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你可能喜欢设计PCR引物时 下游引物按互补配对出现 TAG 可以吗? TAG不是终止密码子吗?
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关键看你的产物是干啥用的.对于引物本身来说是无所谓的,只要是匹配了,应该能扩出来.
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标题: 新手 PCR几个基础问题,请不要见笑(引物设计|下游引物|正链)
摘要: [新手 PCR几个基础问题,请不要见笑(引物设计|下游引物|正链)] 刚进实验室,请教几个问题,请不要好笑 请大虾指正:1 什么是上游和下游引物?
上游引物是否是与正链的5`端互补?下游引物是否是与负链的5`端(或正链的3`端)互补?
例如以下序列:
5- gaaacggcga taagcgagag aatgtaagga ggtggcgtgc atcgggcaaa ctccgtacag
--------------------------- 关键词:[引物设计 正链 下游引物 负链 上游引物 序列 基因]……
刚进实验室,请教几个问题,请不要好笑.请大虾指正:1.什么是上游和下游引物?
上游引物是否是与正链的5`端互补?下游引物是否是与负链的5`端(或正链的3`端)互补?
例如以下序列:
5- gaaacggcga taagcgagag aatgtaagga ggtggcgtgc atcgggcaaa ctccgtacag
----------------------------------------------------------------------------------
-52.PCR引物设计时候为什么要加保护碱基?怎样加?3.听说PCR引物设计时要涉及到移码读框问题.这是怎么回事?应该怎样合理设计?4.PCR引物设计有很多原则,例如GC,Tm,.3`端等很多注意点.请问人工设计PCR引物怎样进行?需要注意什么?5.在原核和真核表达载体里,分别同时表达两个基因.有什么不同的地方吗?谢谢!
回复:1.上游和下游引物是分别位于基因待扩增序列的5`端和3`端。下游引物是与正链的3`端互补的序列。2.PCR引物设计时候为什么要加保护碱基?怎样加?
引物5"加入保护碱基的目的是:a.引物的合成是由3"到5"进行的,所谓纯度也指5"端是否完整,比如比预期少1个,或几个bases.加入保护碱基后,即便5"少个把bases也不会有问题;b.重要的是,如果您接下来的工作是酶切PCR产物,由于我们常用的限制酶类本身的特性,会出现位于边缘的位点不易被切断的现象.加入适当数目的保护碱基可以改善这种情况.3.听说PCR引物设计时要涉及到移码读框问题.这是怎么回事?应该怎样合理设计?
移码突变(frameshift mutations)是DNA序列上缺失或插入1-2个核苷酸，引起从这一突变点后翻译读框移位和变成一个完全改变的氨基酸序列。
关于这个问题涉及到两个方面，一是引物的特异性问题，另一个是酶的忠实性问题。
其他问题请其他同仁回答，不妥之处，请指正。回复:请问martin4720大虾,我哪里说错了吗?回复:PCR引物设计也不像你说的那么神秘,那么的难,多练习练习就好了.你说的手工设计是什么意思啊?现在大部分都是在用软件设计啊.这里有一篇关于引物设计的文章,挺好的,你参考一下吧.PCR引物的设计原则： ① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。② 产物不能形成二级结构。③ 引物长度一般在15~30碱基之间。④ G+C含量在40%~60%之间。⑤ 碱基要随机分布。⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。⑧ 引物5′端可以修饰。⑨ 引物3′端不可修饰。⑩ 引物3′端要避开密码子的第3位。怎么样才能把文章连接上啊?????回复:PCR引物设计也不像你说的那么神秘,那么的难,多练习练习就好了.你说的手工设计是什么意思啊?现在大部分都是在用软件设计啊.这里有一篇关于引物设计的文章,挺好的,你参考一下吧.PCR引物的设计原则： ① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。② 产物不能形成二级结构。③ 引物长度一般在15~30碱基之间。④ G+C含量在40%~60%之间。⑤ 碱基要随机分布。⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。⑧ 引物5′端可以修饰。⑨ 引物3′端不可修饰。⑩ 引物3′端要避开密码子的第3位。怎么样才能把文章连接上啊?????这个偶知道,书上就是这么写的.我想听听过来人怎么说的.回复:3.听说PCR引物设计时要涉及到移码读框问题.这是怎么回事?应该怎样合理设计?
移码突变(frameshift mutations)是DNA序列上缺失或插入1-2个核苷酸，引起从这一突变点后翻译读框移位和变成一个完全改变的氨基酸序列。
其他问题请其他同仁回答，不妥之处，请指正。谢谢martin4720 .移码突变(frameshift mutations)的意思我知道.但是PCR引物设计时如何考虑移码读框的问题呢?回复:
关于移码突变问题，是利用PCR技术检测基因突变过程中遇到的一种问题。如果说在设计引物时需要考虑这个问题的话，就是尽量避开或设计针对突变的引物以检测是否为突变还是野生型。具体一些方法如下：基因突变的检测方法 基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据检测目的和实验室条件选择时参考。PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。Sarkar等认为对于大于200bp的片段，用其RNA分子来做SSCP会提高其录敏度。应用PCR-SSCP检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因，也是检测抑癌基因p53突变最常用的方法，仅检测第5-8外显子即可发现85％以上的p53基因突变。由于该法简便快速，特别适合大样本基因突变研究的筛选工作。异源双链分析法（HA） HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似，所不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA，也只适合于小片段的分析。但HA对一些不能用SSCP检出的突变有互补作用，两者结合使用，可使突变检出率提高到近100％。突变体富集PCR法（mutant-enriched PCR）本法的基本原理是利用ras基因家族某个密码子部位存在已知的限制性内切酶位点，如K-ras基因第12密码子的BstNI位点，第13密古巴子有BgⅠⅡ位点。用链续二次的巢式PCR来扩增包括K-ras第12、13密码子的DNA片段，在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段，野生型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增，而突变型则能完整进入第二次PCR扩增并得到产物的富集。变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradinent electrophoresis,DGGE） DGGE法分析PCR产物，如果突变发生在最先解链的DNA区域，检出率可达100％，检测片段可达1kb，最适围为100bp-500bp。基本原理基于当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性湿度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳适移率下降，当解链的DNA链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程度而被分离。由于本法是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测，需要一套专用的电泳装置，合成的PCR引物最好在5`末端加一段40bp-50bp的GC夹，以利于检测发生于高熔点区的突变。在DGGE的基础上，又发展了用湿度梯度代替化学变性剂的TGGE法（温度梯度凝胶电泳temperature gradient gelelectrophoresis,TGGE）。DGGE和TGGE均有商品化的电泳装置，该法一经建立，操作也较简便，适合于大样本的检测筛选。化学切割错配法（chemical cleavage of mismatch,CCM）CCM为在Maxam-Gilbert测序法的基础上发展的一项检测突变的技术，其检测突变的准确性可与DNA测序相仿。其基本原理为将待测含DNA片段与相应的野生型DNA片段或DNA和RNA片段混俣变性杂交，在异源杂合的双链核酸分子中，错配的C能被羟胺或哌啶切割，错配的T能被四氧化饿切割，经变性凝胶电泳即可确定是否存在突变。该法检出率很高，也是检片段最长的方法，已有报功检测了1.7kb片段，如果同时对正、反义链进行分析，检出率可达100％。应用荧光检测系统可增强敏感度，可检测到10个细胞中的1个突变细胞。该法中的化学试剂有毒，又发展了碳二亚胺检测法（catodiimide,CDI）,CDI为无毒物质，也可检测大片段DNA的点突变。等位基因特异性寡核苷酸分析法（allele-specific oligonucleotide,ASO） ASO为一种以杂交为基础对已知突变的检测技术。以PCR和ASO相结合，设计一段20bp左右的寡核苷酸片段，其中包含了发生突变的部位，以此为探针，与固定在膜上的经PCR拉增的样品DNA杂交。可以用各种突变类型的寡核苷酸探针，同时以野生型探针为对照，如出现阳性杂交带，则表运河样品中存在与该ASO探针相应的点突变，ASO需严格控制杂交条件和设置标准对照避免假阳性和假阴性。目前已有商品化的检测盒检测部分癌基因ASO突变。DNA芯片技术（DNA chip） DNA芯片技术是90年代后发展的一项DNA分析新技术，它集合了集成电路计算机、激光共聚焦扫描、荧光标记探针和DNA合成等先进技术。可用于基因定位、DNA测序、物理图谱和遗传图谱的构建等。在基因突变检测方面DNA芯片也有广阔的前景，其基本原理为将许多已知序列的寡核苷酸DNA排列在1块集成电路板上，彼此之间重叠1个碱基，并覆盖全部所需检测的基因，将荧光标记的正常DNA和突变DNA发别与2块DNA芯片杂交，由于至少存在1个碱基的差异，正常和突变的DNA将会得到不同的杂交图谱，经过共聚集显微镜分别检测两种DNA分子产生的荧光信号，即可确定是否存在突变，该方法快速简单、片动化程度高，具有很大的发展潜力，将在基因突变检测中心发挥非常重要的作用。连接酶链反应（ligase chain reaction,LCR） 与其他核酸扩增技术比较，其最大特点为可准确区分基因序列中单个基因突变，由Landegree于1988年首次应用于镰刀奖细胞贫血的分子诊断。LCR是以DNA连接酶将某一DNA链的5`-磷酸与另一相邻链3`-羟基连接为基础，应用两对互补的引物，双链DNA经加热变性后，两对引物分别与模板复性，若完全互补，则在连接酶的作用下，使相邻两引物的5`-磷酸与3`-羟基形成磷酸二酯二酯键而连接，前一次的连接产物又作为下一次循环反应的模板，如果配对的碱基存在突变则不能连接和扩增。LCR产物检测最初是通过这32p标记上游引物3`未端，经变性凝胶电泳分离后放射自显影加以鉴定，其检测敏感性达到200个靶分子。也可设计1个横跨两引物的检测探针，用它与LCR产物进行杂交检测。近年有应用荧光素、地高辛等非核素标记方法。Batt在1994年发展了一种更为简的方法，好微孔板夹心杂交法。由于LCR的快速、特蛋和敏感的特性，以及能检测单个碱基突变的能力，因此被应用于肿瘤基因突变的分子诊断，并与PCR结合用以提高其敏感性。等位基因特异性扩增法（Allele-specific amplification,ASA）ASA于1989年建立，是PCR技术应用的发展，也称扩增阻碍突变系统（amplification refractory mutation system,ARMS）、等位基因特性PCR（allele-specific PCR,ASPCR）等，用于对已知突变基因进行检测。该法通过设计两个5`端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯合性突变，分别加入这两种引物及3`端引物进行两个平行PCR，吸有与突变DNA完互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物。如果错配位于引物的3`端则导致PCR不能延伸，则称为ARMS。ARMS和ASPCR借鉴多重PCR原理，可在同一系统中同时检测两种或多种等位基因突变位点。ASA法的检出率依赖于反应条件的优化和可能发生的引物与靶DNA有氏配时错配延伸，特别是当错配碱基为G：T时，这时可通过调整实验条件如引物靶DNA，Taq DNA聚合酶的浓度等来得高瓜在特异性。在反应体系中加入甲酰胺也可减少非特异性扩增。还可通过在引物3`端的第二个碱基引入一个错配碱基，使之与模板之间形成双重错配以阻止错误延伸。RNA酶A切割法（RNase A cleavage） 在一定条件下，氨基源双链核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA中的错配碱基可被RNaseA切割，切割产物可通过变性凝胶电泳分离。当RNA探针上错配的碱基为嘌呤时，RNaseA在错配处的切割效率很低，甚至不切割，而当错配碱基为嘧啶时，则其切割效率较高。故如果仅分析被检DNA的一个条链，突变检出率只有30％，如同时分析正义和反义二条链，检出率可达70％。该法需要制备RNA探针，增加了操作的复杂性，但可用于1-2kb的大片段进行检测，并能确定突变位点。于这些优越性，它仍被作为一种经典方法用于对未知突变进行分析。染色体原位杂交（In situ hybridization of chromosome）染色体发现距今已有150多年的历史，染色体检测被广泛用于动、植物及人类的细胞遗传学研究，随着染色体分技术和分子生物学技术的发展。染色体研究范围也不断扩大，特别是用于肿瘤分子诊断。肿瘤细胞的染色体变化是一非常普遍的现象，可分为原发和继发两类。在肿瘤形成的生物学基础方面，原发性的染色体变化与引起肿瘤的直接原因有关，肿瘤细胞中可以发现各种形式的染色体畸变，如缺失、重复、易位、重排、单体断裂及核内复制等；继发性变化主要是肿瘤细胞核型的改变。染色体的检测对于肿瘤的诊断、鉴别诊断、生物学行为判别等方面都重要意义。染色体的检测方法进展很快，检测的精确率也不断提高，这里主要介绍荧光原位杂交和PRINS法。荧光原位杂交技术（fluorescent in situ hybridiaation,FISH）创建于1986年。1969年Gall和Pardue首先应用核素标记核苷酸制备探针，通过放射自显影检测杂交信号。应用核素标记的探针其敏感性可以检测到中期染色体上几百个碱基的单拷贝靶核苷酸序列，敏感性虽高，但定位不够精确。FISH具有探针稳定、操作安全，可快速、多色显示多个不同探针的杂交信号等优点。FISH的灵敏感与探针标记方法和检测性能有关，探针标记时掺入的修饰核苷酸比例直接影响杂交信号强度。FISH探针一般采用随机引物法或切口翻译法，如将PCR技术引入FISH探针标记，可使其灵敏度提高到0.25kb。应用慢扫描CCD配合影像处理理软件，增强信噪比，有利于检测微弱信号，如应用TSA系统（tyramide signal amplification）能将杂交信号再放大1000倍，可用于单拷贝基因的定位。FISH分辨率大约为1-3Mb,如果应用强变性剂处理染色体，让DNA分子从蛋白质中分离出来，使双DNA完全伸展并粘附在玻片上，经引处理后，分辨率可达1-2kb。还可采用对分裂中期染色体进行显微解剖（microdissect）法以提高分辨率。FISH的另一个特点是可以联合庆用地高辛、素等多种标记系统， 在一次杂交中可检测多种探针在染色体上的位置及探针间的相互关系，即多色FISH或多靶FISH。FISH技术已被广泛应用于肿瘤研究中的基因扩增、易位重排及缺失等的检测，在肿瘤诊断和鉴别诊断、预后和治疗监控等方面都有重要意义。Klch等于1989年发明了染色体上寡核苷酸引物原位DNA合成技术（oligonucleotide primed in situ DNA synthesis,PRINS）,并成功地用于染色体特异α卫星DNA标记。其基本原理是用非标记的寡核苷酸引物同染色体上靶序列特异性地杂交，在DNA聚合酶作用下，当引物延伸时，掺入标记的核革酸可直接或间接地检量标记位点。PRINS技术的优点是不需克隆基因作探针，且由于杂交反应在前，标记在后，故非特异怀背景低。缺点是信号弱，灵敏度低，为克服这一制眯，Terkelsen等建立了重复引物原位标记技术（repeated PRINS）,重复进行PRINS反应，使信号号强度明显提高。基于FISH的原理，发展了多色原位经物标记（multicolor PRINS）,可测定二个以上靶序列在DNA分子上的相互的位置，且特异性比FISH还高。DNA序列分析（DNA sequencing） 应用各种突变检测技术检测到的基因突变，最后都需用序列分析才能确定突变类型及突变位置，其效率可以达到100％。现在的测序方法已与经典的方法有了很大的不同，其基本原理虽仍是双脱氧终止法，但自动化程度大为提高，操作更简便，测序时间也大大缩短。随着PCR技术与测序联合使用，不需经过M13亚克隆步骤，故称为直接测序法（direct sequencing,DS）。DS法测序的模板主主要来源于PCR，应用不对称PCR（asymmetric PCR）和基因组扩增转录同步测序法（genomic amplification with transcript sequencing,GAWTS）等，使单链产物大大增加。近年来，PCR循环测序法的建立，使模板扩增与同步进行，引物用四种不同前颜色的荧光标记，使每个样品的四个测序反应可在一个反应管和一个泳道内进行，大大提高了测邓的自动化程度。目前PE公司推同出的DNA自动测序仪已发展到96泳道，并仍在不断改进。这些高度自动化的测序方法是经较理想的基因突变分析技术，但其昂贵的费用其使用范围，所以对一些小样本或为了某些特定目的的样本分析，仍进行经典的手工测序。突变基因的检测方法多种多样，特别是PCR技术诞生后，许多检测技术都是在PCR基础上衍生的。由于PCR扩增南非要的模板量少，使对肿瘤的突变分析可以精确到单细胞，如霍奇金病的R-S细胞的单细胞基因突变分析。另外，应用显微解剖法（microdissection）可在组织切片上较精确地挑选需检测的靶点，其优点是可克服肿瘤组只中间质或癌周组织的混杂，提高准确性。除上述介绍的方法外，还有多种方法也用于基因突变的分子检测，如对未知突变基因进行分析的酶促切割错配法（enzyme mismatc cleavage,EMC）、切割片段长度多态性（cleavage fragment length polymor phism,CEFLP）、双脱氧指纹图谱法（dideoxy finger printing,ddF）、错配接合蛋白质截短测试法（protein truncation test,PTT）等。对已知突变基因进行分析 的有引物延伸法（primer extension,PEX）、寡核苷酸链接检测法（oligonucleotide ligation assay,OLA）、毛细管电泳(capillary electrophoresis)法（capillary electrophoresis,CE）等方法。回复:关于移码突变问题，是利用PCR技术检测基因突变过程中遇到的一种问题。如果说在设计引物时需要考虑这个问题的话，就是尽量避开或设计针对突变的引物以检测是否为突变还是野生型。再次感谢martin4720 !但您的回答不是我问题的本意或不是我想知道的...........对您的热情资助再次感谢!回复:PCR引物设计及软件使用技巧 张新宇，高燕宁* （中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤研究所，北京100021） 摘 要：本文旨在介绍使用软件设计PCR引物的技巧。在PCR引物设计原则的基础上，详细介绍了两种常用引物设计软件的基本使用方法，并对其各自的优缺点进行了比较。一般性引物自动搜索可采用“Premier Primer 5”软件，而引物的评价分析则可采用“Oligo 6”软件。 不知道你有没有这篇文章,没有的话我可以发给你.你也可以自己去搜索.其实没必要追求那么精细,设计的引物是以能拉出自己想要的目的片断为目的的.你好好参考一下这篇文章好了.回复:我想你还是先去做，学学基本的引物设计常识，移码突变的问题等测序以后再考虑。原核和真核表达的区别，初略来讲，就是启动子不同，不能互用。这个生化和分子学教材讲的很清楚啊回复:移码突变：如果你克隆后只是定性或半定量，则无须考虑移码突变；如果你克隆后还需要表达出你的蛋白质，则设计引物时必须考虑移码突变。一般表达载体自身都带有启动子，当你的基因亚克隆后，连接入经某种梅切后的表达载体，为了忠实地表达你的目的基因密码子的完整性，也就是说，当你的基因插入表达载体后，在载体中你的目的基因的密码子的顺序或排列应完全与其在体内的一致（从启动子后每三个碱基为一密码子），如果不一致，则在设计引物时，必须加上一个或两个保护性碱基，否则会产生移码突变，就会表达出另外一种不是你的目的蛋白质。回复:关于第一个问题：上游引物是结合负链的3‘端，用于从负链的5’端开始扩增正链。反之，下游引物就是结合正链的3‘端，用于从正链的3‘端来扩增负链。关于第二个问题：PCR引物设计的时候加入保护碱基的作用主要如果我们需要在引物引入特定的酶切位点的时候，那么必须分别在上下游引物的5’端的该限制内切酶识别位点前加上3至5个保护碱基。因为在进行切割的时候，它由于空间位阻的问题，必须占用旁边的一些碱基位置，而且由于其是从5‘端来开始移动来进行识别的，故而在引物的5’端加上保护碱基，以便回收PCR产物进行酶切的时候能够被正确酶切，从而顺利将PCR产物连上特定的载体。但如果你采用TA克隆，那么就不需要考虑加入特定的酶切拉点了，也就不需要再额外加入保护碱基了。关于第三个问题：设计PCR引物的时候最需要注意的是移码突变的问题，这一点对于克隆至表达载体上进行基因表达的时候尤为重要。首先你要看表达载体的多克隆位点，如果按你所加入的选定的酶切位点克隆时候，从该表达载体的ATG算起，即载体上RBS区域后面的ATG，到你所要克隆进去的基因的第一个碱基起之间的碱基数是不是3的倍数，如果不是的话，那么你就要想办法加入一个或两个碱基使其读码框正确。关于第四个问题：PCR引物设计的原则请参与PCR技术手册，我想那里讲的比我在这里说的更为详细，在此不再赘述。关于第五个问题：在原核和真核表达系统里面的不同之处在于它们基因的密码子编码的氨基酸不同，因此如果你需要同时在两个系统里面表达同一个基因，那么如果该基因是来自原核生物的，那么它在真核表达系统里面会可能由于编码不同而产生突变体（我也不是很确定，你可以再查询更多的参考文献来佐证）。如果该基因是来自真核基因染色体DNA，那么它在真核表达系统里面当然是没问题，但如果它在原核表达系统里面就可能表达不出来，因为原核生物细胞里面缺乏相应的后加工系统。如果该基因是来自真核基因cDNA那么，只要表达系统的启动子好，而且各种条件都合适，那么该基因在原核及真核表达系统都能够被表达。但是，注意一点，基因表达是一个很奇妙的东西，相信你接触多了以后会有相当的感触的。希望能对你有所帮助，也请你查相关的资料来验证我所说的是否正确，以避免对您的实验带来不便。祝你成功。回复:移码突变：如果你克隆后只是定性或半定量，则无须考虑移码突变；如果你克隆后还需要表达出你的蛋白质，则设计引物时必须考虑移码突变。一般表达载体自身都带有启动子，当你的基因亚克隆后，连接入经某种限制性内切酶梅切后的表达载体，为了忠实地表达你的目的基因密码子的完整性，也就是说，当你的基因插入表达载体后，在载体中你的目的基因的密码子的顺序或排列应完全与其在体内的一致（从启动子后每三个碱基为一密码子），如果不一致，则在设计引物时，必须加上一个或两个保护性碱基，否则会产生移码突变，就会表达出另外一种不是你的目的蛋白质。一般来说这个问题只要稍微注意一下就行，公司设计的表达质粒的插入位点一般都考虑了这个问题。只要你将完整的ORF插进去，一般不会有这个问题。回复:5.在原核和里,分别 同时表达两个基因.有什么不同的地方吗?6、请推荐一个好的经典的引物设计的文章或书籍？谢谢！回复:5.在原核和里,分别 同时表达两个基因.有什么不同的地方吗?你要问哪方面同于不同？你能不能将你要问的讲的更详细点？我目前只能回答这几点：1、你是说分别表达同一个基因吧？我已经回答过了，就是启动子不同。2、由于密码子有通用性（即不论是病毒、原核生物还是真核生物密码子的含义都是相同的），你将c放到两种表达质粒的合适位点都可以表达，这是相同的地方。3、不同的表达质粒，即使都是原核的，或者都是真核的，表达水平都不一样，这是不同的地方。6、请推荐一个好的经典的引物设计的文章或书籍？谢谢！《分子克隆》，第三/四版，这是分子生物学的宝书，没有不能解决的问题。
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