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【原创】手把手教你在线做PCR引物设计，不需要下载任何软件
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这个帖子发布于8年零141天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
POST by Bingsen Xu前言：我是刚刚注册到丁香园，在PCR技术讨论版看见置顶贴，“请求助引物设计的战友先进来这里！”稍微浏览了一下，发现很多朋友对PCR引物设计还不是很熟悉，我愿意把自己积累的一点引物设计方面的经验和大家分享，希望不会做引物设计的朋友看完之后，可以不用再发求助贴而是自己动手做引物设计或者引物检验。开始之前：其实非常简单，不需要你下载任何软件，但是你得有一台电脑能上网。当然，最重要的是，你要很清楚用于做引物的模板序列，至于怎么找模板序列，不再本贴的讨论范围。另外，要先对PCR目的序列的长度有个大致估计，好了，马上开始吧：第一步：找到Primer3的站点。你不用记住这个站点，但是要记住“Primer3”这个词，然后打开GOOGLE首页，输入Primer3，跳出来的第一个项目就是了“Primer3 Input 0.4.0 (primer3-web/htdocs/input-040.htm)”网址是http://frodo.wi.mit.edu/。第二步：贴上模板序列。进入Primer3站点，可以看到一个引物设计的界面。（附件Word文档里有图）在“Paste source sequence below (5'-&3'…..”下面的大空框里面把你的模板序列粘帖进去。注意是5'-&3'方向的，数字或者空格都没关系，软件会自动过滤的。第三步：重要参数设定。首先是“Product Size Ranges”，如果你不希望软件给你随便做的话，首先要调整的就是这个参数。默认的参数实际上是从100到1000，这个你得自己改，如果你希望产物的大小符合你的预期，尽可能把范围改小，比如480-500，具体看情况调整。第二个参数是“Primer Size”，默认值一般可以用，但是，当你用熟了这个软件，你自己就知道该怎么改了。第三个参数是”Primer Tm”这个和Primer Size差不多。第四步：Pick primers： 点一下这个按钮，符合你大小预期的primer就出来了，看看Primer3 Output的界面，多么漂亮！你要的primer出来了，而且有primer在序列上的位置比对图，还有primer本身的信息，包括位置，长度，Tm，GC含量，任何位置互补碱基数，3'端互补碱基数，以及引物序列，（注意，下游引物是5'-&3'），还有产物大小，两引物间任意互补碱基数，两引物间3'端互补碱基数等。如果引物尚在参数设定的范围内，但还不是最佳，将会给出警告。比如（随便举例，本人在做一个超长引物）：WARNING: Left primer is unacceptable: High 3' stability
seq LEFT PRIMER
TAATACGACTCACTATAGGGGTGAAAGACTGCCRIGHT PRIMER
AAAGGGTTAATTTGCATGCTTTATTTACACACATSEQUENCE SIZE: 1388INCLUDED REGION SIZE: 1388PRODUCT SIZE: 1388, PAIR ANY COMPL: 5.00, PAIR 3' COMPL: 3.00第五步：引物设计检验：可以仅仅设计一向引物，只要在Pick left primer或者Pick right primer前面的勾勾掉一个就可以。也可以自己定义引物，放在Primer框里，（注意，下游引物的书写反向仍然是5'-&3'）如果符合设定的条件，软件将对给出引物评分，同时给出警告信息，根据警告信息可以适当对自定义引物做些调整即可，警告信息也让你做实验的时候心中有数。对于文献发表的引物，最好都要检查一下，这样就可以避免被别人有意无意误导。至于RT-PCR所用的引物，最好是使得产物跨过内含子，这样避免潜在DNA对RT-PCR的干扰。实际做引物的时候，要把内含子都去掉，仅仅把外显子序列放入源序列框中，并且通过自定义引物设计的方法，使上下游引物分别全部或者部分落在不同外显子上。至于如何快速识别内含子和外显子以及电子PCR，我将抽空另做说明。至于设计出来的引物的实际效果，根据我的经验，一般情况下都能做到PCR一次成功，也许随便那一段序列做引物也能达到很好的效果，但是不管怎么说，软件做引物可以让自己心中有数。最后，GOOD LUCK TO EVERYONE.
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bingsenxu edited on
这个网站不错。
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谢谢啦 用得着的东东
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支持原创，谢谢分享。
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楼主好人，谢谢分享！
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恩，不错不错，继续努力。
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有用的东东，谢谢啦！！要是提供你的qq号，可以实时交流就更好啦。我的qq：，欢迎大家来交流！
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支持原创，谢谢分享。
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谢谢楼主啊！
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这一段时间也在做PCR ，引物序列是文献上的
但是就是有的扩不出来
可以验证一下了 谢谢
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谢了，我会验证下，最近做PCR结果老出不来，急死了
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非常实用！！！！！！！！！
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感谢分享 又学到一招
不过还是觉得oligo比较好 哈
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这样做处的不是太严禁啊！希望详细的
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这个网站是不错，但是我上次照这个上面设计的8对引物有3对都做不出来。我觉得还是primer bank好些，这个里头的引物都能做出来。网址是这个，不过这个针对的是对已知基因，而不是目的序列
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以后可以试一试，多谢了。
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多谢楼主啦
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谢谢楼主，能不能帮我查一下引物？QQ
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很有用的东东！支持原创，谢谢分享。
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我这个警告是什么意思哦？我看不懂，可不可以指点下？谢谢了Primer3 Output--------------------------------------------------------------------------------WARNING: Numbers in input sequence were deleted. Using mispriming library rodent_ref.txtUsing 1-based sequence positionsOLIGO
rep seq LEFT PRIMER
2.00 11.00 aggacatggagcaagtttggRIGHT PRIMER
9.00 gttcagtgaaatgccggagtSEQUENCE SIZE: 1980INCLUDED REGION SIZE: 1980PRODUCT SIZE: 500, PAIR ANY COMPL: 3.00, PAIR 3' COMPL: 1.00
1 gccgccgcctcacctctgctgccagtagcctcgccgtcggggagccctagcgcagcgtcc
61 gccctcagcatgatggacttggaattgccaccgccaggactacagtcccagcaggacatg
121 gatttgattgacatcctttggaggcaagacatagatcttggggtaagtcgagaagtgttt
181 gactttagtcagcgacagaaggattatgagctggaaaaacagaaaaaactcgaaaaggag
241 agacaagagcaactccagaaggaacaggagaaggcctttttcgctcagttacaactggat
301 gaagagaccggagaattcctcccaattcagccagcccagcacatccagacagacaccagt
361 ggatctgtcagctactcccaggttgcccacattcccaaacaagatgccttgtactttgaa
421 gactgtatgcagcttttggcagagacattcccatttgtagatgaccatgagtcgcttgcc
481 ctggatattcccagccacgttgagagctcagtcttcaccacccctgatcaggctcagtca
541 ctcgatagctctctggagacggccatgactgatttaagcagcatacagcaggacatggag
&&&&&&&&&&&
601 caagtttggcaggagctattttccattcccgagttacagtgtcttaatacggaaaacaag
661 cagcaggctgagactaccactgtccccagcccagaggccacactgacagagatggacagc
721 aattaccatttttactcatcgatcccctcactggaaaaagaagtggacagctgtagtcca
781 catttccttcatggttttgaggattcttttagcagcatcctctccacggatgatgccagc
841 cagctgaactccttagactcaaatcccaccttgaacacagatttcggtgatgaattttac
901 tctgctttcctagcagagcccagtggcggtggcagcatgccttcctctgctgccattagt
961 cagtcgctctctgaacttctgggcgggcccattgagggctgtgatctgtccctgtgtaaa
1021 gctttcaaccagaagcacactgaaggcacggtggagttcaatgactctgactccggcatt
&&&&&&&&&&& 1081 tcactgaacacaagtcccagccgagcatccccagagcactctgtggagtcttccatttac
1141 ggagacccaccgcctgggttcagtgactcggaaatggaagagctagacagtgcccctgga
1201 agtgtcaaacagaatggacctaaagcacagccaacacattcttctggggatacagtacag
1261 cctctgtcgccagctcaagggcacagtgctgctgtgcacgaatcccagtgtgaaaataca
1321 acaaaaaaagaagtacctgtgagtcctggtcatcaaaaagtcccattcacaaaagacaaa
1381 cattcaagccgattagaggctcatctcacaagagatgagcttagggcaaaagctctccat
1441 attccattccctgttgaaaaaatcattaatctccctgttgatgacttcaatgaaatgatg
1501 tccaaggagcaattcaacgaagctcagcttgcattaattcgagatatacgcaggagaggg
1561 aagaataaagttgccgctcagaactgtaggaaaaggaagctggaaaacattgtagagctg
1621 gagcaagacttgggccacttaaaagacgagagagaaaaactactcagagaaaagggagaa
1681 aacgacagaaacctccatcttctgaaaagaaaactcagcactttgtatctggaagtcttc
1741 agcatgttacgtgatgaggatgggaaaccttactctcccagtgagtactctctgcagcag
1801 accagagatggcaacgtgttccttgttcccaagagcaagaagccagatacaaagaaaaac
1861 taggttcgggaggatggagccttttctgagctagtgtttgttttgtacggctaaaacttc
1921 ctactgtgatgtgaaatgcagaaacactttataagtaactatgcagaattatagccaaag
KEYS (in order of precedence):&&&&&& left primer&&&&&& right primerADDITIONAL OLIGOS
1 LEFT PRIMER
2.00 11.00 tcagcatgatggacttggaa
RIGHT PRIMER
1.00 10.00 atcaggggtggtgaagactg
PRODUCT SIZE: 464, PAIR ANY COMPL: 4.00, PAIR 3' COMPL: 0.00 2 LEFT PRIMER
0.00 10.00 ctcagcatgatggacttgga
RIGHT PRIMER
1.00 10.00 atcaggggtggtgaagactg
PRODUCT SIZE: 465, PAIR ANY COMPL: 4.00, PAIR 3' COMPL: 0.00 3 LEFT PRIMER
1.00 11.00 ctagacagtgcccctggaag
RIGHT PRIMER
9.00 taagtggcccaagtcttgct
PRODUCT SIZE: 459, PAIR ANY COMPL: 5.00, PAIR 3' COMPL: 2.00 4 LEFT PRIMER
2.00 10.00 agcaagtttggcaggagcta
RIGHT PRIMER
9.00 gttcagtgaaatgccggagt
PRODUCT SIZE: 491, PAIR ANY COMPL: 4.00, PAIR 3' COMPL: 1.00Statistics
high compl compl
3765Pair Stats:considered 1605, unacceptable product size 1590, ok 15primer3 release 1.1.0(primer3_results.cgi 0.4.0 modified for WI)
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具体怎么验证用这个软件出来的引物呢 楼主有时间在给我们讲一下吧
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楼主可否做个示范看看感激
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谢谢楼主的精彩奉献
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首先我想谢谢LZ，你教的方法很实用！另外，我还想说的是我做出的引物界面有点问题，你能帮我看下吗？本人不甚感激！连接如下：我不知道“WARNING: Numbers in input sequence were deleted.”意味着什么
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谢谢楼主啊；
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WARNING: Numbers in input sequence were deleted这个警告不用理他，根据字面意思理解你就明白啦，肯定是你给出的序列里面包含数字了。其实做引物一点都不神秘，软件的用处只是告诉你，你做的引物在序列的什么位置，目前给定的引物自身的物理属性如何，包括理论Tm，GC含量，长度等。我说过了，软件辅助的引物设计，只是让你心中有数而已，至于实验中PCR能不能做出来，不在此讨论。至于参数具体怎么调整，只要花几分钟读一下做引物那个网页，其实没有什么不明白的，没什么高深的东西。看明白了，也就可以运用自如了。我的使用经验是，在这里做引物，你希望把引物做多长，就可以大致可以做多长，如果实在没有符合条件的引物，在把参数改一下，把条件放宽点。有时候做引物的时候，往往必须包含某些序列，用软件可以做一些适当的前移或者后移，至于有没有效果，也只有实验之后才知道了。最后说一下做引物的一些简单原则，首先什么原则不是教条，可以根据具体情况调整。尽量使引物对之间Tm差距不要太大，比如尽量不要超过8度尽量使得引物的3·端含有更多A或者T，这样容易起始尽量减少引物自身或者引物之间粘连，比如自身粘连不要多于6个碱基其他还有一些，不过可能并不重要，希望大家自己去实验体会很多东西，只要花一点时间了解和实践，做到随心所欲并不难。
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primer3还是不错的。我用它设计的大多数都能扩出来
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谢谢分享！
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关于丁香园怎么设计引物？_百度知道引物设计原则_百度知道离问题还有
(共有<span
style="color:#FF位秀友关注过此问题)
我要设计一个引物做PCR，目的片段在T载体上，我要分别在两个引物中加上两个不同的酶切位点，其中一个要带有标签，我想知道标签加在N端好还是C端好，我要在真核细胞中表达这个蛋白，加药观察其变化，我是否要标签和目的蛋白之间加linker？因为第一次设计引物，又因为这个引物对我将来的实验影响特别大，所以一直迟迟不敢定，希望内行的师兄师姐帮帮忙，能否把具体的顺序也表明一下，非常感谢！
共有3位秀友回答　
提问者： [] [] []
欢迎您用专业知识为他人答疑解惑，花三五分钟，帮别人解决一个问题，快乐自己一天！
我为人人，人人为我，让我们一起努力共同打造一个专业的学术交流互助平台.
秀友回答 (3)
T载体一般都含有标签，所以不需要自己添加，如果你要做蛋白的功能研究，还是需要加一个linker，如果不是，就没必要了！
该回答共有0位秀友支持
回答者： 一级 一星助者
T载体一般是克隆载体，标签通常在表达载体上，查阅相关是载体说明书即可知
该回答共有1位秀友支持
回答者： 一级 一星助者
在N端加，C端有时无法表达，tag直接与蛋白质相连，不加linker
该回答共有0位秀友支持
回答者： 一级 一星助者
回答字数在10000字以内
亲，您需要登陆后才能回答该问题
如果您在、、或任一系统注册过的话，
请用您注册的用户名和密码在下面的登陆框中登陆后再发布您的答案，
如果您在以上系统都未曾注册过，请点击"注册"按钮一分钟注册，谢谢！
找到"要表达一个融合蛋白，引物中带有标签，是否还要加linker，以及如何选择？"相关问题约26篇，用时0.093750秒
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SOE法构建甲状腺自身免疫ScFv基因
目的甲状腺自身免疫疾病(AITD)的患者血中有多种抗甲状腺自身抗体.为了构建单链抗体(ScFv)库以获得抗甲状腺ScFv,首先需要构建ScFv基因,我们利用重叠延伸拚接(SOE)法,制备了人源ScFv基因,为建立ScFv库和进一步研究AITD的发病机制及分析甲状腺自身抗体的作用打下基础.方法分离Graves病人血中的单个核细胞.提取总RNA,逆转录合成cDNA.参照文献报道设计引物,重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的引物均采用兼并序列引物,VH5′引物和VL3′引物带有27个互补碱基的接头(linker)编码序列.VL3′引物插入Spel内切酶位点,VH5′引物插入Sacl内切酶位点.先分别通过PCR扩增VH和VL,将纯化的VH和VL扩增产物按照一定比例混合,利用VH和VL互补序列,做15次PCR循环,合成出完整的ScFv基因,再以VH3′和VL5′引物进行PCR获得更多的ScFv基因产物,将ScFv基因重组到p3SCMH噬菌粒中,并做酶切鉴定.结果用PCR扩增VH和VL基因,PCR产物做电泳鉴定,经1.5%琼脂糖凝胶电泳,在380bp和420 bp左右有特异扩增带.将VH和VL的PCR产物用低溶点胶电泳纯化,并分别做DNA定量,将VH和VL的量调整为不同的比例做SOE,制备ScFv基因.PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳显示在800 bp左右有特异扩增带.纯化后的PCR产物,用Sacl+Spel双酶消化后,重组到噬菌粒中,转入XL1-blue大肠杆菌中扩增,再以提纯的重组噬菌粒做模板以VH3′引物和VL5′引物做PCR扩增,同时对重组噬菌粒做双酶切鉴定.琼脂糖凝胶电泳显示,两种鉴定方法均在800bp处有特异条带,证明ScFv连接成功.结论构建未知亲本抗体的ScFv常采用两种方法,一种是将Linker设计在表达载体上,两端各有限制性内切酶位点供VH和VL插入;另一种方法即本文使用的SOE法.前者操作繁杂,而SOE法虽然操作相对简单但不容易成功,它要求VH和VL的量要有严格的比例.由于纯化的VH和VL做准确定量有困难,我们的体会是做SOE时将VH和VL的量以不同的比例混合,以增加成功率.一般认为Linker长度以14～25个氨基酸残基为宜.本文采用的15肽序列(Gly4Ser)3是目前使用最广泛的Linker.本实验制备的ScFv基因已经成功的构建了噬菌体抗体库,并筛选出TRAb噬菌体抗体.
作者单位：
天津医科大学,内分泌研究所,天津,300070
年，卷(期)：
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