蛋白镍柱最后洗脱的时候，用了EDTA，能把蛋白洗脱下来吗？
本来应该用高浓度的咪唑洗脱的，但是洗脱完了才发现用了EDTA。。。蛋白能洗脱下来吗，洗脱下来还有用吗？在线等，挺急的
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【求助】蛋白纯化后浓度太低怎么办？
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请教：我的His融合蛋白是可溶蛋白，分子量较小，只有11KD左右，亲和层析纯化后浓度过低，用SDS-PAGE电泳检测都看不出条带，用BCA分析法检测浓度只有几十微克/毫升,已试过加尿素，500mM咪唑，800mM咪唑洗脱，都无效。本人刚学做蛋白纯化不久，遇上这个问题一直解决不了，郁闷呐！求各位高手出出主意！查看完整版本请点击这里：
ritou1985 ( 11:53:45)
用PEG20000浓缩，透析袋选择分子量小于你目的蛋白分子量的（8000或者更小）
方法是将你要浓缩的蛋白加入到透析袋中，然后将透析袋直接放入有少量PEG20000的器皿中（要直接接触），整个过程在4度冰箱中进行，浓缩时间看你的透析袋的大小，一般几个小时即可，切忌浓缩时间过长以至蛋白干燥
wmp1234 ( 11:54:17)
谢谢各位，由于实验条件有限，（没有透析袋等）如果用亲和层析的方法，能够再通过优化条件来纯化吗？
biabiade ( 11:54:34)
如果只是想看到条带的话，用银染吧。
如果想吧蛋白浓度提高一点的话，纯化时减少凝胶的体积，增加洗脱液中的咪唑浓度。
yes4 ( 11:54:50)
个人觉得还是表达条件和纯化条件没摸好！
还是从这两个方面着手，否则都是空谈，再浓缩怎么弄都不行啊，SDS-PAGE都看不出条带来，一点意义没有啊
chuntian1983 ( 11:55:08)
如蛋白之安基所言，优化表达和纯化是王道。
估计你的表达量量不是很高，能不能通过换载体提高表达量呢，事实上，10K多一点的蛋白的确不是很好表达。我折腾一个9K的多肽很久了，就是量太低，现在基本放弃。
表达没有问题了再考虑纯化。
如果你仅是要一点点蛋白做个小实验，到也可以通过亲和富集来实现。貌似你的蛋白洗不下来，我是猜得，呵呵。
是不是结合力太强呢？你加尿素是这个目的的吧？500mM的咪唑一般都是可以的了。也可以尝试加NaCl看看，是不是有离子作用。
是不是还有一种可能，你的蛋白质疏水性比较强啊，这样的话就不是很好办了，可以先用相关软件预测一下。
bling ( 11:55:25)
想问一下，可以通过什么软件分析蛋白质的疏水性可抗原决定簇？
jiushikeshui371 ( 11:57:26)
如蛋白之安基所言，优化表达和纯化是王道。
估计你的表达量量不是很高，能不能通过换载体提高表达量呢，事实上，10K多一点的蛋白的确不是很好表达。我折腾一个9K的多肽很久了，就是量太低，现在基本放弃。
如果真是表达量低话，换载体能提高表达量嘛？能否举个例子说说，谢谢。换载体的话又是通过什么方式提高了表达呢？
zbboom ( 11:57:51)
增加诱导菌液体积，然后用更少的洗脱液浸泡柱子，然后离心得到高浓度的洗脱蛋白。
nn255 ( 11:58:23)
想问一下，可以通过什么软件分析蛋白质的疏水性可抗原决定簇？
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DNA Star 软件 还比较好用，试试吧
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诱导表达 1、挑取含重组质粒的至ml?LB（含）培养基中37过夜培。 2、按1比例稀释过夜菌，一般将μl菌到含ml LB（含）培养基的ml试管中,?37震荡培养至OD.8（最好0.6，大约需hr，双抗大约需hr）。 3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入诱导至终浓度作为实验组,两组继续震荡培养hr。 4、分别取菌体ml,?离心1000 g × 1 min收获沉淀，用μl　蛋白loading　buffer重悬混匀5、离心1g × 5 min，取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。
准备细胞，接种，诱导表达。对于实验室用的pET载体表达系列，在细胞OD600 0.4-0.8时，用IPTG诱导1-4小时，可以获得理想的表达效率。收集细胞，置于-20 ℃或立即进行步骤2操作。
用Binding Buffer重悬清洗细胞，混匀，离心收集菌体。再加入1/20细胞生长体积的Binding Buffer，将菌体悬浮起来，混匀，冰上超声破碎细胞。
10000 g，4 ℃离心20－30 min。取上清，置于冰上备用或-20度保存。
将处理好的NTA树脂装入合适的层析柱，将样品加到NTA层析柱中，流速控制在0.5-1 ml/min左右，收集流出部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况。
用大约5倍柱体积的Binding Buffer洗，流速控制在0.5-1 ml/min左右，直到紫外监测数值基本无变化
分别用2－5倍柱体积的梯度Elution Buffer洗脱，咪唑浓度分别为40mM，60mM，80mM，100mM，120mM，500mM。流速控制在0.5-1ml/min左右，收集洗脱液。待清楚纯化条件后，就可只使用2个咪唑梯度纯化。
确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。最为有效的方式是SDS/PAGE分析。
目标蛋白质需要进一步纯化需要根据蛋白质的用途确定。纯化的目标蛋白质的保存条件需要根据蛋白质的性质和用途确定。
三、柱材料处理
1）用大约10倍柱体积的Strip Buffer洗，流速
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His-Tag蛋白纯化——全球研发人员的经验
Tips from the Developer
Tobias Hausmann博士在慕尼黑Ludwig-Maximilians大学攻读完有机化学、材料科学和制药化学课程后，Tobias Hausmann进入德国Forschungszentrum Jülich研究中心从事生物有机化学研究，目前在Penzberg任职罗氏诊断的研发主管。Tobias Hausmann是纯化树脂方面的专家，在基质和表位标记领域拥有技术专长。Hausmann 领导了cOmplete His-Tag Purification Resin的技术开发，该产品是His标签蛋白的纯化基质，也是罗氏cOmplete明星产品家族的成员之一。
您是缘何涉足蛋白纯化研究的？
HAUSMANN：作为一名受过专业教育的化学研究人员，且拥有材料科学背景，我着重从事生物有机化学的论文研究。我就是在那时接触到蛋白质的。在攻读博士后和在罗氏担任研发团队负责人期间，我负责开发了用于蛋白亲和纯化的各种材料。例如，我们开发出了亲和纯化材料。最近我们主要开发的是用于his标签蛋白纯化的新型镍螯合剂。
目前该领域中最常见的方法有哪些？
HAUSMANN：根据蛋白的不同属性，有非常之多的不同方法可供选择。其中最简单，且快速、易于放大的方法是利用热或盐进行蛋白沉淀。此外还有众多的色谱法，如凝胶过滤法、体积排阻色谱法或离子交换色谱法。目前使用最多的方法是和沉淀，应用抗体温和且高度特异性地分离蛋白。对于在天然和变性条件下的重组蛋白纯化，固定化金属亲和纯化（IMAC）是目前最常用的，它能够对His标签蛋白实施一步法高特异性纯化处理。是最常用的蛋白标签，带有6 -14 个组氨酸残基，可被融合到靶蛋白上。IMAC树脂由镍螯合有机分子构成，并连接到基质上。复合的镍原子配位可结合His标签内组氨酸的咪唑环，因而His标签蛋白被特异性吸附到树脂。通过降低缓冲液pH值或加入游离咪唑可从IMAC树脂上洗脱靶蛋白。
IMAC 树脂自推出以来经过了哪些改良？
HAUSMANN：螯合剂的化学特性一直在不断改良，以适应各种不同的温度条件和缓冲液，进而可供用于更广泛的应用。另一个重点是要防止镍的脱落，因为重金属有毒，且容易导致蛋白氧化。一开始，IMAC树脂仅使用3个配位键将镍结合到基质上；目前大部分填料使用4个配位键。2012年罗氏推出了一种新型树脂，使用5个配位键螯合镍，既显著提升了蛋白纯化性能，又兼顾了实验人员的安全。
研究人员应用常用的IMAC树脂遇到过哪些挑战？
HAUSMANN：直到最近，IMAC 树脂还未摆脱三大局限：第一，您无法使用金属螯合剂（如EDTA）来抑制靶蛋白被金属蛋白酶降解，因为EDTA会对传统IMAC 树脂上的镍起到螯合作用。第二，您无法灵活使用特定浓度的还原剂，如二硫苏糖醇（DTT）来打开二硫键并保留裂键，DTT还用来保持还原状态下的游离巯基。但DTT也可还原树脂上的镍。最后，传统IMAC树脂的镍释放严重。蛋白得率降低和蛋白功能干扰可能都是由镍泄漏导致的，因为众所周知镍会加速蛋白氧化。此外，制药用途的蛋白必须完全不含镍。到目前为止，这一直阻碍了IMAC树脂在制药开发中的应用。在消除镍释放后，IMAC现在可被用于新的应用领域。借助cOmplete His-Tag Purification Resin，可出现蛋白降解、氧化损伤和重金属污染。
在产品开发过程中最重要的考虑事项有哪些？
HAUSMANN：最重要的是要改进树脂结合化学。亚氨基二乙酸（IDA）- 和次氮基三乙酸（NTA）-树脂在镍原子的6个配位键中结合了其中的3-4个，但我们选择5个配位键的结合来避免非特异蛋白的结合，提高纯化性能。这还能带来非常强的Ni结合，使我们的树脂无需Ni的再生即可重复使用。除此之外，这种连接方式不仅强化了螯合剂与琼脂糖基质的连接，还可促进蛋白的配位，带来更好的结合动力学。
其他改进包括对树脂载量和避免蛋白聚集的性能平衡。其改进的结果表现为，在用cOmplete His-Tag Purification Resin进行纯化时，缓冲液中用于排除树脂非特异蛋白结合所用的咪唑浓度减少。在蛋白洗脱时，可用低浓度咪唑或完全不用咪唑（调节pH值洗脱）的缓冲液，以最大程度降低或消除洗脱组分中的咪唑。另一方面，如果研究人员选择使用高浓度咪唑洗脱，如用500 mM的咪唑，在蛋白洗脱步骤时即直接对cOmplete His-Tag树脂实现了清洗。在实施后续的蛋白纯化时，将无需额外清洗树脂。当然如需在蛋白纯化时得到，我们还是建议进行小规模预试验进行纯化关键参数的优化。
您认为蛋白纯化领域的未来趋势如何？
HAUSMANN：我们认为总体趋势将朝着可持续发展和“绿色”行为的方向发展，这不仅体现在大规模制造上，也包括研究领域。在提供性能更佳的方法的同时降低实验中的毒性，得以满足实验人员安全和生态友好两方面的要求。罗氏的总体原则是致力于为蛋白质组学研究的所有环节提供解决方案和支持，推动得到最佳结果。
小资料1：关于His标签
聚组氨酸标签（His标签）是最常用的蛋白批量纯化标签。His标签包含6 – 14个组氨酸，通常被融合到靶蛋白的N末端或C末端，也可被插入到靶蛋白暴露的茎环结构中。His标签的咪唑侧链可结合至某些过渡金属离子，如Ni2+、Co2+或Zn2+。
其中Ni2+对His标签的亲和性和选择性最高，因此优选推荐。利用与基质共价连接的某种螯合剂，可将Ni2+固定化，同时仍不妨碍 Ni2+离子与组氨酸侧链发生相互作用。当His标签蛋白被添加到这种含Ni基质上时，它们能与树脂发生特异性结合，而大部分未标记蛋白不会结合到树脂，最终结合的蛋白可在温和的条件下从基质上洗脱。咪唑可在Ni2+上竞争配位键，取代His标签蛋白的结合。或者，通过降低 pH值将能使His标签质子化，也能从树脂上洗脱His标签蛋白。
相比表达宿主的任何含内源性组氨酸蛋白，His标签蛋白应与镍螯合基质形成更强的结合，才可获得纯化。蛋白的相对结合强度取决于有多少组氨酸同时结合至基质（亲和效应）。较长的His标签对树脂的结合力更强，能更好地从宿主蛋白中分离出靶蛋白。最传统的His标签含6个连续的组氨酸。10-14个组氨酸的标签蛋白纯化效果会更好。相比其他常用的亲和标签，如谷胱甘肽巯基转移酶（GST）或麦芽糖结合蛋白（MBP），即便是最长的His标签其分子量也是很小的。更重要的是，在镍螯合基质上His标签蛋白可在天然及变性条件下被纯化。
归功于其亲水性和灵活性，His标签通常能够提高靶蛋白的溶解性，且很少会对蛋白功能产生干扰。这些独有的特征让His标签成为一种强大的工具，广泛用于各种蛋白纯化用途。
小资料2：选择适当的缓冲系统
为了实现纯化效率的最大化，重要的是要选择最佳的缓冲液以确保靶蛋白的稳定性和溶解性。归功于Ni2+ 对cOmplete
Resin的高结合强度，研究人员可根据蛋白情况选择最合适的缓冲液，且无需在保证蛋白稳定性和树脂稳定性之间折中考量。
cOmplete His-Tag Purification Resin与含有EDTA和DTT的缓冲液兼容，该特征能够有效抑制金属蛋白酶，在对易氧化蛋白的纯化方面尤为便利。为了得到最佳的蛋白纯度，在结合和洗涤步骤中的缓冲液选择以及洗脱条件都可通过调整咪唑浓度或pH 值来加以调节。咪唑与His标签蛋白竞争Ni2+的结合位点，添加低浓度咪唑有助于防止宿主污染蛋白结合在树脂上。
His标签靶蛋白与cOmplete His-Tag Purification Resin的结合也取决于pH值。
调整缓冲溶液的pH值是非常方便的方法，用于蛋白洗涤和洗脱，但溶液pKa值与温度相关，因此在纯化实验时请始终在同一温度条件下进行操作，以保证pH值调整的可靠性。
大肠杆菌培养基中含有葡萄糖等碳原，会产生有机酸使溶液的pH值降低。因此在培养基中应加入K2HPO4缓冲液，并在高缓冲容量的碱性缓冲液中重悬细胞，并注意重悬液的pH值检测和调整。
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图片赏析…蛋白过镍柱纯化，在用咪唑洗脱后需要做透析，透析怎么做？？？ - 实验交流 - 生物秀
标题: 蛋白过镍柱纯化，在用咪唑洗脱后需要做透析，透析怎么做？？？
摘要: [蛋白过镍柱纯化，在用咪唑洗脱后需要做透析，透析怎么做？？？] 现在有含有6个his标签的蛋白，用镍柱做纯化。在用咪唑洗脱后，需要做透析，我想问一下，透析应该怎么做呢？？？需要什么设备装置？？？希望哪位大神指导一下，越详细越好，在下非常感谢。在一篇文中看到，在做完透析后，又过了一个poly(rI rC)-agarose,不知道这个poly(rI rC)-aga 关键词:[透析 透析袋 咪唑 洗脱 浓缩 超滤 缓冲液]……
现在有含有6个his标签的蛋白，用镍柱做纯化。在用咪唑洗脱后，需要做透析，我想问一下，透析应该怎么做呢？？？需要什么设备装置？？？希望哪位大神指导一下，越详细越好，在下非常感谢。
在一篇文中看到，在做完透析后，又过了一个poly(rI.rC)-agarose,不知道这个poly(rI.rC)-agarose是什么东西？？？它有什么作用呢？
谢谢回复不知道你做什么试验。不过咪唑洗脱一般不需要透析。如果细胞用尿素裂解，为了除去尿素做透析。不知道你做试验的目的是什么，如果只做些酶活试验，直接用就好了。回复买个透析膜，用夹子夹住做成一个袋子，把你样品加在袋子里边，再把透析带架在烧杯里，烧杯你加你想置换的buffer回复烧杯、透析袋、夹子、磁力搅拌器，冰箱或者层析柜。一般透析24h以上。
烧杯里面加入透析缓冲液；透析袋在用之前煮下，然后一端用夹子固定，加入你要透析的样品，再用夹子封死两端，丢到烧杯即可。回复是需要透析的，剪下合适长度的透析袋，蒸馏水低火煮10分钟，一端夹好，加入蛋白液，另一端也用夹子封好，放入盛有透析液的烧杯中。初始透析液不加入甘油，直接透析，后换加甘油的透析液，此时可加快速度，即使用磁力搅拌器。祝好运！回复看看生工的产品目录里面有透析设备，也有方法……回复透析简单的很，只需买个透析袋，透析袋截留分子量小于目的蛋白，然后袋子两端扎口，把蛋白装进袋子里，放进缓冲液中4度透析24小时，可以中间更换缓冲液回复一般都有现成的透析管在离心机中离心就行了，如果没有，也就只能透析了回复我建议使用超滤浓缩管，不仅可以去除咪唑，还可以浓缩蛋白，一举两得，并且时间比透析来的快回复我用的也是超滤管，既能换液又能浓缩回复用millipore超滤装上样品，凡在低温上离心，去除小分子和浓缩同时做了，如果嫌浓度大了，就加入水调体积。回复如果不差钱，我也提倡用管，方便、省时，用样品损失的多，时间比较长。回复根据你的蛋白分子量 选择合适的然后换两次溶液 彻夜透析就可以了
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