如何配制_百度知道　　新报讯(记者 杨郁卉)　这两天早晚比较凉爽，但市民享受晚上清凉天气的同时却备受蚊虫叮咬的困扰。
　　夏季人们最常用的驱蚊用品要算花露水了，适当在身上涂一些可以祛痱止痒、提神醒脑、防止蚊虫叮咬。但是涂抹花露水也应注意用量，不少人为了驱蚊常常在皮肤上洒很多花露水，结果反而出现身体发痒、冒冷汗等反应。尤其那些皮肤敏感的人，花露水中的薄荷、樟脑等成分非但不能改善局部的炎症，反而会产生过敏反应，导致接触性皮炎。对于皮肤细嫩的孩子来说，成人花露水中刺激性成分浓度较高，也很容易出现过敏等不良反应，因此建议选用儿童专用花露水，或先用水稀释一下再用。
日期：日 - 来自[]栏目
<font color="#07年04月11日 中华麻醉学杂志 2006 Vol.26 No.7 P.612-614
（济南）为了评价不同程度急性高容量血液稀释(AHHD)对家兔小肠及全身氧代谢的影响。研究者取5月龄健康家兔12只，体重2.4～2.9kg。全身麻醉后，静脉输注4%琥珀酰明胶70ml-1&#8226;kg-1&#8226;h-1行AHHD，使Hct分别达到25%(H1)、20%(H2)、15%(H3)、10%(H4)4种程度，每种程度维持30min。抽取股动脉、颈内静脉、肠系膜上动脉及肠系膜上静脉血标本，测定血液稀释前(H0)及4种程度下进行血气分析，测定血乳酸(Lac)浓度，计算动脉血氧含量(CaO2)、静脉血氧含量(CvO2)、氧摄取率(ERO2)、静脉-动脉乳酸含量差(v-aLac)。结果 与H0比较，全身及小肠vLac、v-aLac在H4时升高，ERO2在H3、H4时升高(P＜0.01)；与H2比较，H4时ERO2、aLac、vLac、v-aLac升高(P＜0.01)；全身及小肠CaO2、CvO2随血液稀释程度的加深而降低(P＜0.01)。全身及小肠血气分析结果与Lac变化趋势基本一致。可见 Hct在15%～25%是保证家兔小肠和全身氧供的安全的血液稀释范围。
日期：日 - 来自[]栏目
<font color="#07年04月11日 中华麻醉学杂志 2006 Vol.26 No.7 P.615-617
（郑州）为了探讨在全麻复合硬膜外麻醉下，6%羟乙基淀粉液(130/0.4，万汶)术前急性高容量血液稀释(AHH)对肝癌切除术患者失血耐受性的影响。研究者将ASAⅠ或Ⅱ级肝癌患者30例，随机分为试验组(V组)和对照组(C组)，在硬膜外麻醉后，V组麻醉诱导前快速输注万汶15ml&#8226;kg-1，C组输注乳酸钠林格液，方法同V组。监测平均动脉压(MAP)、心率(HR)和中心静脉压(CVP)，并记录中输血量、输液量及出血量；分别于稀释前、稀释后即刻、术毕和术后1 d测定红细胞压积(Hct)和血红蛋白(Hb)的变化。结果 两组患者出血量和输液量相比差异无统计学意义(P＞0.05)，但V组输血量及输血率明显低于C组(P＜0.05)；V组MAP与HR维持较C组平稳；两组CVP在稀释后均明显升高，V组Hct和Hb在术毕和术后1 d明显低于基础值及C组，但均在正常范围。可见 肝癌切除术患者在硬膜外麻醉复合全身麻醉下，术前采用万汶15 ml&#8226;kg-1行AHH，通过有效地维持血液动力学稳定，提高了患者对术中失血的耐受性。
日期：日 - 来自[]栏目
<font color="#07年02月02日 中华麻醉学杂志 2006 Vol.26 No.5 P.428-431
（乌鲁木齐）为了探讨急性等容血液稀释(ANH)状态下靶控输注(TCI)异丙酚药代动力学的变化。研究者择期行髋关节置换术病人35例，ASAⅠ或Ⅱ级，预计出血量在1 000 ml，随机分为稀释组(n=17，ANH平稳后10min行TCI)和对照组(n=18，未实施ANH直接行TCI)。麻醉诱导后10 min实施ANH，目标红细胞压积(Hct)为0.26，平稳10 min后以血浆靶浓度(3 μg&#8226;ml-1)输注异丙酚60 min，间断采血180 min，用气相色谱-质谱法测定异丙酚血药浓度。运用NONMEM软件估算异丙酚TCI药代动力学参数。结果两组一般情况和异丙酚输注总量差异无统计学意义(P＞0.05)；与对照组比较，稀释组TCI期间异丙酚血药浓度降低，各房室间分布速率常数(K21)减慢，中央室分布容积、周边室分布容积增加(P＜0.05)，异丙酚药代动力学特征符合二室开放型模型。可见ANH使TCI异丙酚的中央室和周边室分布容积增加，周边室向中央室的转运速率减慢。
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&&& 【关键词】血型；血清；二巯基乙醇
&&& 血清中IgG抗A（B）效价的测定，是预测ABO血型不合发生新生儿溶血病（HDN）可能性的重要试验项目。文献报道［１，２］及权威实验室的实验方法有明显不同，但都以效价大于或等于 64 作为判断血型不合婴儿受害的参考值［１，３，４］。我们对在不同条件下所用方法进行了比较分析，报告如下。
&&& 1资料与方法
&&& 1.1标本来源对我市数家医院送检的孕妇血液标本，我们以某血液中心血型参比室的操作方法进行抗A或抗B的效价测定，随机抽取 60 例血清标本作为实验对象。
&&& 1.2试剂二巯基乙醇；多特异性抗人球蛋白试剂（批号：）购于上海市血液中心；A型或B型红细胞悬液由本院中心实验室配制。
&&& 1.3方法
&&& 1.3.1血型参比室操作方法：血清中加入等量二巯基乙醇放37℃水浴作用 10 min。取0.05 ml处理血清加入 10 支各含 0.05 ml生理盐水的第一管中然后倍比稀释，加入 2%A型或B型红细胞悬液0.05 ml于每一管中，37℃孵育 30 min，用生理盐水洗涤3 次后，每管加入一滴抗人球蛋白试剂，离心，观察结果，以凝集强度“+”稀释度的倒数为IgG抗A（B）效价。
&&& 1.3.2其它操作方法按文献［1，2］步骤进行。每管中加入红细胞悬液里均为0.05 ml。
&&& 5结果
&&& 2.1二巯基乙醇处理血清时间的不同对测定的影响见表 1（Ridit 分析法）。
&&& 表 1不同处理时间对结果的影响（略）注：χ2=3.164，P＞0.05
&&& 2.2血清处理时间为10 min，稀释血清与红细胞反应时间的长短对检测结果的影响见表 2。
&&& 表 2不同反应时间对结果的影响效价[略]注：χ2=5.612，P＞0.05。
&&& 2.3倍比稀释量的多少对检测结果的影响（反应时间为30 min）见表 3。
&&& 表 3稀释量的多少对结果的影响效价[略]注：χ2=86.182，P＜0.01。
&&& 3讨论
&&& 血清中IgG抗A（B）效价测定是一种间接抗人球蛋白实验，目的是通过检测血清中抗体结合在红细胞上的数量来推测血清中抗体含量的高低，是目前预测ABO新生儿溶血病发生可能性不可缺少的项目，方法虽然简单，但文献［１，２］介绍少，造成了实验室之间方法的差异，结果可比性降低。从结果来看，二巯基乙醇对血清处理时间、血清与红细胞的作用时间来对比看，选择血清处理时间为 10 min，血清与红细胞反应 30 min是可以的，这符合试验简便快速的要求。我们观察到，稀释量的多少对结果的影响较大。随着稀释量的增加效价也升高，且有显著性差异。其原因为，抗体与红细胞抗原的结合不符合一般的抗原体结合方式：一般［Ag］+［Ab］=［AgAb］，只要抗体浓度不变，抗原抗体复合物浓度不变，与稀释量无关。但IgG抗A（B）抗体与A型（B）红细胞结合时，由于受红细胞体积、表面位阻、结合水膜的影响，一个红细胞需要结合多个抗体才能在抗人球蛋白实验中显示出来。据文献报道［５］，每个细胞至少要包被200~500 个IgG分子才能检测出来。被稀释血清量的多少决定了抗体量的多少，直接影响到结合 200 ~ 500 个IgG分子红细胞产生的多少，所以造成结果的差异。但不是随稀释量的无限增加而效价也在增加，我们对照 0.2 ml与0.4 ml稀释量，结果无差异。我们增加红细胞悬液量至 0.1 ~ 0.2 ml，结果也无差异，其机制有待于进一步研究。有些实验室习惯用滴管进行血清的倍比稀释，我们认为该方法会导致结果不准确。一是滴管的角度、口径对稀释量造成误差，二是稀释血清的粘稠度不同于生理盐水。刚稀释时滴大而后逐渐变小，稀释度不准，造成结果偏高。从上述结果看稀释量对结果有较大影响，滴管无法保证稀释量的多少。应该用比较准的加样器进行稀释，以保证结果的正确性。IgG抗A（B）效价是指凝集强度为“+”时稀释度的倒数，因而出现效价为1∶64［3，4］是不妥当的。作为一项常规检测项目，操作规程应力求统一，制定出参考值，以便使检测结果具有可比性，维持检测结果的真实性和严谨性。
&&& 参考文献
&&& 1.肖星甫.输血技术手册［Ｍ］.成都：四川科技出版社， ~ 506
&&& 2.叶应妩，王毓三.全国临床检验操作规程［Ｍ］.第 2 版.南京：东南大学出版社， ~ 102
&&& 3.罗丽兰.生殖免疫学［M］.武汉：湖北科学技术出版社，
&&& 4.王梦玖.临床生殖免疫学［Ｍ］.上海：上海科学技术出版社，
&&& 5.李勇，杨贵贞.人类红细胞血型学实用理论与实验技术［Ｍ］.北京：中国科学技术出版社，
&&& 滨州市人民医院滨州市256610
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&&& 我院地处海拔3800m的后藏边防地区，医疗用血极其短缺，使用上也存在极大的安全隐患。2005年起，我科开展了急性超容血液稀释（ASHD），运用在手术过程中，缓解了用血困难。
　1& 临床资料
&&& 1.1& 一般资料& 选择5例ASAⅡ～Ⅲ级，男性，年龄18～42岁，其中藏族2例，汉族3例，其中4例为腰椎爆裂骨折伴胫腓骨开放骨折，1例为骨盆骨折。
&&& 1.2& 方法& 全麻后除常规监测心率（HR）、血压（BP）、血氧饱和度（SpO2）外，同时颈内静脉置入双腔管，测中心静脉压（CVP）、基础血细胞比容（Hct）、基础血红蛋白（Hb）。后采集自体血（约为全身血容量的30％即21ml／kg），同时输入血浆代用品（约为全身血容量的60％，即42ml／kg）扩容，使Hct降至25％～30％，当术中Hct低于25％时回输自体血使Hct维持在25%～30％，必要时输异体血。
&&& 1.3& 临床效果& 通过5例的临床应用已取得一定的临床经验，观察显示扩容期间及术中循环动力学稳定，血气、电解质无明显改变，术中尿量、术后肾功能无明显差异，扩容前后凝血功能无明显改变；术中出血量在ml，均未输异体血；术后引流量无明显增加。因此ANHD可明显减少术中血液丢失，对于一般情况较好（术前肝肾功能正常，血液生化指标、PT、APTT均在正常范围），估计术中出血在1000ml以上的病人有较好临床应用前景。
&&& 2& 讨论
&&& 急性等容血液稀释（acute normovolemic hemodilution，ANHD）是指在手术前采集一定量的自身血，同时输入等量胶体液或3倍晶体液或不同比例。急性高容血液稀释（acute hypervolemic hemodilution，AHHD）是在手术前输入15～20ml／kg的胶体液，使机体血容量扩大20%～30％，减少血液有形成分的丢失。以上两种方法均是血液稀释最为常用的方法，其有效性已获得大量的肯定。但是在高原由于长期缺氧，使患者红细胞增多，Hｂ升高，血液粘稠［1］，为了进一步增加血液稀释程度，最大限度地减少纯血丢失，综合了AHHD和ANHD的方法，采用急性超容血液稀释（acute supervolemic hemodilution，ASHD）。在术中，血液稀释后红细胞比容（Hcts）≥25％，因此采用此法的病人要求基础红细胞比容（Hct）≥35％，要动态监测Hct、Hb和CVP并结合临床症状，使Hct、Hb维持在25%～30%，CVP维持在8cmH20左右。Hct不低于0.20，组织就不会发生缺氧［2］，心率也无明显增加，因此临床上将最低Hct限定在0.25是安全的。但大容量血液稀释可能导致纤维蛋白原、凝血因子等血浆浓度降低，影响正常的凝血功能。术中可根据具体情况适当应用抗凝剂、Ca2+等。现有文献表明对于术中大出血患者，等容或高容量血液稀释并不能明显减少输血量。这5例手术病人失血都在1000ml以上，最多接近2100ｍｌ，无1例输异体血。笔者采用急性超容血液稀释（ASHD）对失血在1000ml以上的高原病人和战时血液保障有一定意义。　
　【参考文献】
&&& 1& 曹祯吾.高原红细胞增多症.北京：军事医学科学出版社，1996，6：& 17-25.
&&& 2& 景华.实用外科重症监护与治疗.上海：第二军医大学出版社，9-385.
&&& 作者单位： 857000 西藏日喀则，解放军第8医院麻醉科
　（编辑：齐& 永）
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&&& 【摘要】& 目的& 评价菲克雪浓－平衡液为稀释剂的急性等容血液稀释（ANH）对家兔血清IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α等细胞因子的影响，为临床应用提供理论依据。方法& 选择20只成年健康家兔，随机分为两组，每组10只：C组为对照组、F组为菲克雪浓组；实验家兔用咪唑安定、氯胺酮麻醉后行气管切开高频喷射通气，游离股动脉、股静脉；C组不进行血液稀释，只维持正常的生理需要量；F组家兔股动脉放血的同时经股静脉输入2倍放血量的稀释液：6％菲克雪浓＋复方乳酸钠溶液，晶/胶比为2：1，放血量V=EBV×(Ho-Hf)/Hav，所放血液置于含ACD保养液血袋中保存，于放血后60～120min回输。分别在放血前（T0）、放血后30min（T1）、放血后60min（T2）、放血后120min（T3）、放血后24h（T4）五个时点取静脉血检测Hb、Hct和血清IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α的浓度。结果& F组在ANH后从T1时点开始血清IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α均有增加，各时点与C组间比较有统计学意义；与ANH前自身对照有统计学意义；C组在各时间点的血清IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α变化不大，没有统计学意义。结论& 菲克雪浓－平衡液为稀释剂的急性等容血液稀释（ANH）对家兔血清IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α等免疫性细胞因子有上调作用；可引起机体强度不大、作用时间较短的良性应激反应，对机体免疫功能有增强作用。
　　【关键词】& 菲克雪浓－平衡液；血液稀释；应激
&&& 急性等容血液稀释（acute normovolemic hemodilution，ANH）是围手术期血液保护的重要措施，在临床上主要用于大手术和估计术中会有大失血可能的病人，而这些病人本身的免疫功能在术前已低于正常。ANH对免疫功能的影响与病人术后的恢复和转归密切相关。本实验采用国产血浆代用品菲克雪浓与平衡液为稀释剂进行急性等容血液稀释，探讨其对家兔ANH前后IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α等免疫细胞因子的影响及其机制，为临床安全应用提供理论依据。
　　1& 资料与方法
　　1.1& 一般资料&
　　20只成年健康家兔，雌雄不拘，体重2.5～3.5kg，按随机数字表法分为两组，每组10只：C组为对照组、F组为菲克雪浓组。实验家兔用咪唑安定0.6mg/kg、氯胺酮12mg/kg肌肉注射麻醉后，行气管切开用KR-II型喷射呼吸机高频喷射通气。用DASH 3000多功能监护仪监测平均动脉压(MAP)、中心静脉压（CVP）、心率（HR）、脉搏氧饱和度(SpO2)。每60min肌肉注射1/2初量的氯胺酮维持麻醉。游离股动脉、股静脉，动脉用于测压、放血，静脉用于输液、标本采集。F组股动脉放血的同时经股静脉输入2倍放血量的稀释液：菲克雪浓＋复方乳酸钠溶液，晶/胶比为2：1。放血量V=EBV×(Ho-Hf)/Hav（EBV为全血容量，按体重的7％计算，Ho为ANH前Hct，Hf为ANH后预期达到的Hct，本实验设定Hf为25％，Hav为Ho与Hf的均值），放血至Hf，所放血液置于含ACD保养液血袋中常温保存，于放血后60～120min回输。C组不进行血液稀释，麻醉及动静脉置管等手术操作与F组动物相同，静脉通道只维持正常的生理需要量，所输液体为复方乳酸钠溶液。
　　1.2& 研究方法&
　　分别在放血前（T0）、放血后30min（T1）、放血后60min（T2）、放血后120min（T3）、放血后24h（T4）抽取静脉血4ml（C组取血时间为相应时间点），2ml检测Hb、Hct，2ml低温高速离心（4℃，3000r/min，4min）后取上清液作为样品，测定兔血清白介素-1（Interleukin-1，IL-1）、白介素-2（Interleukin-2，IL-2）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）和肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）。
　　1.3& IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α的检测方法&
　　采用双抗夹心ELISA法。原理：抗兔IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α单抗包被于酶标板上，兔标本中的IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α会与单抗结合。加入生物素化的抗兔IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α（二抗），它将与结合在单抗上的兔IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α结合形成免疫复合物，未被结合的将被洗去。辣根过氧化物酶标记的链霉抗生物素蛋白(Streptavidin）将与二抗的生物素（Biotin）结合，多余的物质会被洗掉。加入TMB显色。兔的IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α的浓度与OD值（450nm）成正比。
　　1.4& 统计学处理&
　　计量资料用均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS11.0软件进行统计学处理，组间比较采用配对t检验，组内比较采用单因素方差分析，P＜0.05有统计学意义。
　　2& 结果
　　2.1& 血流动力学基本参数变化
　　两组家兔的体重、雌雄比无明显差异，麻醉及手术操作相同。在使用KR-II型喷射呼吸机行高频喷射通气的情况下，每组动物各时点的SpO2均维持99%～100％。F组在ANH后出现HR上升，T1时点与ANH前自身对照有统计学意义P＜0.05； MAP 无明显变化、CVP稍有增高，组内比较均无统计学意义P＞0.05。所有变化均在正常范围内。见表1。表1& 不同时点的血流动力学变化& (略)注：F组ANH前后组内比较：△P＜0.05；与C组组间比较：★P＜0.05
　　2.2& Hb、Hct的变化&
　　F组ANH后Hb、Hct降低，T1、T2、T3和T4时点与ANH前自身对照有统计学意义P＜0.05；与C组间比较有统计学意义P＜0.05；C组Hb、Hct在各时间点的变化没有统计学意义P＞0.05。见表2。表2& 不同时点Hb、Hct的变化& (略)注：F组ANH前后组内比较：△P＜0.05；与C组组间比较：★P＜0.05
　　2.3& IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α的变化
　　F组在ANH后从T1时点开始血清IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α均有增加，T1、T2、T3和T4时点与C组间比较有统计学意义P＜0.05或P＜0.01；与ANH前自身对照有统计学意义P＜0.05或P＜0.01；C组在各时间点的血清IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α变化不大，没有统计学意义P＞0.05。见表3。表3& 不同时点血清IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α的变化& (略)注：F组ANH前后组内比较：△P＜0.05，▲P＜0.01；与C组间比较：★P＜0.05，■P＜0.01
　　3& 讨论　　　　本实验中菲克雪浓组（F组）动物Hf控制在25％左右，各时点Hb、Hct均在正常范围内，为中等程度急性等容血液稀释。血流动力学相关指标显示急性等容血液稀释对血流动力学影响较小，这与马晓莲等［1］的研究一致。HR在T1时点升高但仍在正常范围，其升高可能与麻醉较浅、迷走神经兴奋性抑制［2］和氯胺酮的使用有关。　　　　有研究证明［3，4］，麻醉、创伤和手术对免疫应答有抑制作用。手术创伤是围手术期免疫抑制的重要因素，手术越大，免疫抑制越明显，且属短期免疫［3］。本实验的手术创伤为气管切开和动静脉置管，属创伤较小、刺激时间较短的操作，因而对免疫的抑制也相对较弱，同时，两组的麻醉及创伤操作相同，在本实验中可以不考虑麻醉和手术操作对免疫的影响，本实验的对照组各时点血清IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α的变化不大可说明这点，也可能与样本总数不足够大有关。　　　　细胞因子（cytokine，CK）是在机体受感染、创伤、麻醉等应激时由巨噬细胞、单核细胞、淋巴细胞等免疫细胞和成纤维细胞、血管内皮细胞等产生和释放的具有生物学活性的小分子蛋白质的统称。CK作为机体应激反应的介质参与形成神经－内分泌－免疫网络，在机体防御功能上发挥着重要作用。IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α是参与免疫应答的重要细胞因子，在机体抗感染、抗肿瘤中起重要作用［4］，是反映机体免疫功能的重要指标。本实验观察到F组与对照组相比ANH后各时点血清IL-1、IL-2和IL-6和TNF-α都有上升，这与Avall等［5］的研究结果一致。ANH致IL-1、IL-2和IL-6和TNF-α升高的机制可能为：ANH作为一种刺激，可引起机体的急性应激反应，导致巨噬细胞、单核细胞、淋巴细胞等免疫细胞以及成纤维细胞、血管内皮细胞活化，使IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α等免疫细胞因子生成和释放增加；加之ANH时快速输入大量血浆代用品，血浆渗透压升高，组织间液进入血循环，滞留在脾脏、胸腺、骨髓及淋巴结等组织的T淋巴细胞进入血循环，导致与T淋巴细胞相关的细胞因子的释放增加；另外，带有细胞因子的自体血回输也可刺激相关细胞因子的生成增加，这与本实验F组自体血回输后（T3）血清IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α浓度进一步升高相一致。从这几种免疫性细胞因子的变化趋势来看，在ANH后24h(T4)已下降接近ANH前水平，提示ANH可引起机体强度不大、作用时间较短的良性应激反应，不会引起过度的免疫应答，对机体免疫功能有增强作用。从免疫学的观点来看，虽然这些细胞因子升高的程度尚不足以引起明显的非溶血性发热反应，但它们对机体免疫功能的作用是不可轻视的，尤其是对于术前一般情况较差的病人特别是恶性肿瘤病人来说，ANH后机体免疫功能的增强对抵消手术及麻醉的免疫抑制和术后抗感染、伤口愈合以及杀伤术中脱落到循环中的肿瘤细胞，防止肿瘤复发非常有利。总之，采用贺斯菲克雪浓－平衡液为稀释剂进行急性等容血液稀释可引起机体强度不大、作用时间较短的良性应激反应，对机体的IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α等免疫性细胞因子有上调作用，能增强机体免疫功能，对于围术期病人是一种安全、有益的血液保护措施。
　　【参考文献】
　　1& 马晓莲，柳子明.容血液稀释和自体输血在骨科大手术中的应用.浙江医学，）:486-487.
　　2& 屠伟峰，戴建强.急性等容血液稀释及其病理生理学效应.实用医学杂志，）:222-224.
　　3& 庄心良，曾因明，陈伯銮.现代麻醉学.第三版.北京：人民卫生出版社，1.
　　4& 蔡美英.医学免疫学.北京：科学出版社，，50-52.
　　5& Avall A，Hyllner M，Bengtson JP，et al.Postoperative inflammatory response after autologous and allogeneic blood transfusion.Anesthesiology，.
　　基金项目：2003年成都军区总医院院管课题(编号：03Y05)
　　作者单位： 610083 四川成都，成都军区总医院麻醉科&&&
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各省、自治区、直辖市食品药品监督管理局（药品监督管理局）：
　　原国家药品监督管理局曾于日印发《关于颁布执行〈中国生物制品规程〉2000年版的通知》（国药管注〔号）规定，收载于《中国生物制品规程》2000年版暂行规程的品种，须在三年内（至日）完成相应的质量控制标准、检定方法及临床疗效的评价等工作。截止日，原收载于暂行规程的人凝血酶原复合物、组织胺人免疫球蛋白、注射用抗乙型肝炎转移因子和金葡素注射液等4个品种已完成了相关的改进工作，经中国生物制品标准化委员会相关专业委员会讨论通过，现予颁布（见附件），并就有关规程转正通知如下：
　　一、上述4个品种转正规程自日起正式执行。自执行之日起，原暂行规程予以废止。
　　二、生产上述暂行规程转正品种的药品生产企业应按照转正规程的要求，生产3批样品送中国药品生物制品检定所进行质量复核，并按照《药品注册管理办法（试行）》的相关规定拟定注册标准，以补充申请方式报我局审批。
　　三、请各省、自治区、直辖市食品药品监督管理部门负责通知辖区内相关药品生产企业。
　　四、对暂行规程中尚未获得批准转正的其他品种的处理意见，我局将另行通知。
　　附件：1．人凝血酶原复合物制造及检定规程　　　　　2．组织胺人免疫球蛋白制造及检定规程　　　　　3．注射用抗乙型肝炎转移因子制造及检定规程　　　　　4．金葡素注射液制造及检定规程
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　国家食品药品监督管理局　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　二○○四年四月十九日
　　　　　　　　　　　　人凝血酶原复合物制造及检定规程　　　　　　　　　　　RequirementsforProthrombinComplex
　　本品系由健康人的血浆，经低温乙醇蛋白分离法或经国家药品监督管理部门批准的其他方法提制，并经病毒灭活处理而得的冻干制剂，内含凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ及适宜稳定剂。不含防腐剂和抗生素。
　　1　基本要求　　1.1.1　设施与生产质量管理　　按中国《药品生产质量管理规范》要求实施。厂房设施必须专用，不得与其他异种蛋白制剂混用。
　　1.1.2　原料及辅料　　生产中所用的稀释剂、稳定剂、防腐剂、灭活剂、佐剂，及其他化工原料，其质量应符合现行《中国药典》或《中国生物制品主要原辅材料质控标准》的要求。　　辅料品种与用量应当无害，不影响制品的安全性和有效性，并应对规定的检定方法无干扰。　　化工及食品原料作为原料时，必须制定符合药用要求的标准，并需经国家药品监督管理部门批准。
　　1.1.3　生产用水　　生产用水源水应符合饮用水标准，纯化水、注射用水及灭菌注射用水应符合现行《中国药典》标准。
　　1.1.4　生产用器具　　直接用于生产的金属或玻璃等器具，必须专用，并经过严格清洗及去热原质处理或灭菌处理。
　　2　制造　　2.1　原料血浆　　2.1.1　血浆的来源、采集及质量应符合本版规程通则《原料血浆采集规程》要求。血浆应无凝块，无纤维蛋白析出，非脂血，无溶血。　　2.1.2　去除冷沉淀、凝血因子Ⅷ的血浆及组分Ⅲ沉淀均可用于生产。　　2.1.3　组分Ⅲ沉淀存放于-30℃以下，保存时间不得超过6个月。
　　2.2　原液制备　　2.2.1　可采用直接从血浆中用凝胶吸附法或低温乙醇和聚乙二醇分离蛋白并经凝胶吸附法制备，亦可用经国家药品监督管理部门批准的其他方法制备。生产过程中不能加任何防腐剂或抗生素。　　2.2.2　蛋白质透析和浓缩，应采用超滤法。澄清及除菌过滤，应使用无石棉的介质。　　2.2.3　原液检定　　按3.1项进行。
　　2.3　半成品制备　　2.3.1　配制　　按出品规格配制，制品内可加适宜的稳定剂。若加肝素，则每１.0IU因子Ⅸ肝素加量不超过0.5IU。　　2.3.2　半成品检定　　按3.2项进行。
　　2.4　成品制备　　2.4.1　分批　　应符合本版规程通则《生物制品分批规程》的有关规定。　　2.4.2　分装及冻干　　按本版规程通则《生物制品分装规程》进行。除菌过滤分装的制品应立即冻结。冻干过程制品温度不得超过35℃，真空封口。　　2.4.3　规格　　每瓶人凝血因子Ⅸ的效价可分为100、200、300、400、1000IU5种，同时制品还含有人凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅹ。　　2.4.4　包装　　应符合本版规程通则《生物制品包装规程》的有关规定。
　　2.5　病毒去除和灭活　　生产过程中应有特定的去除和灭活脂包膜和非脂包膜病毒处理。如果应用灭活剂（如有机溶剂、去污剂）灭活病毒，则应规定人用安全的灭活剂残留量最高限值。
　　3　检定　　3.1　原液检定　　3.1.1　pH值　　按3.3.3.2项进行。　　3.1.2　活性测定　　3.1.2.1　人凝血因子Ⅸ活性及比活性　　每1ml人凝血因子Ⅸ效价应不低于10IU（附录1），比活性应不低于0.3IU/mg蛋白。
　　3.2　半成品检定　　3.2.1　热原质试验　　按本版规程通则《生物制品热原质试验规程》进行。注射剂量按家兔体重每1kg注射30IU人凝血因子Ⅸ，应符合规定。　　3.2.2　无菌试验　　按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行，符合规定。
　　3.3　成品检定　　每批制品应抽样作全面质量检定，不同机柜冻干的制品分别抽样做无菌试验和水分测定。以下检定项目除真空度、溶解时间、水分外，其余项目按制品标示量加入灭菌注射用水溶解后进行检定。　　3.3.1　鉴别试验　　按《中国生物制品规程》2002年增补本《血液制品鉴别试验》A法进行。仅与抗人的血清产生沉淀线，与抗马、抗牛、抗猪、抗羊血清不产生沉淀线。　　3.3.2　物理检查　　3.3.2.1　外观　　应为白色或灰绿色疏松体，复溶后应为无色、淡黄色、淡蓝色或黄绿色澄明溶液，不应有异物或沉淀。　　3.3.2.2　真空度　　以高频火花真空测定器检测，瓶内应出现蓝紫色辉光。　　3.3.2.3　溶解时间　　向已平衡至20～25℃的制品，加入标示量的20～25℃灭菌注射用水，轻轻摇动，应于15分钟内完全溶解。　　3.3.3　化学检定　　按本版规程附录《生物制品化学及其他检定方法》进行。　　3.3.3.1　水分　　应不高于3.0%。　　3.3.3.2　pH值　　在20℃±2℃测定，pH值为6.5～7.5。　　3.3.3.3　PEG含量　　应不高于0.5g/L。　　3.3.3.4　钠离子含量　　应不高于160mmol/L。　　3.3.3.5　枸橼酸离子含量　　应不高于25mmol/L。　　3.3.4　效价测定　　3.3.4.1　人凝血因子Ⅸ　　3.3.4.1.1　效价　　按附录1法测定，凝血因子Ⅸ活性应不低于10IU。按3.3.2.3项加入的溶剂量，计算每瓶人凝血因子Ⅸ效价，应为标示量的80%～140%。　　3.3.4.1.2　比活性　　应不低于0.3IU/mg蛋白质。　　3.3.4.2　人凝血因子Ⅱ效价　　按3.3.2.3项加入的溶剂量及每1ml人凝血因子Ⅱ活性（附录2），计算每瓶人凝血因子Ⅱ效价，应不低于标示量的80%。　　3.3.4.3　人凝血因子Ⅶ效价　　按3.3.2.3项加入的溶剂量及每1ml人凝血因子Ⅶ活性（附录3），计算每瓶人凝血因子Ⅶ效价，应不低于标示量的80%。　　3.3.4.4　人凝血因子Ⅹ效价　　按3.3.2.3项加入的溶剂量及每1ml人凝血因子Ⅹ活性（附录4），计算每瓶人凝血因子Ⅹ效价，应不低于标示量的80%。　　3.3.5　人凝血酶活性　　按附录5方法测定。不得有凝块或纤维蛋白析出。　　3.3.6　肝素含量　　按附录6法测定，每1IU人凝血因子Ⅸ肝素含量应不高于0.5IU。　　3.3.7　活化的凝血因子　　按附录7方法测定，凝固时间应不低于150秒。　　3.3.8无菌检查　　按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行，符合规定。　　3.3.9　异常毒性检查　　按本版规程通则《生物制品异常毒性试验规程》进行。豚鼠每只注射供试品5ml（每1ml含10IU人凝血因子Ⅸ），小鼠每只注射供试品0.5ml（每1ml含10IU人凝血因子Ⅸ），应符合规定。　　3.3.10　热原质检查　　按本版规程通则《生物制品热原质试验规程》进行。注射剂量按家兔体重每1kg注射30IU人凝血因子Ⅸ，应符合规定。　　3.3.11　HBsAg　　按试剂盒说明书测定，应为阴性。　　3.3.12　根据病毒灭活方法，应增加相应的检定项目。若采用磷酸三丁酯和吐温-80法灭活病毒，则应检测磷酸三丁酯和吐温-80残留量。　　3.3.12.1　磷酸三丁酯残留量　　应不高于10μg/ml。　　3.3.12.2　吐温-80残留量　　应不高于100μg/ml。
　　4　保存、运输及有效期　　应在2～8℃避光保存和运输。有效期自分装之日起，按国家药品监督管理部门批准的执行。
　　5　使用说明　　根据国家药品监督管理部门批准的内容及本版规程通则《生物制品包装规程》编写。
　　6　附录　　附录1　人凝血因子Ⅸ效价测定法（一期法）　　附录2　人凝血因子Ⅱ效价测定法（一期法）　　附录3　人凝血因子Ⅶ活性测定法（一期法）　　附录4　人凝血因子X效价测定法（一期法）　　附录5　人凝血酶活性测定法　　附录6　肝素含量测定法（凝固法）　　附录7　活化的凝血因子活性测定法
　　　　　　　　　　附录1　人凝血因子Ⅸ效价测定法（一期法）
　　本法用人凝血因子Ⅸ缺乏血浆作为基质血浆，采用一期法测定供试品人凝血因子Ⅸ效价。
　　1　试剂　　1.1　3.8%柠檬酸三钠溶液　　称取无水柠檬酸三钠9.5g，加水溶解并稀释至250ml。　　1.2　咪唑缓冲液　　称咪唑0.68g和氯化钠1.17g溶于100ml水中，加入0.1mol/L盐酸42.2ml，然后补加水至200ml，pH为7.3。　　1.3　稀释液　　取1容积的3.8%柠檬酸三钠加入5容积咪唑缓冲液混合，加人血白蛋白至终浓度为1%。　　1.4　激活的部分凝血活酶（APTT）试剂　　1.5　人凝血因子Ⅸ缺乏血浆　　为人凝血因子Ⅸ含量低于1%的乙型血友病病人血浆或人工基质血浆。　　1.6　0.05mol/L氯化钙溶液　　称氯化钙（CaCl2.2H2O）147g，加水溶解并稀释至1000ml，配制成1mol/L氯化钙贮存液，用前用水稀释20倍，配成0.05mol/L氯化钙溶液。
　　2　人凝血因子Ⅸ标准溶液的配制　　用人凝血因子Ⅷ缺乏血浆将人凝血因子Ⅸ标准品稀释成1IU/ml，再用稀释液分别进行10倍、20倍、40倍和80倍稀释，置冰浴待用。
　　3　供试品溶液的配制　　若供试品中含有肝素，先用硫酸鱼精蛋白中和供试品中的肝素。测定时先用人凝血因子Ⅸ缺乏血浆稀释成约1IU/ml，再用稀释液进行10倍和20倍或40倍稀释，置冰浴待用。
　　4　测定法　　取APTT试剂0.1ml，置37℃保温一定时间（一般4分钟），加人凝血因子Ⅸ缺乏血浆0.1ml、供试品溶液0.1ml，混匀，置37℃保温一定时间（一般5分钟），加已预热至37℃0.05mol/L氯化钙溶液0.1ml，记录凝固时间。　　用不同稀释度的人凝血因子Ⅸ标准溶液0.1ml替代供试品溶液，同法操作。
　　5　结果计算　　将标准溶液中人凝血因子Ⅸ活性（IU/ml）对其相应的凝固时间（秒）进行双对数直线回归处理，求出直线回归方程。将供试品溶液的凝固时间（秒）对数值代入方程，求得的值的反对数，再乘以稀释倍数，即为每1ml供试品溶液中人凝血因子Ⅸ效价（IU/ml），取供试品各稀释度的人凝血因子Ⅸ效价均值即为供试品中人凝血因子Ⅸ效价（IU/ml）。
　　【附注】　　（1）直线回归相关系数应不低于0.98。　　（2）测定时，要求每个稀释度平行测定2管，两管之差不得超过均值10%，否则重测。　　（3）直接与标准品、供试品和血浆接触的器皿应为塑料或硅化制品。　　（4）标准品和供试品稀释后，应置冰浴待用。　　（5）采用全自动凝血仪时，则按仪器使用说明书进行。
　　　　　　　　　　　附录2　人凝血因子Ⅱ效价测定法（一期法）
　　本法用人凝血因子II缺乏血浆作为基质血浆，采用一期法测定供试品中人凝血因子II效价。
　　1　试剂　　1.1　稀释液　　称取巴比妥钠11.75g、氯化钠14.67g溶于1570ml水中，用1mol/L盐酸调pH至7.3，再加水至2000ml。用前加人血白蛋白至终浓度为1%。　　1.2　含钙促凝血酶原激酶（Thromboplastin）　　1.3　人凝血因子II缺乏血浆　　人凝血因子II含量低于1%的病人血浆或人工基质血浆。
　　2　人凝血因子Ⅱ标准溶液的配制　　用人凝血因子Ⅱ缺乏血浆将人凝血因子Ⅱ标准品稀释成1IU/ml，再用稀释液分别进行10倍、20倍、40倍和80倍稀释，置冰浴备用。
　　3　供试品溶液的配制　　用人凝血因子Ⅱ缺乏血浆将供试品稀释成约1IU/ml，再用稀释液进行10倍和20倍或40倍稀释，置冰浴待用。
　　4　测定法　　取供试品溶液0.1ml，加人凝血因子Ⅱ缺乏血浆0.1ml，混匀，置37℃水浴保温一定时间（一般3分钟），然后加入已预热至37℃含钙促凝血酶原激酶溶液0.2ml，记录凝固时间。用不同稀释度的人凝血因子Ⅱ标准溶液0.1ml替代供试品溶液，同法操作。
　　5　结果计算　　将标准溶液人凝血因子Ⅱ活性（IU/ml）对其相应的凝固时间（秒）进行双对数直线回归处理，求出直线回归方程。将供试品溶液的凝固时间（秒）对数值代入方程，求得的值的反对数，即为供试品人凝血因子Ⅱ效价，再乘以稀释倍数，即为每1ml供试品溶液人凝血因子Ⅱ效价（IU/ml），取供试品各稀释度的人凝血因子Ⅱ效价均值即为供试品人凝血因子Ⅱ效价（IU/ml）。
　　【附注】　　（1）直线回归相关系数应不低于0.98。　　（2）测定时要求每个稀释度平行测定2管，两管之差不得超过均值10%，否则重测。　　（3）直接与标准品、供试品和血浆接触的器皿应为塑料或硅化制品。　　（4）标准品和供试品稀释后，应置冰浴待用。　　（5）采用全自动凝血仪时，则按仪器使用说明书进行。
　　　　　　　　　　附录3　人凝血因子Ⅶ效价测定法（一期法）
　　本法用人凝血因子Ⅶ缺乏血浆作为基质血浆，采用一期法测定供试品人凝血因子Ⅶ效价。
　　1　试剂　　1.1　稀释液　　称取巴比妥钠11.75g、氯化钠14.67g溶于1570ml水中，用1mol/L盐酸调pH至7.3，再加水至2000ml。用前加人血白蛋白至终浓度为1%。　　1.2　含钙促凝血酶原激酶（Thromboplastin）　　1.3　人凝血因子Ⅶ缺乏血浆　　人凝血因子Ⅶ含量低于1%的病人血浆或人工基质血浆。　　人凝血因子Ⅶ标准溶液的配制　　用人凝血因子Ⅶ缺乏血浆将人凝血因子Ⅶ标准品稀释成1IU/ml，再用稀释液分别进行10倍、20倍、40倍和80倍稀释，置冰浴备用。
　　2　供试品溶液的配制　　用人凝血因子Ⅶ缺乏血浆将供试品稀释成约1IU/ml，再用稀释液进行10倍和20倍或40倍稀释，置冰浴待用。
　　3　测定法　　取供试品溶液0.1ml，加人凝血因子Ⅶ缺乏血浆0.1ml，混匀，置37℃水浴保温一定时间（一般3分钟），然后加入已预热至37℃含钙促凝血酶原激酶溶液0.2ml，记录凝固时间。用不同稀释度的人凝血因子Ⅶ标准溶液0.1ml替代供试品溶液，同法操作。
　　4　结果计算　　将标准溶液人凝血因子Ⅶ效价（IU/ml）对其相应的凝固时间（秒）进行双对数直线回归处理，求出直线回归方程。将供试品溶液的凝固时间（秒）对数值代入方程，求得的值的反对数，再乘以稀释倍数，即为每1ml供试品溶液人凝血因子Ⅶ效价（IU/ml），取供试品各稀释度的人凝血因子Ⅶ效价均值即为供试品人凝血因子Ⅶ效价（IU/ml）。
　　【附注】　　（1）直线回归相关系数应不低于0.98。　　（2）测定时要求每个稀释度平行测定2管，两管之差不得超过均值10%，否则重测。　　（3）直接与标准品、供试品和血浆接触的器皿应为塑料或硅化制品。　　（4）标准品和供试品稀释后，应置冰浴待用。　　（5）采用全自动凝血仪时，则按仪器使用说明书进行。
　　　　　　　　　　附录4　人凝血因子X效价测定法（一期法）
　　本法用人凝血因子Ⅹ缺乏血浆作为基质血浆，采用一期法测定供试品人凝血因子Ⅹ效价。　　1　试剂　　1.1　稀释液　　称取巴比妥钠11.75g、氯化钠14.67g溶于1570ml水中，用1mol/L盐酸调pH至7.3，再加水至2000ml。用前加人血白蛋白至终浓度为1%。　　1.2　含钙促凝血酶原激酶（Thromboplastin）　　1.3　人凝血因子Ⅹ缺乏血浆　　人凝血因子Ⅹ含量低于1%的病人血浆或人工基质血浆。　　2　人凝血因子Ⅹ标准溶液的配制　　用人凝血因子Ⅹ缺乏血浆将人凝血因子Ⅹ标准品稀释成1IU/ml，再用稀释液分别进行10倍、20倍、40倍和80倍稀释，置冰浴备用。
　　3　供试品溶液的配制　　用人凝血因子Ⅹ缺乏血浆将供试品稀释成约1IU/ml，再用稀释液进行10倍和20倍或40倍稀释，置冰浴待用。
　　4　测定法　　取供试品溶液0.1ml，加人凝血因子Ⅹ缺乏血浆0.1ml，混匀，置37℃水浴保温一定时间（一般3分钟），然后加入已预热至37℃含钙促凝血酶原激酶溶液0.2ml，记录凝固时间。用不同稀释度的人凝血因子Ⅹ标准溶液0.1ml替代供试品溶液，同法操作。
　5　结果计算　　将标准溶液人凝血因子Ⅹ效价（IU/ml）对其相应的凝固时间（秒）进行双对数直线回归处理，求出直线回归方程。将供试品溶液的凝固时间（秒）对数值代入方程，求得的值的反对数，再乘以稀释倍数，即为每1ml供试品溶液人凝血因子Ⅹ效价（IU/ml），取供试品各稀释度的人凝血因子Ⅹ效价均值即为供试品人凝血因子Ⅹ效价（IU/ml）。
　　【附注】　　（1）直线回归相关系数应不低于0.98。　　（2）测定时要求每个稀释度平行测定2管，两管之差不得超过均值10%，否则重测。　　（3）直接与标准品、供试品和血浆接触的器皿应为塑料或硅化制品。　　（4）标准品和供试品稀释后，应置冰浴待用。　　（5）采用全自动凝血仪时，则按仪器使用说明书进行。
　　　　　　　　　　　　　附录5　人凝血酶活性测定法
　　本法依据凝血酶能使人纤维蛋白原凝固原理，将供试品和人纤维蛋白原混合，观察是否产生凝块，根据凝块判定制品是否含有凝血酶活性。
　　1　试剂　　1.1　5g/L纤维蛋白原溶液　　用生理氯化钠溶液将复溶的冻干人纤维蛋白原稀释成5g/L。　　1.2　生理氯化钠溶液　　1.3　硫酸鱼精蛋白　　1.4　人凝血酶　　用生理氯化钠溶液将复溶的冻干人凝血酶稀释成0.5IU/ml。
　　2　测定法　　取供试品0.2ml，加5g/L纤维蛋白原溶液0.2ml，37℃放置24小时，观察有无凝块或纤维蛋白析出。放置期间至少观察2次。本试验同时做阴性及阳性对照。　　阴性对照：用0.2ml生理氯化钠溶液替代供试品，其余操作同供试品。　　阳性对照：用0.2ml0.5IU/ml凝血酶替代供试品，其余操作同供试品。
　　3　结果判定　　阴性对照无任何凝块或纤维蛋白析出，阳性对照有凝块或纤维蛋白析出，则试验成立。肉眼观察供试品有无凝块或纤维蛋白析出。
　　【附注】　　含肝素的供试品应根据肝素含量，用适量的硫酸鱼精蛋白中和供试品内的肝素，再取供试品检查（按10μg硫酸鱼精蛋白中和1IU肝素进行）。
　　　　　　　　　　　附录6　肝素含量测定法（凝固法）
　　本法依据硫酸鱼精蛋白能中和抗凝剂肝素，从而影响血浆凝固时间的原理，测定供试品中肝素含量。
　　1　试剂　　1.1　缺血小板人血浆　　无菌采集人全血于3.8%枸橼酸钠抗凝剂中（9∶1），混匀，4℃、1500r/min离心30分钟，用塑料注射器取上层2/3的血浆，4℃、3500r/min离心30分钟，取上层2/3血浆，分装于塑料管中，每支3ml，保存-40℃备用。　　1.2　pH7.5Tris缓冲液　　称取Tris7.27g、氯化钠5.27g，加水溶解并稀释至1000ml（用HCl调pH至7.5）。　　1.3　脑磷脂混悬液　　冻干脑磷脂加水复溶，用生理氯化钠溶液稀释，稀释后的脑磷脂混悬液应使空白凝固时在200～300秒。　　1.4　0.025mol/L氯化钙溶液　　称取147g氯化钙（CaCl2.2H2O）溶于1000ml水中，配成1mol/L氯化钙贮存液，用时用水稀释40倍，配成0.025mol/L氯化钙溶液。　　1.5　硫酸鱼精蛋白溶液　　称取适量硫酸鱼精蛋白，用pH7.5Tris缓冲液溶解并稀释成1～20mg/ml浓度。　　供试品溶液的配制　　于每支含10μl不同浓度的硫酸鱼精蛋白溶液的塑料管中，各加按标示量复溶后的供试品0.5ml，混匀。
　　2　测定法　　向已含有缺血小板人血浆0.1ml的塑料管中、加脑磷脂混悬液0.1ml，混匀，37℃、1分钟，加供试品溶液0.1ml、已预热至37℃的0.025mol/L氯化钙溶液0.1ml，记录凝固时间。用0.1mlTris缓冲液（pH7.5）代替混合物，同法操作作空白对照。
　　3　结果计算　　空白对照凝固时间不低于200秒试验成立。取凝固时间最短的供试品管，作为硫酸鱼精蛋白中和0.5ml供试品中的肝素量。10μg硫酸鱼精蛋白中和1IU肝素。例如混合物中每1ml含30μg硫酸鱼精蛋白，中和0.5ml供试品中的肝素量则为3IU，即每1ml供试品含6IU肝素。
　　【附注】直接与血和血浆接触的器具应为塑料或硅化的玻璃制品。
　　　　　　　　　　　　附录7　活化的凝血因子活性测定法
　　本法依据活化的凝血因子活性在脑磷脂存在的情况下使缺血小板人血浆发生凝固的原理，将供试品和人缺血小板血浆及脑磷脂混合，测定凝固时间，根据凝固时间判定供试品是否含有活化的凝血因子。
　　1　试剂　　1.1　缺血小板人血浆　　无菌采集人全血于3.8%枸橼酸钠抗凝剂中（9∶1），混匀，4℃、1500r/min离心30分钟，用塑料注射器取上层2/3的血浆，4℃、3500r/min离心30分钟，取上层2/3血浆，分装于塑料管中，每支3ml，保存-40℃备用。　　1.2　pH7.5Tris缓冲液　　称取Tris7.27g、氯化钠5.27g，加水溶解并稀释至1000ml（用HCl调pH至7.5）。　　1.3　脑磷脂混悬液　　冻干脑磷脂加水复溶，用生理氯化钠溶液稀释，稀释后的脑磷脂混悬液应使空白凝固时在200～300秒。　　1.4　0.025mol/L氯化钙溶液　　称取147g氯化钙（CaCl2.2H2O）溶于1000ml水中，配制成1mol/L氯化钙贮存液，用时用水稀释40倍，配制成0.025mol/L氯化钙溶液。　　1.5　硫酸鱼精蛋白溶液　　称取适量硫酸鱼精蛋白，用pH7.5Tris缓冲液溶解并稀释成适宜浓度。
　　2　供试品溶液的配制　　取复溶后的供试品，根据测定的肝素含量加入适量硫酸鱼精蛋白中和供试品中的肝素（10μg硫酸鱼精蛋白中和1IU肝素），再用Tris缓冲液（pH7.5）做稀释10和100倍。
　　3　测定法　　取缺血小板人血浆0.1ml，加脑磷脂混悬液0.1ml，混匀，37℃、1分钟，加供试品溶液（10倍或100倍稀释液）0.1ml、已预热至37℃的0.025mol/L氯化钙溶液0.1ml，记录凝固时间。用0.1mlTris缓冲液（pH7.5）替换供试品溶液，同法操作作空白对照。
　　4　结果判定　　空白对照凝固时间不低于200秒试验成立。1：10和1：100供试品稀释液凝固时间均应不低于150秒。
　　【附注】　　（1）直接与血和血浆接触的器具应为塑料或硅化的玻璃制品。从供试品稀释到测定完毕应在30分钟内完成。　　（2）供试品每个稀释度作2管。〖LM〗
　　　　　　　　　　　　组织胺人免疫球蛋白制造及检定规程　　　　　　　　　　　　 RequirementsforHumanHistaglobulin
　　本品系由人免疫球蛋白、磷酸组织胺（或盐酸组织胺）配制而成的冻干制剂，能刺激机体产生抗组织胺的抗体，从而消除内源性组织胺的致病作用。本品不含抗生素。
　　1　基本要求　　1.1.1　设施与生产质量管理　　按中国《药品生产质量管理规范》要求实施。厂房设施必须专用，不得与其他异种蛋白制剂混用。　　1.1.2　原料及辅料　　生产中所用的稀释剂、稳定剂、防腐剂、灭活剂、佐剂，及其他化工原料，其质量应符合现行《中国药典》或《中国生物制品主要原辅材料质控标准》的要求。　　辅料品种与用量应当无害，不影响制品的安全性和有效性，并应对规定的检定方法无干扰。化工及食品原料作为原料时，必须制定符合药用要求的标准，并需经国家药品监督管理部门批准。　　1.1.3　生产用水　　生产用水源水应符合饮用水标准，纯化水、注射用水及灭菌注射用水应符合现行《中国药典》标准。　　1.1.4　生产用器具　　直接用于生产的金属或玻璃等器具，必须专用，并经过严格清洗及去热原质处理或灭菌处理。
　　2　制造　　2.1　主要原料　　人免疫球蛋白应符合现行版规程中《人免疫球蛋白制造及检定规程》要求。　　2.2　半成品制备　　2.2.1　配制　　按每1ml含磷酸组织胺（或盐酸组织胺）0.075～0.25μg，人免疫球蛋白6mg，硫代硫酸钠（Na2S2O3?5H2O）8～30mg配制而成，冻干制剂可加入葡萄糖5mg。　　2.2.2　配制好的原液应立即进行除菌过滤。除菌过滤前应调pH为6.6～7.4。澄清及除菌过滤，应使用无石棉的介质。　　2.2.3　半成品检定　　按3.1项进行。　　2.3　成品制备　　2.3.1　分批　　应符合本版规程通则《生物制品分批规程》的有关规定。　　2.3.2　分装及冻干　　按本版规程通则《生物制品分装规程》进行.除菌过滤分装的制品应及时冻结。冻干过程制品温度不得超过35℃，真空封口。　　2.3.3　规格　　每支（瓶）人免疫球蛋白装量应不低于12mg。　　2.3.4　包装　　应符合本版规程通则《生物制品包装规程》的有关规定。
　　3　检定　　3.1　半成品检定　　3.1.1　蛋白质含量　　应不低于6g/L。　　3.1.3　pH值　　按3.3.3.2项进行。　　3.1.4　无菌检查　　按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行，应符合规定。　　3.1.5　热原质检查　　按本版规程通则《生物制品热原质试验规程》进行。注射剂量按家兔体重每1kg注射3ml，应符合规定。　　3.3　成品检定　　每批成品应抽样作全面检定。不同机柜冻干制品应分别抽样作无菌检查及水分测定。冻干制剂，以下检定项目除真空度、溶解时间、水分外，其余项目按制品标示量加入灭菌注射用水溶解后进行检定。　　3.3.1　鉴别试验　　按《中国生物制品规程》2002年增补本《血液制品鉴别试验》B法进行，主要沉淀线应为人免疫球蛋白。　　3.3.2　物理检查　　3.3.2.1　外观　　应为白色或淡黄色疏松体，无融化迹象。冻干制剂复溶后应为无色或淡黄色溶液，可带乳光，不应有异物、混浊或摇不散的沉淀。　　3.3.2.2　溶解时间　　冻干制剂加灭菌注射用水2ml，应在10分钟内溶解。　　3.3.3　化学检定　　按本版规程附录《生物制品化学及其他检定方法》进行。　　3.3.3.1　水分　　取供试品0.2～1.0g置于已干燥至恒重的称量瓶中，加盖，精密称定重量（称量瓶中供试品厚度应在5mm以下），放入五氧化二磷干燥器中，打开瓶盖，于60℃将干燥器抽真空至133Pa以下，干燥至恒重。干燥完毕应缓慢通入经浓硫酸脱水的干燥空气。按下式计算供试品水分含量，应不高于5.0%。　　供试品水分含量%（W/W）=干燥失重÷供试品重量×100　　3.3.3.2　pH值　　应为6.0～8.0。　　3.3.3.3　蛋白质总量　　按3.3.2.2项加入的溶剂量，再乘以供试品蛋白质量含量（g/ml），计算每瓶蛋白质总量，应不低于12mg。　　3.3.3.4　游离磷酸组胺含量　　按附录1方法测定，应不大于0.2μg/ml。　　3.3.3.5　磷酸组胺与人免疫球蛋白结合率　　按下式计算磷酸组胺与人免疫球蛋白结合率，应不低于30%。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 W（μg/ml）-F（μg/ml）　　磷酸组胺与人免疫球蛋白结合率（%）= ─────────────×100　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　W（μg/ml）　　　式中：W为加入的磷酸组胺量；F为游离磷酸组胺含量　　3.3.3.6　糖含量　　若制品中加糖（葡萄糖、麦芽糖等），其含量应不高于50g/L。　　3.3.3.7　硫柳汞含量　　若制品中加硫柳汞，其含量应不高于0.1g/L。　　3.3.4　无菌检查　　按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行，符合规定。　　3.3.5　异常毒性检查　　按本版规程通则《生物制品异常毒性试验规程》进行，符合规定。　　3.3.6　热原质检查　　按本版规程通则《生物制品热原质试验规程》进行。注射剂量按家兔体重每1kg注射3ml，应符合规定。
　　4　保存、运输及有效期　　在2～8℃避光保存和运输。有效期自分装之日起，按国家药品监督管理部门批准的执行。
　　5　使用说明　　根据国家药品监督管理部门批准的内容及本版规程通则《生物制品包装规程》编写。
　　6　附录　　组织胺人免疫球蛋白磷酸组胺测定方法
　　　　　　　　　附录　　组织胺人免疫球蛋白磷酸组胺测定方法
　　该法通过磷酸组织胺与邻苯二甲醛在碱性条件下生成荧光衍生物，测定组织胺人免疫球蛋白制品中游离磷酸组胺含量。
　　1　试剂　　1.1　100ng/ml磷酸组织胺标准工作液　　精密称取磷酸组织胺标准品2.76mg，加0.1mol/L盐酸溶解并稀释至10.0ml，摇匀，配置成100μg/ml贮备液，-20℃贮存备用。试验当天取贮备液0.1ml，用0.1mol/L盐酸定溶至100ml，即为100ng/ml磷酸组织胺标准工作液。　　1.2　25%三氯乙酸溶液　　称取三氯乙酸25g，加水溶解并稀释至100ml。　　1.3　0.1%邻苯二甲醛－甲醇溶液　　称取邻苯二甲醛0.1g，加甲醇溶解并稀释至100ml。　　1.4　0.5mol/L盐酸溶液　　取浓盐酸4.17ml，加甲醛至100ml。　　1.5　0.1mol/L盐酸溶液　　取0.5mol/L盐酸20ml，加水至100ml。　　1.6　2.5mol/L氢氧化钠溶液　　称取氢氧化钠10g，加水100ml溶解。　　1.7　0.4mol/L氢氧化钠溶液　　取2.5mol/L氢氧化钠16ml，加水至100ml。
　　2　供试品溶液的配制　　取供试品0.5ml，加水1.2ml，混匀，加25%三氯乙酸0.3ml混匀，4000r/min离心10分钟后取上清液备用。
　　3　测定法　　取供试品溶液1.6ml置于已加1.5gNaCl的试管中，加正丁醇4.0ml、2.5mol/L氢氧化钠溶液0.2ml，立即混匀5分钟，静置后，取出3.6ml正丁醇相，加到已装有1.2ml的0.1mol/L盐酸溶液和2.0ml正庚烷的试管内，震荡5分钟，弃有机相，取出1.0ml盐酸相加入等体积水，再加0.4mol/L氢氧化钠溶液0.5ml，混匀并迅速加入0.1%邻苯二甲醛甲醇液0.1ml，立即混匀，置21～22℃、10分钟，加0.5mol/L盐酸0.5ml终止反应。取96孔酶标板，每孔加入上述经盐酸终止反应的溶液200μl，用荧光酶标仪，在激发波长350nm和荧光波长450nm下测吸光度。　　精密量取100ng/ml磷酸组织胺标准工作液1.0ml、0.8ml、0.6ml、0.4ml、0.2ml、0.1ml、0.05ml和0.025ml，并以0.1mol/L盐酸溶液补足至1.0ml；向各管中加水0.5ml和25%三氯乙酸溶液0.1ml混匀，以后操作同供试品。
　　4　结果计算　　将标准液磷酸组织胺含量对其相应的吸光度做直线回归，求得直线回归方程。将供试品吸光度代入直线回归方程求出供试品溶液碱基含量（G），按下式计算供试品游离组胺含量。
　　供试品游离组胺含量（ng/ml）=G×2.76×2.5（稀释倍数）
　　【附注】　磷酸组胺分子量为307.148，标准液浓度按碱基计，碱基与磷酸组胺分子量比为1：2.763。
　　　　　　　　　　注射用抗乙型肝炎转移因子制造及检定规程　　　　　　　　　RequirementsforAnti-HBVTransferFactorforInjection
　　本品用经乙型肝炎疫苗免疫的健康猪的脾脏和淋巴结，以冻融法破碎细胞，通过离心、超滤、巴氏消毒法等方法精制后制成的冻干制剂。
　　1基本要求　　1.1设施与生产质量管理　　按中国《药品生产质量管理规范》的要求实施。　　1.2　原料及辅料　　应符合现行《中国药典》或《中国生物制品主要原辅材料质控标准》的要求，未纳入上述标准的化学试剂，应不低于化学纯。　　1.3　生产用水　　生产用水源水应符合国家饮用水标准；纯化水及注射用水应符合现行《中国药典》标准。　　1.4生产用器具　　直接用于生产的金属或玻璃等器具，应经过严格清洗、去热原质处理或灭菌处理。
　　2　制造　　2.1　供体猪要求　　2.1.1　供体猪检疫　　供体猪应检测无猪瘟病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒、口蹄疫病毒和乙型脑炎病毒污染。如系经疫苗免疫过的猪，应进行抗体检测，结果应为阳性。　　2.1.2　对脾脏、淋巴结的要求　　经乙型肝炎疫苗免疫后抽血检查HBsAg抗体滴度达1∶40以上或皮试阳性者可摘取脾脏或淋巴结，并在24小时内放入-30℃中保存。有炎症、化脓或坏死变质的脾脏或淋巴结不得使用。
　　2.2　原液制备　　2.2.1　将新鲜或冷冻的脾脏及淋巴结在25℃左右去脂肪及结缔组织，然后用纯化水洗净。　　2.2.2　细胞破碎　　将洗净的组织切成小块，加入适量注射用水，用组织捣碎机破碎细胞，制成匀浆，加适量注射用水，混匀，置-20℃反复冻融5～8次，融化温度不得超过37℃。　　2.2.3　离心分离　　将冻融的匀浆离心（离心温度4℃），去沉淀，留上清液备用。　　2.2.4　澄清过滤与超滤　　上清液用0.45μm的微孔滤膜进行过滤，然后用截留分子量为5000道尔顿超滤膜进行超滤。　　2.2.5　污染病毒的灭活或去除　　采用经国家药品监督管理部门批准的方法灭活或去除病毒，即为原液。冻存于-20℃或以下，保存期为2个月。
　　2.3　原液检定　　按3.1项进行。
　　2.4　半成品制备　　2.4.1　配制与除菌　　配制时加入适量甘露醇作为稳定剂，用0.22μm微孔滤膜除菌过滤，即为半成品。　　2.4.2　分批　　应符合本版规程通则《生物制品分批规程》的有关规定。
　　2.5　半成品检定　　按3.2项进行。
　　2.6成品制备　　2.6.1　分装及冻干　　应符合本版规程通则《生物制品分装规程》的有关规定。　　2.6.2规格　　每支含多肽2mg。　　2.6.3包装　　应符合本版规程通则《生物制品包装规程》的有关规定。
　　3　检定　　3.1　原液检定　　3.1.1　无菌试验　　按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行，应符合规定。　　3.1.2　pH值　　在20℃±2℃测定，pH值应为6.5～7.5。　　3.1.3　蛋白质反应　　取制品2ml，加20%磺基水杨酸2ml应呈阴性反应。　　3.1.4　细菌内毒素　　按本版规程通则《生物制品细菌内毒素试验规程》进行。应小于10EU/支。　　3.1.5　多肽含量　　应不低于1.0mg/ml。　　3.1.6　核糖含量　　应不低于70μg/ml。　　3.1.7　特异活性试验　　方法见附录。未粘附细胞抑制指数（NAI）应不低于30%。
　　3.2　半成品检定　　3.2.1细菌内毒素　　按本版规程通则《生物制品细菌内毒素试验规程》进行，应小于10EU/支。　　3.2.2无菌检查　　按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行，应符合规定。　　3.2.3　pH值　　在20℃±2℃测定，pH值应为6.5～7.5。
　　3.3　成品检定　　除水分外，其余项目按制品标示量（2.0ml）加入灭菌注射用水溶解后进行检定。　　3.3.1　鉴别试验　　用SEC-HPLC法：色谱柱以适合分离多肽的色谱用凝胶为填充剂；流动相为0.1mol/LPB-0.1mol/L硫酸钠-0.05%叠氮钠，pH7.0；上样量20μl，用波长260nm检测，本品色谱峰应与对照品一致。　　3.3.2　外观　　应为白色或微黄色疏松体，加入灭菌注射用水后应迅速溶解为澄明液体，不得含有肉眼可见异物或摇不散沉淀。　　3.3.3　pH值　　在20℃±2℃测定，pH值应为6.5～7.5。　　3.3.4水分　　　　应不高于3.0%（W/W）。　　3.3.5　多肽含量　　　　应不低于1.0mg/ml。　　3.3.6　核糖含量　　应不低于70μg/ml。　　3.3.7　分子量及组分测定　　用SEC-HPLC法：色谱柱以适合分离多肽的色谱用凝胶为填充剂；流动相为0.1mol/LPB-0.1mol/L硫酸钠-0.05%叠氮钠，pH7.0；上样量20μl，用波长260nm检测，同时做低分子量标准多肽，不得检出分子量为10KD以上的组分。　　3.3.8　特异活性试验　　未粘附细胞抑制指数（NAI）应不低于30%。　　3.3.9　蛋白质反应　　取制品2ml加20%磺基水杨酸2ml，应呈阴性反应。　　3.3.10　无菌检查　　按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行，应符合规定。　　3.3.11　细菌内毒素　　按本版规程通则《生物制品细菌内毒素试验规程》进行，应小于10EU/支。　　3.3.12　异常毒性检查　　按本版规程通则《生物制品异常毒性试验规程》中小鼠试验项进行。　　3.3.13　外源病毒污染检查　　用动物病毒敏感的细胞（如BHK21），盲传3代，结果应呈阴性。
　　4　保存、运输及有效期　　于2～8℃避光保存和运输。自分装之日起有效期为2年。
　　5　使用说明　　根据国家药品监督管理部门批准的内容及本版规程通则《生物制品包装规程》编写。
　　6　附录　　抗乙型肝炎转移因子活性测定（白细胞粘附抑制试验）
　　　　　　　　　　　附录　抗乙型肝炎转移因子特异活性测定　　　　　　　　　　　　　　　　（白细胞粘附抑制试验）
　　抗乙型肝炎转移因子能够抑制白细胞在玻璃器皿表面的粘附作用，根据未粘附白细胞数计算抑制指数来测定抗乙型肝炎转移因子活性。　　1　试剂　　1.1　RPMI1640培养液：称取2.2g碳酸氢钠、5.9gHEPES，加培养液使溶解。经0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存。　　1.2　3.6%氯化钠溶液：称取3.6g氯化钠，溶于100ml水，经121℃、15分钟高压灭菌。
　　2　测定法　　2.1　小鼠白细胞悬液的制备　　取体重22～25g健康小鼠5只，由眼静脉放血，无菌取出脾脏，以1640培养液洗3次，用无菌铜网轻轻压碎制成细胞悬液，用1640培养液洗3次（1500r/min离心15分钟），然后每只鼠脾脏加3ml水破坏红细胞，再加3.6%氯化钠溶液1ml调整渗透压，混匀后用200目尼龙网过滤，滤液经1500r/min离心5分钟，再分别用0.9%氯化钠溶液和1640培养液各洗1次，收集细胞，用1640培养液调整细胞浓度为1.0×106-3.0×106个/ml，备用。
　　2.2　取供试品，按标示量加注射用水制成1mg/ml的溶液。取洁净的离心管2支，各加细胞悬液1ml，一管加供试品1ml，为供试品管；另一管加无菌0.9%氯化钠溶液1ml，为对照管。置37℃致敏30分钟，1500r/min离心10分钟，弃上清夜，每管沉淀分别准确加入1640培养液1ml。取无菌培养瓶6个，前3瓶各加供试品管细胞悬液0.2ml，后3瓶各加对照管细胞悬液0.2ml，然后每瓶内加纯化的30～100μg/mlHBsAg0.2ml，1640培养液0.6ml，置CO2培养箱内37℃培养1-2小时后，取出轻轻摇匀，静置1-3分钟，显微镜下计数未粘附的白细胞数。
　　3　结果计算　　按下式计算结果：　　NAI=（S-C）/C×100%。　　式中：NAI未粘附白细胞抑制指数；　　S供试品组平均未粘附细胞数；　　C对照组平均未粘附细胞数。
　　　　　　　　　　　　　金葡素注射液制造及检定规程　　　　　　　　　RequirementsforStaphylococcalEnterotoxinCInjection
　　本品系用金黄色葡萄球菌经培养除菌过滤制成的淡黄色或无色澄明液体。
　　1　基本要求　　1.1　设施与生产质量管理　　按中国《药品生产质量管理规范》要求实施。　　1.2　原料及辅料　　应符合现行《中国药典》或《中国生物制品主要原辅材料质控标准》的要求，未纳入上述标准的化学试剂，应不低于化学纯。　　1.3　生产用水　　生产用水源水应符合国家饮用水标准；纯化水及注射用水应符合现行《中国药典》标准。　　1.4　生产用器具　　直接用于生产的金属或玻璃等器具，应经过严格清洗、去热原质处理及灭菌处理。
　　2　制造　　2.1　菌种　　2.1.1　菌种名称及来源　　金黄色葡萄球菌生产用菌株需经国家药品监督管理部门批准，并由国家药品检定机构或国家指定的单位保管和分发。　　2.1.2　种子批的建立　　生产用菌种应采用种子批系统，原始种子批应验明其记录、历史来源和生物学特性。从原始种子批传代、扩增后经冻干保存为主种子批；从主种子批传代、扩增后冻干保存为工作种子批。主种子批和工作种子批的各种特性应与原始种子批一致。工作种子批用于生产。　　2.1.3　种子批的检定　　主种子批和工作种子批应进行下列检定。　　2.1.3.1　形态特征　　革兰氏阳性球菌，直径0.5～1.0μm，成葡萄串状排列。　　2.1.3.2　培养特性　　在血琼脂或其它适宜培养基的平板培养基上，35℃培养18～36小时，长成直径1.0～2.0mm圆形隆起，表面光滑湿润，边缘整齐的金黄色菌落，菌落周围有大而透明的溶血环；肉汤培养物呈混浊生长，底部有沉淀。　　2.1.3.3　　生化反应　　在糖类发酵培养基中生长18～24小时后，发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇和蔗糖，产酸不产气，不发酵阿拉伯糖和木糖，能产生血浆凝固酶。　　2.1.3.4　血清学凝集试验　　用抗血清作定量凝集试验，其凝集效价应不低于血清原效价之半。　　2.1.3.5　毒力试验　　肉汤培养物用生理氯化钠溶液稀释成5个不同浓度稀释液，每个浓度用体重18～20g小鼠5只，每只腹腔注射1.0ml，观察3天，记录小鼠死亡情况，计算LD50，1个LD50的菌数应小于1.5×109。　　2.1.3.6　抗原性试验　　选体重2.0～2.5Kg健康家兔3只，先腹腔注射3次，然后静脉注射3次，每次注射剂量分别为含菌1.0×1010/ml不含防腐剂的死菌悬液（可用0.6%福尔马林37℃作用7天杀菌兼脱毒；或加热杀菌）1、2、4、6、8、10ml，每次间隔3天，末次注射后12天采血做定量凝集试验，2/3家兔血清之凝集效价应达1∶800（+）。
　　2.2　原液制备　　2.2.1　生产用种子　　工作种子批菌种启开后，转种肉汤，35℃培养18～36小时，经菌形、纯度检查合格后，作为生产用种子液。　　2.2.2培养基　　采用经国家药品监督管理部门批准的培养基。　　2.2.3　培养　　用18～36小时生长良好的种子液，接种于生产用培养基中，35℃培养20～24小时。　　2.2.4　纯菌检查　　取生长对数期后期每瓶或罐培养物，涂片革兰氏染色镜检；接种血琼脂平板，35℃18～24小时培养。有杂菌生长者废弃。　　2.2.5　培养液合并　　经纯菌检查合格的培养液进行合并。　　2.2.6　除菌过滤　　合并的培养液最后用0.22μm滤膜除菌过滤。此滤液即为原液。　　2.2.7　原液检定　　按3.1项进行。　　2.2.8　原液的保存及有效期　　原液置2～8℃保存，保存期为3个月，超过3个月应重新进行无菌检查。
　　2.3　半成品配制　　2.3.1　配制　　用氯化钠调至等渗浓度，调pH值至6.0～7.5，肠毒素C含量为5～20ng/ml。　　2.3.2　半成品检定　　按3.2项进行。
　　2.4　成品制备　　2.4.1　分批　　按本版规程通则《生物制品分批规程》进行。　　2.4.2　分装　　按本版规程通则《生物制品分装规程》进行。　　2.4.3　规格　　每支装量为2ml，肠毒素C含量应为5～20ng/ml。　　2.4.4　包装　　按本版规程通则《生物制品包装规程》进行。
　　3　检定　　3.1　原液检定　　3.1.1　肠毒素C含量测定　　按附录1法测定。含量应不低于5ng/ml。　　3.1.2　总蛋白含量　　按本版规程附录蛋白含量Lowry法测定，含量应不低于800μg/ml。　　3.1.3　无菌试验　　按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行，应符合规定。
　　3.2　半成品检定　　3.2.1　渗透压比值　　与0.9%生理氯化钠溶液的渗透压比值应为1.00±0.05。　　3.2.2　无菌试验　　按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行，应符合规定。　　3.2.3　pH值　　应为6.0～7.5。
　　3.3　成品检定　　3.3.1　鉴别试验　　按附录1法进行，结果应呈阳性，即供试品孔与对照孔的吸光度值比应不低于2。　　3.3.2　外观　　本品为淡黄色或无色液体，无沉淀、无异物。　　3.3.3　pH值　　应为6.0～7.5。　　3.3.4渗透压比值　　同3.2.1项。　　3.3.5　肠毒素C含量测定　　按附录1法测定。含量应为5～20ng/ml。　　3.3.6　T淋巴细胞增殖试验　　按附录2法进行。增殖指数应不低于1.5。　　3.3.7　无菌试验　　按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行，应符合规定。　　3.3.8　异常毒性试验　　按本版规程通则《生物制品异常毒性试验规程》进行，应符合规定。　　3.3.9　热原质试验　　按本版规程通则《生物制品热原质试验规程进行》，注射剂量按家兔体重每1kg注射1.0ml，应符合规定。　　3.3.10　过敏试验　　取体重250～350g豚鼠6只，连续3次隔日腹腔注射本品0.5ml，分别于第一次注射后第14天及第21天静脉注射本品1.0ml，每次3只，在注射后30分钟内观察动物，不得有连续干咳、痉挛、休克、死亡等过敏症状，24小时内不得出现死亡。
　　4　保存、运输及有效期　　于2～8℃避光保存和运输，自分装之日起有效期为2年。
　　5　使用说明　　根据国家药品管理当局批准的内容及本版规程通则《生物制品包装规程》编写。
　　6　附录　　附录1　肠毒素C含量测定法　　附录2　T淋巴细胞增殖试验
　　　　　　　　　　附录1　肠毒素C含量测定法（ELISA法）
　　本法采用酶联免疫法测定金黄色葡萄球菌滤液中肠毒素C含量。
　　1　试剂　　1.1　包被液（pH9.6碳酸盐缓冲液）：称取碳酸钠159mg，碳酸氢钠293mg，加水溶解，定容至100ml。　　1.2　洗涤液（pH7.4PBS-Tween20）：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）29g，氯化钠80g，磷酸二氢钾2g，Tween-20　10ml，加水溶解并稀释至1000ml为浓缩液，临用前10倍稀释。　　1.3　酶标抗体稀释液（1%牛血清白蛋白、pH7.4）：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）2.9g，氯化钠8g，磷酸二氢钾0.2g，氯化钾0.2g，Tween-20　0.5ml，加水溶解并稀释至1000ml，临用前，加牛血清白蛋白至终浓度为1%。　　1.4　底物溶解液：称取柠檬酸0.47g，磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）1.8g，加水溶解至100ml。　　1.5　底物液：称取邻苯二胺2mg，溶于底物溶解液5ml，加30%过氧化氢3μl，混匀。　　1.6　终止液：2mol/L硫酸。
　　2　标准品溶液的配制　　用0.9%氯化钠溶液将肠毒素标准品稀释至20、16、12、8、4、2、1ng/ml。
　　3　测定法　　用包被液将包被抗体稀释至5μg/ml后，以100μl/孔加至酶标板，4℃放置过夜。用洗涤液洗涤3次。或取包被好的酶标板，用洗涤液洗涤3次。将稀释好的标准品溶液及供试品加入酶标板，以同批次的培养基为阴性对照，每孔100μl，每个稀释度作双孔，37℃放置2小时。用洗涤液洗涤3次。用酶标抗体稀释液将酶标抗体稀释1000倍，以100μl/孔加至酶标板，37℃放置1.5小时。用洗涤液洗涤3次。加入底物溶液，100μl/孔，37℃显色10～15min后，加2mol/L硫酸50μl终止反应3分钟，在492nm波长下测定吸光度。
　　4　结果计算　　以标准品的肠毒素C含量和对应的吸光度值进行直线回归，得直线回归方程。将供试品的吸光度值代入回归方程，即得供试品肠毒素C的含量。
　　　　　　　　　　　　　　附录2　T淋巴细胞增殖试验
　　1　试剂　　1.1　RPMI1640培养液（含10%胎牛血清）　取RPMI1640培养基干粉10.4g（规格为1L），加入1000ml超纯水溶解，再加入2.1g碳酸氢钠，4.77g羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），溶解后混匀，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存。量取经过56℃、30分钟灭活的胎牛血清10ml，加入RPMI1640培养液90ml，4℃保存。　　1.2　Hank's液：取氯化钠80g、磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）0.6g、氯化钾4.0g、磷酸二氢钾0.6g、硫酸镁（MgSO4?7H2O）2.0g、葡萄糖10g、无水氯化钙1.4g，加水至1000ml为原液。配制时取原液100ml，加水896ml，加0.5%酚红4ml，混匀，经121℃、15分钟高压灭菌，4℃保存。临用前，加无菌7%碳酸氢钠溶液调pH7.2。　　1.3　磷酸盐缓冲液（PBS）:称取8.0g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠（Na2HPO4?12H2O）、0.24g磷酸二氢钾，加水溶解并定容至1000ml，经121℃、15分钟高压灭菌。　　1.4　噻唑蓝（MTT）溶液：称取0.5gMTT溶于100ml磷酸盐缓冲液（PBS），使浓度为5mg/ml，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃避光保存。　　1.5　红细胞裂解液（Tris-NH4Cl）：称取3.735g氯化铵、三羟甲基氨基甲烷（Tris）1.3g加水溶解并稀释至500ml。0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存。　　1.6　pH调节混合液：量取盐酸1ml、冰醋酸9.6ml加水13.4ml。　　1.7　甲瓒（Formazan）裂解液（SDS-DMF）：量取二甲基甲酰胺（DMF）100ml，加水100ml配制成50%DMF（V/V）溶液，称取30g十二烷基硫酸钠（SDS）溶于200ml的50%DMF液，磁力搅拌，加pH调节混合液调pH为4.7。
　　2　脾淋巴细胞悬液制备　　无菌条件下剖开小鼠（C57BL或纯系昆明小鼠，体重18-22g，雌雄不限。）腹腔取脾，研磨过100目筛网，Hank's液冲洗，收集分离的脾细胞悬液，1000r/min离心5分钟，弃上清；加红细胞裂解液10ml，混匀脾细胞，静止4-5分钟，待红细胞完全破碎，1000r/min离心5分钟，弃上清去除红细胞，Hank's液洗2-3遍，用RPMI1640培养液重悬细胞，计数调整细胞浓度为8-10×106个/ml。
　　3　测定法　　96孔板上用RPMI1640培养液稀释供试品（设1∶1、1∶2、1∶4三个稀释度），每孔100μl，以生产用培养基为对照组，设3复孔，向各孔中分别加入100μl脾淋巴细胞悬液，37℃、5%CO2培养。72小时后，取培养板每孔加MTT液20μl，继续培养4小时，2500r/min离心10分钟，弃上清培养液，每孔加甲瓒裂解液100μl，待甲瓒沉淀溶解，在测定波长570nm，参比波长630nm下测定吸光度。
　　4　结果计算　　淋巴细胞增殖指数=供试品组平均吸光度值/对照组平均吸光度值。
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