鳗鲡迟缓爱德华氏菌偶联疫苗免疫效果评价--《免疫学杂志》2010年02期
鳗鲡迟缓爱德华氏菌偶联疫苗免疫效果评价
【摘要】：目的迟缓爱德华氏菌是目前水产养殖中主要的病原菌,其感染谱甚广,危害巨大。因此,研制能有效预防这种致病菌的疫苗,将会极大的促进水产养殖业的发展。方法用OMP-LPS偶联物、OMP、LPS、FKC(福尔马林灭活全菌)以及生理盐水对照组按相同程序分别免疫鳗鲡。通过溶菌酶活性检测、微量凝集反应试验,结果鳗鲡经OMP-LPS偶联物、OMP、LPS以及FKC疫苗免疫后,各免疫组间血清中溶菌酶活性没有显著差异(P0.05),但均远高于生理盐水对照组(P0.05);OMP-LPS偶联组抗迟缓爱德华氏菌(E.tarda)E29L株的抗体效价较单纯的LPS组、OMP组,FKC组抗体滴度高,且持续时间长;对迟缓爱德华氏菌(E.tarda)E29L株的攻击,OMP-LPS偶联组保护率为84%,高于单纯OMP组的80%,LPS组的44%和FKC组60%。结论 OMP-LPS偶联物、OMP、LPS、FKC添加佐剂ISA763,各组的溶菌酶活性均显著高于不添加佐剂各组(P0.05),除了FKC+ISA763佐剂组外,其余各组均与不添加佐剂各组差异极显著(P0.01),且添加佐剂各组保护率都明显高于不添加佐剂各组,说明添加ISA763佐剂能够更好的启动鱼类的特异性和非特异性免疫。
【作者单位】：
【关键词】：
【基金】：
【分类号】：R392.12【正文快照】：
迟缓爱德华氏菌(E而、dsi。llatarda，EO属于肠杆菌科，爱德华氏菌属，是鳗鲡的最主要病原性细菌之一，对鳗鲡养殖业危害较大。采用水产疫苗防治疾病，符合不污染环境、水产食屁，无药物残留的要求，已成为当今世界水生动物疾病防治界研究与开发的主流产品。迟缓爱德华氏菌疫
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【参考文献】
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在羊的血培养中发现一株与布鲁氏菌交叉反应的迟缓爱德华氏菌
【摘要】：在羊的血培养中发现一株与布鲁氏菌交叉反应的迟缓爱德华氏菌山东淄博市淄川区防疫站曹温年，常承忠中国预防医科院流行病学微生物学研究所李元凯，邱海燕１９９０年７月，在做羊群布鲁氏菌病检疫时，从一只山羊的血培养物中分离到一株与布氏菌诊断血清凝集的非布鲁氏菌属...
【作者单位】：
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【分类号】：S858.265.1【正文快照】：
在羊的血培养中发现一株与布鲁氏菌交叉反应的迟缓爱德华氏菌山东淄博市淄川区防疫站曹温年，常承忠中国预防医科院流行病学微生物学研究所李元凯，邱海燕１９９０年７月，在做羊群布鲁氏菌病检疫时，从一只山羊的血培养物中分离到一株与布氏菌诊断血清凝集的非布鲁氏菌属的
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迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella Tarda）LuxS/AI-2群体感应系统研究
【摘要】：
从患病牙鲆中分离出迟缓爱德华氏菌株TX1,经报告菌株检测发现TX1有AI-2活性。用梯度PCR和Genome walking的方法克隆了TX1 luxS基因,将luxS基因在大肠杆菌DH5α中表达,证明其具有功能活性。在TX1中,luxS的表达与AI-2的活性基本是一致的,二者均受生长时期和生长条件的调节,即在glucose存在的条件下luxS表达和AI-2活性升高,而在高温条件下luxS表达和AI-2活性降低。glucose对AI-2活性以及luxS表达的影响经过荧光定量PCR,启动子活性检测,AI-2活性检测以及凝胶滞缓等一系列的实验证实是由cAMP-CRP复合物介导的,该复合物可以通过与luxS启动子相互作用而抑制luxS的表达。RNA干扰表明,TX1中luxS表达被干扰以后,对细菌产生了多方面的影响,包括:(1)降低AI-2水平;(2)降低细菌的生长能力;(3)降低Ⅲ型分泌系统相关基因的表达水平以及生物膜的形成能力;(4)减弱细菌毒力。外源AI-2的添加可以回复Ⅲ型分泌系统相关基因的表达水平以及生物膜的形成,但是并不能修复生长状况,表明LuxS在TX1中具有双重功能,即参与细胞代谢以及群体感应信号传导。基于LuxS/AI-2群体感应系统对细菌毒力的重要性,设计并筛选了一个该系统的阻遏因子5411。Pull-down实验证明5411可以和LuxS特异性结合。研究表明5411在TX1中表达导致细菌毒力显著下降。将5411克隆至牙鲆共生菌FP3中,发现5411可以被分泌到胞外并能被TX1吸收。将表达5411的共生菌导入牙鲆,发现其能够有效阻遏TX1对牙鲆的侵染。
这些结果表明:(1) TX1中AI-2的活性受控于LuxS,而后者则受生长时期和生长条件的调控;(2) luxS的正常表达对于细菌的正常生长和侵染是必需的;(3) LuxS/AI-2群体感应系统调控Ⅲ型分泌系统相关毒力因子的表达;(4)通过阻遏LuxS/AI-2群体感应系统来抑制病原菌侵染是一种具有潜力的新型病害防控方法。
【关键词】：
【学位授予单位】：中国科学院研究生院（海洋研究所）【学位级别】：博士【学位授予年份】：2009【分类号】：Q93【目录】：
Abstract5-9
第一章 前言9-23
1.1 迟缓爱德华氏菌的研究进展9-12
1.1.1 迟缓爱德华氏菌的生物学特征9-10
1.1.1.1 分类地位9
1.1.1.2 主要特征9
1.1.1.3 抗原性9-10
1.1.2 迟缓爱德华氏菌的毒力因子10-12
1.1.2.1 分泌毒素10
1.1.2.2 Ⅲ型和Ⅵ型分泌系统10-12
1.1.3 迟缓爱德华氏菌的流行病学及其危害12
1.1.4 迟缓爱德华氏菌病的防治12
1.2 细菌的群体感应系统12-21
1.2.1 LuxI/LuxR介导的种内OS系统13-14
1.2.1.1 AI-1的生物合成13
1.2.1.2 AI-1的信号转导13-14
1.2.2 LuxS/AI-2介导的种间QS系统14-18
1.2.2.1 AI-2的生物合成14-16
1.2.2.2 AI-2的信号转导16-17
1.2.2.3 LuxS/AI-2表达的调节17-18
1.2.2.4 AI-2的检测系统18
1.2.3 OS系统的生物功能18-20
1.2.3.1 QS系统与生物膜的形成19-20
1.2.4 QS系统的干扰20-21
1.3 迟缓爱德华氏菌的QS系统21-22
1.4 研究目的22-23
第二章 迟缓爱德华氏菌AI-2活性的检测及luxS基因的克隆23-37
2.1 材料和方法24-33
2.1.1 实验材料24-25
2.1.1.1 菌株和质粒24
2.1.1.2 主要药品和试剂24
2.1.1.3 试剂盒24
2.1.1.4 实验仪器24
2.1.1.5 培养基24-25
2.1.1.6 常用溶液及缓冲液25
2.1.2 实验方法25-33
2.1.2.1 无菌培养上清的制备25
2.1.2.2 AI-2活性检测25-26
2.1.2.3 PCR扩增TXI luxS基因的核心序列26-27
1、基因组DNA的提取26-27
2、PCR扩增及产物纯化27
2.1.2.4 PCR纯化产物和载体的连接27-28
2.1.2.5 重组质粒的转化28-29
2.1.2.6 转化子的筛选与鉴定29
2.1.2.7 重组子的序列测定29-30
2.1.2.8 染色体步移法克隆luxS基因上下游序列30
2.1.2.9 PCR产物胶回收30-31
2.1.2.10 胶回收的PCR产物和pBS-T的连接,转化,重组子的鉴定及序列分析31
2.1.2.11 DHS川PBTES的构建31-33
2.1.2.12 luxS活性的检测33
2.2 结果33-35
2.2.1 TX1的无菌培养上清具有AI-2活性,且其活性受生长时期的影响33
2.2.2 TX1的AI-2活性受生长条件的影响33-34
2.2.3 TX1 luxS基因序列分析34-35
2.2.4 TX1 luxS基因可以与luxS缺陷型的E.coli DH5α互补35
2.3 讨论35-37
第三章 TX1 luxS基因的启动子分析37-42
3.1 材料和方法38-40
3.1.1 实验材料38
3.1.2 实验方法38-40
3.1.2.1 PCR扩增38-39
3.1.2.2 PCR产物的磷酸化处理和纯化39
3.1.2.3 PCR产物的连接、转化和重组子的筛选39
3.1.2.4 β-半乳糖苷酶酶活力测定39-40
3.1.2.5 定点突变40
3.2 结果40-41
3.2.1 β-半乳糖苷酶酶活检测41
3.2.2 luxS基因的启动子序列41
3.3 讨论41-42
第四章 luxS基因的表达和调控42-62
4.1 材料和方法43-57
4.1.1 实验材料43
4.1.2 试验方法43-57
4.1.2.1 RNA提取43-44
4.1.2.2 DNaseI处理提取的RNA44
4.1.2.3 cDNA的合成44-45
4.1.2.4 Real-Time PCR45
4.1.2.5 luxS在TX1中的过量表达分析45-47
4.1.2.6 luxS的启动子(P_(luxS))在TX1体内的活性分析47-49
4.1.2.7 TX1在不同培养条件下的AI-2活性分析49
4.1.2.8 E.coli CRP对P_(luxS)活性的影响49-51
4.1.2.9 凝胶滞缓实验(Gel electrophoresis mobility shift assay,EMSA)51-57
4.2 实验结果57-61
4.2.1 luxS基因在不同生长时期和不同培养条件下的表达57-59
4.2.2 P_(luxS)在TX1中的活性也受生长条件的影响59
4.2.3 glucose对luxS表达的影响是通过cAMP-CRP复合物介导的59-61
4.3 讨论61-62
第五章 TX1中luxS表达的反义RNA干扰62-74
5.1 材料和方法63-68
5.1.1 实验材料63
5.1.2 实验方法63-68
5.1.2.1 TX1/pJR18菌株的构建63-64
5.1.2.2 AI-2活性分析64
5.1.2.3 TX1/pJR18和TX1/pJRA生长状况的差异64-65
5.1.2.4 TX1/pJR18和TX1/pJRA对牙鲆致病力的比较65-66
5.1.2.5 TX1/pJR18和TX1/pJRA毒力因子表达的差异66-67
5.1.2.6 TX1/pJR18和TX1/pJRA生物膜形成能力的比较67-68
5.2 实验结果68-73
5.2.1 对AI-2活性的影响68-69
5.2.2 对生长的影响69-70
5.2.3 对致病力的影响70-72
5.2.4 对毒力基因表达和生物膜形成的影响72-73
5.3 讨论73-74
第六章 TX1 LuxS/AI-2系统人工阻遏子的筛选74-86
6.1 材料和方法75-81
6.1.1 实验材料75
6.1.2 实验方法75-81
6.1.2.1 LuxS活性位点的突变75-76
6.1.2.2 突变子对野生型LuxS活性的影响76
6.1.2.3 TX1/pJR5411的构建76-78
6.1.2.4 TX1/pJR5411的AI-2活性分析和生长情况检测78
6.1.2.5 Bio-5411与LuxS蛋白的结合78
6.1.2.6 His pull-down检测5411和LuxS蛋白的结合78-79
6.1.2.7 TX1/pJR5411和TX1/pJRA对牙鲆致病力的比较79-80
6.1.2.8 TX1/pJR5411和TX1/pJRA毒力因子表达的差异80
6.1.2.9 FP3/pT5411的构建80-81
6.1.2.10 DH5α/pJR5411与FP3/pT的分泌81
6.1.2.11 FP3/pT5411对TX1毒力的影响81
6.2 实验结果81-84
6.2.1 luxS突变子的AI-2活性及其和5411对野生型luxS活性的影响81-82
6.2.2 His pull-down证实Bio-5411可以和LuxS特异结合82-83
6.2.3 TX1/p5411对牙鲆的感染力显著下降83
6.2.4 DH5α/p5411和FP3/p5411可以分泌5411,并能被TX1吸收83-84
6.2.5 FP3/pT5411对TX1毒力的影响84
6.3 讨论84-86
参考文献87-96
缩略词表96-97
博士期间发表的论文和申请的专利97-98
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