包涵体洗涤与纯化问题 - 实验交流 - 生物秀
标题: 包涵体洗涤与纯化问题
摘要: [包涵体洗涤与纯化问题] 我表达的是GST融合蛋白，超声后检测发现主要是包涵体形式表达，请问各位，谁有包涵体洗涤与纯化的具体步骤呢？我网上 查了 有用十二烷基肌氨酸钠法，但是没找到具体操作步骤，哪位知道，给提供下，谢谢啊！ 关键词:[包涵体 免疫 复性 融合蛋白 佐剂 电泳 亲和纯化 目标蛋白]……
我表达的是GST融合蛋白，超声后检测发现主要是包涵体形式表达，请问各位，谁有包涵体洗涤与纯化的具体步骤呢？我网上 查了 有用十二烷基肌氨酸钠法，但是没找到具体操作步骤，哪位知道，给提供下，谢谢啊！回复
我表达的是GST融合蛋白，超声后检测发现主要是包涵体形式表达，请问各位，谁有包涵体洗涤与纯化的具体步骤呢？我网上 查了 有用十二烷基肌氨酸钠法，但是没找到具体操作步骤，哪位知道，给提供下，谢谢啊！ ... 分子克隆上写的很详细.
如果您要做GST亲和纯化,我建议您重新调整表达条件,如果想用包涵体的GST融合蛋白,根本挂不了柱,复性也不行.首先复性率很低,第二复性后与GST亲和柱的结合力也很弱.当然如果你不用亲和纯化,那就无所谓了.包涵体洗涤和溶解的步骤,我们都是采取如下方案:
1.取保存于－80℃的含原核表达质粒的表达工程菌BL21（DE3）100μL 分别加入5mL加Kan的培养液中（终浓度为80 μg/mL）37℃, 250r/min 振荡培养过夜；
2.按1：100接种（取250μL过夜培养的菌液接种到250mL LB培养液）37℃振荡培养至OD600为0.6～0.8之间(约3～4h)；
3.加入IPTG（终浓度200ug/mL,1mmol/L）（母液为20％IPTG（800mmol/L）），37℃，200rpm振荡培养6h；
4.取出1mL菌液4000rpm，4℃离心10min收集菌体，SDS-PAGE电泳检测IPTG诱导是否成功。其余菌液4℃保存。如经电泳检测IPTG诱导成功，12000g离心菌体,用0.2%的DOC悬浮,超声破菌；
5.加 DOC至终浓度2%，充分重悬沉淀，室温下静置至少10min；4℃，13000r/min，离心15min ，重复一次；
6.加DOC至终浓度为0.2%，混匀，静置10min；4℃，13000r/min，离心15min沉淀包涵体；重复一次；
7.用含0.6％~1.2% SKL的ddH20充分重悬包涵体沉淀，室温静置4h以上,使沉淀充分溶解；4℃,13000r/min，离心30min，收集上清保存于4℃。 SDS-PAGE电泳检测上清中是否溶解有大量原核表达目的蛋白。
谢谢大家，我纯化GST融合蛋白用的是sigma产品：glutathione－agarose
这个珠子先与GST融合蛋白结合，然后用还原型谷胱苷肽洗脱。也就是说洗涤溶解并缓冲液透析复性后的包涵体就无法挂在珠子上么？
我这个纯化方法属不属于亲和纯化啊？问题弱弱，实在是不太懂，谢谢了。
ps：我的后续实验主要是制备特异性抗体，不知表达出来包涵体影响大不？
lz提到的就是GST亲和纯化啊, 我也做过这方面的, 就像我前面说的目前复性率一般不超过25%, 而且根本挂不上柱.
推荐两种方法可以解决lz目前的情况.
1.直接包涵体,不用复性,纯化到电泳纯后,1.2%SKL溶解,过G25除盐,调浓度至1mg/mL,直接免疫动物.抗血清收下来,如果你的目标蛋白和GST分子量差很多,那就直接用就好了,如果分子量和GST差不多,就要选择纯化,具体方法您可以上网查一下, 大致就是用目标蛋白溶液包被PVDF膜,再用你的抗血清包膜,最后用酸洗膜,中和洗脱液,就是单独针对目标蛋白的igG了.
2.调整表达条件,低温,增大通气量,短时诱导,多少会有一点在上清中的蛋白,可以通过GST亲和柱浓缩,然后凝血酶作用,除掉蛋白的GST标签.
很多人说可以直接超声裂解细胞，沉淀重悬后跑SDS-PAGE胶 然后在2MKCL里就能见到白色的蛋白条带，然后直接切胶，碾碎后可以混合佐剂也可以不混合佐剂就能直接打抗体了，但是具体操作我还是不怎么懂
如果要胶纯化的话直接加1×loading buffer重悬包涵体沉淀,煮沸10min, 上样就要了, 跑完之后用3M KCl(预冷)染色, 直到看到白色的蛋白带,切下来,由于PAGE本身就可以达到缓慢释放蛋白的作用(佐剂),所以可以不加佐剂,研碎后直接免疫动物即可.
但是KCl染色的灵敏度不是特别好,必须杂带很少,否则染的时候干扰很大.因此使用的不是很多,而且动物对PAGE有一个耐受的上限, 因此抗原的量是有限制的(不能一次打太多的胶), 因此免疫的效果不是很理想.
我曾经看到过一个改良的方法, 试了两三个抗原,免疫的效果还不错.具体的方法如下:
跑PAGE, 考兰染色后,脱色30min, 更换2%戊二醛固定蛋白,室温摇动1~2h即可,然后继续脱色直到蛋白带清晰.切下目的带, 液氮研成粉末, 用佐剂悬浮注射.
这个方法的优点主要在,考兰染色特异性和灵敏度高,这就使得上样的样品不用特别纯, 因为带分的很清楚; 第二就是戊二醛固定, 一方面减少脱色中的损失,另一方面,戊二醛可以起到交联的作用,使小分子抗原交联在一起,增大免疫原性. 如果使免疫小鼠大鼠的话,这个方法是很方便的,但是如果 免疫的是兔子或者羊, 还是按照蛋白纯化那条路来吧, 切胶免疫一次出来的抗原不够免疫大动物, 与其跑多次胶免疫, 还不如纯化一批抗原省事,效果也比切胶好.
另注: 小鼠一次注射PAGE胶的最大耐受量是: 50mm3
强烈同意zhenxin的观点。变性再复性后的效率很低，根本无法挂柱子纯化。
相关热词：
生物秀是目前国内最具影响力的生物医药门户网站之一，致力于IT技术和BT的跨界融合以及生物医药领域前沿技术和成功商业模式的传播。为生物医药领域研究人员和企业提供最具价值的行业资讯、专业技术、学术交流平台、会议会展、电子商务和求职招聘等一站式服务。
官方微信号：shengwuxiu
电话：021-温馨提示！由于新浪微博认证机制调整，您的新浪微博帐号绑定已过期，请重新绑定！&&|&&
LOFTER精选
网易考拉推荐
用微信&&“扫一扫”
将文章分享到朋友圈。
用易信&&“扫一扫”
将文章分享到朋友圈。
阅读(3425)|
用微信&&“扫一扫”
将文章分享到朋友圈。
用易信&&“扫一扫”
将文章分享到朋友圈。
历史上的今天
loftPermalink:'',
id:'fks_',
blogTitle:'包涵体的形成以及处理方法',
blogAbstract:'&
1 包涵体形成的原因
(1)表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体L2]。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对，过多蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。(2)重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，真核糖蛋白无法糖基化使中问体溶解度下降，导致不溶解包涵体形成 ]。(3)重组蛋白分泌序列的存在阻碍折叠，导致错误折叠分子的产生。(4)重组蛋白的氨基酸组成，一般来说含硫氨基酸越多越容易形成包涵体。(5)包涵体形成动力学研究表明，包涵体是由部分变性的中阃体聚合而成。因此，任何影响中间体稳定的因素，如pH值(pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体)离子强度和温度都可以引起蛋白聚',
blogTag:'',
blogUrl:'blog/static/',
isPublished:1,
istop:false,
modifyTime:0,
publishTime:0,
permalink:'blog/static/',
commentCount:0,
mainCommentCount:0,
recommendCount:0,
bsrk:-100,
publisherId:0,
recomBlogHome:false,
currentRecomBlog:false,
attachmentsFileIds:[],
groupInfo:{},
friendstatus:'none',
followstatus:'unFollow',
pubSucc:'',
visitorProvince:'',
visitorCity:'',
visitorNewUser:false,
postAddInfo:{},
mset:'000',
remindgoodnightblog:false,
isBlackVisitor:false,
isShowYodaoAd:false,
hostIntro:'',
hmcon:'1',
selfRecomBlogCount:'0',
lofter_single:''
{list a as x}
{if x.moveFrom=='wap'}
{elseif x.moveFrom=='iphone'}
{elseif x.moveFrom=='android'}
{elseif x.moveFrom=='mobile'}
${a.selfIntro|escape}{if great260}${suplement}{/if}
{list a as x}
推荐过这篇日志的人：
{list a as x}
{if !!b&&b.length>0}
他们还推荐了：
{list b as y}
转载记录：
{list d as x}
{list a as x}
{list a as x}
{list a as x}
{list a as x}
{if x_index>4}{break}{/if}
${fn2(x.publishTime,'yyyy-MM-dd HH:mm:ss')}
{list a as x}
{if !!(blogDetail.preBlogPermalink)}
{if !!(blogDetail.nextBlogPermalink)}
{list a as x}
{if defined('newslist')&&newslist.length>0}
{list newslist as x}
{if x_index>7}{break}{/if}
{list a as x}
{var first_option =}
{list x.voteDetailList as voteToOption}
{if voteToOption==1}
{if first_option==false},{/if}&&“${b[voteToOption_index]}”&&
{if (x.role!="-1") },“我是${c[x.role]}”&&{/if}
&&&&&&&&${fn1(x.voteTime)}
{if x.userName==''}{/if}
网易公司版权所有&&
{list x.l as y}
{if defined('wl')}
{list wl as x}{/list}[请教]是包涵体直接纯化效果好还是复性以后纯化效果好? - 实验交流 - 生物秀
标题: [请教]是包涵体直接纯化效果好还是复性以后纯化效果好?
摘要: [[请教]是包涵体直接纯化效果好还是复性以后纯化效果好?] 我表达的蛋白是包涵体,最后要免疫用的,也要做活性实验,不知道是包涵体直接纯化再复性呢还是复性以后再纯化 如果复性以后纯化,要两次透析呀(免疫兔子之前还要把咪矬透析掉) 还有如何在柱上直接复性呢?高手指教呀 关键词:[纯化 复性 包涵体 透析 蛋白]……
我表达的蛋白是包涵体,最后要免疫用的,也要做活性实验,不知道是包涵体直接纯化再复性呢还是复性以后再纯化.如果复性以后纯化,要两次透析呀(免疫兔子之前还要把咪矬透析掉).还有如何在柱上直接复性呢?高手指教呀
如果带his标签,可以做柱上复性,既纯化又复性.柱上复性可以搜索中以前的帖子.
我找不到呀,你可以告诉我怎么找吗
如果杂蛋白会影响复性效率，那就必须先纯化，在复性；如果不影响，那就要具体问题具体分析。换buffer使用UF或脱盐柱很好操作，收率也比较高，不用太担心。当然能同时纯化复性更好，可以先试试。要使效果不理想，可以用透析或稀释复性。
chromatography,能不能帮我找一下关于柱上复性的帖子呀,我找不到呀,着急中.
建议您利用包涵体的优势可以用简单的步骤先做一定的纯化，以达到较高纯度后再复性。如果过程反过来，可能会在后面除掉杂质的过程中对已复性成功的蛋白产生些不利的影响。
对，同意楼上的说法，不管用什么方法，包含体的清洗都是必要的，大多数时候也是有效的。
柱上复性是不是用不同浓度的UREA缓冲液洗柱使其复性,请问都设什么浓度的呢?8,6.4.2.下面还要更低的浓度吗?我真的不知道柱上复性是怎么弄的,给点意见呀
可以慢一点降，最好作线性梯度缓慢降低，Urea从8M 降到1M 差不多了，可以加5~10mM 的还原剂 2-ME。复性完后，还是用咪唑竞争洗脱，可以做step wise的洗脱优化。
step wise的洗脱优化。 是什么意思,?还有洗脱液的pH大约是多少呢?还是7.3吗
竞争洗脱用0~500mM咪唑分阶段洗脱（stepwise），比如先用50，然后100，...， 500mM , 跑电泳看那个浓度能洗下来，那个组分纯度高。pH维持不变就可以了，降pH不如竞争洗脱好操作，不过有时会有好的结果。如果你的复性过程中需要更高还原剂的浓度梯度和更宽的pH梯度，可能镍柱复性就不大好做了，具体情况具体分析。
那是说用洗脱天然状态蛋白的Washing buffer在里面溶解不同浓度的Urea 就可以了吗?
复性的时候不能洗脱，柱上复性一般有三种buffer1，变性的binding buffer (含8M Urea，低浓度的咪唑， 一般50mM )2，refolding buffer (1M Urea或更低，咪唑与binding buffer 同)3, elution buffer (1M Urea或更低，300~500mM咪唑)镍柱复性一般三个过程，首先，先结合到填料上, 然后用binding buffer 洗掉不能结合的杂质；然后，在binding buffer 和refolding buffer间做很缓慢的线性梯度，逐渐将柱内Urea浓度降低，在此过程中，蛋白在柱上开始复性；然后由refolding buffer 和elution buffer 之间进行梯度洗脱，这步也可以stepwise阶段洗，就是提前配好一系列咪唑浓度的elution buffer。但是复性过程中，必须保证蛋白不被洗脱，所以复性条件可能还是受些限制。其他的保护剂你看文献吧，只要不影响结合，应该都可以加些。
首先，先结合到填料上, 然后用binding buffer 洗掉不能结合的杂质你说的binding buffer 应该是变性的binding buffer 吧?还有复性的时候一般缓冲液有要求在柱子上停留多长时间吗?
是变性的阿一般是要求蛋白的环境缓慢的由变性（8M）降到非变性，这样给蛋白质足够的时间来重折叠，太快的话，来不及折叠，变性剂降低后，蛋白就还是聚集的状态，而没有形成应有的结构，复性效率会很低。你看看色谱兄的那篇综述，讲得很清楚了，建议你看点中文的复性方面的基本资料，再查些文献，先看看每篇文献的introduction部分，这样对概念现有个了解，再设计实验，考虑方案。
谢谢我今天要试一下,我的情况很有趣,上清也有一点,我纯化了以后,量不是很大,这样用来浓缩以后做活性可以吗?我用包涵体纯化以后是打算制抗体用的,我同学是建议我复性以后再纯化,我觉得那样要两次透析实在太麻烦了,所以想试试柱上直接复性,这样只要透析一次,而且可以拿到较纯的蛋白的,
怎么办?我在复性的过程中发现,NI-NTA好象结块了,是不是说明复性不成功呀?我把介质吹打了几下,好象介质又散开了,这到底是怎么回事?
biosepq,我柱上复性的效果还不错了,只是用到最低的UREA浓度时,介质有点凝集,不过用枪头吹打以后可以还原.我洗下来的蛋白还是有一些沉淀,不过离心以后,上清跑电泳,还是两比较大,而且很纯,谢谢知道.
相关热词：
生物秀是目前国内最具影响力的生物医药门户网站之一，致力于IT技术和BT的跨界融合以及生物医药领域前沿技术和成功商业模式的传播。为生物医药领域研究人员和企业提供最具价值的行业资讯、专业技术、学术交流平台、会议会展、电子商务和求职招聘等一站式服务。
官方微信号：shengwuxiu
电话：021-简析包涵体纯化处理要点--《现代农业科学》2009年05期
简析包涵体纯化处理要点
【摘要】：包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集,形成无活性的固体颗粒。对于从事生化研究的科研工作者而言,包涵体的纯化是一个十分重要和棘手的问题,结合笔者的实践经验,简述了包涵体的纯化中需要注意的问题。
【作者单位】：
【关键词】：
【分类号】：Q93【正文快照】：
1菌体的裂解常用的细胞的破碎方法有:高速组织捣碎、玻璃匀浆器匀浆、超声波处理法、反复冻融法以及化学处理法。这些方法都会破碎组织细胞,使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中,大分子生物降解。个人的经验是:如果裂解细菌是为了提取蛋白的话,而且蛋白的分子量又小于20 k
欢迎：、、)
支持CAJ、PDF文件格式，仅支持PDF格式
【相似文献】
中国期刊全文数据库
梁名奕;[J];微生物学免疫学进展;1980年03期
刘庚起,龚新昌,朱既明,任贵方,范瑞莲,阮薇琴;[J];中国科学A辑;1980年03期
沈思祥,李其樑,严佩芳,周兵,叶盛钰,吕幼仪,王德宝;[J];中国科学A辑;1980年08期
长泽宽道,郭郛,钟香臣,夏邦颖,王宗舜,仇序佳,魏定义,陈娥英,王敬泽,铃木昭宪,矶贝彰,堀康宏,田村三郎,石崎宏矩;[J];中国科学A辑;1980年08期
鲁子贤,虞荣华;[J];中国科学A辑;1980年10期
;[J];微生物学通报;1980年04期
钱澄怀,韩云亮,傅娟芳,唐佩珠;[J];微生物学通报;1980年04期
刘增印,张其玖,王贵海,张兰芳,张玉英,刘芳,王文芳,刘春平;[J];Acta Biochimica et Biophysica S1980年02期
王精豹;[J];水生生物学报;1980年01期
金以丰,徐贤秀,汤国枝;[J];生物化学与生物物理进展;1980年02期
中国重要会议论文全文数据库
潘李珍;樊玉珍;李根;;[A];中国细胞生物学学会第五次会议论文摘要汇编[C];1992年
敖枝平;马又娥;王大新;;[A];中国化工学会农药专业委员会第八届年会论文集[C];1996年
李平阳;王江成;谭润初;李永龙;贺奇才;黄耀熊;;[A];中国生物医学工程学会医学物理分会第十次学术年会、中华医学会医学工程学分会第一次医疗设备科学管理研讨会论文集[C];1998年
王郡甫;张建华;张捷;冯进波;孙内;许晓群;田志刚;;[A];第八届全国中西医结合肿瘤学术会议论文集[C];2000年
季平;张国英;沈卫德;何家禄;;[A];中国蚕学会养蚕与蚕生理病理学术讨论会论文汇编[C];2000年
覃晓春;李永丹;赵朝阳;王丽英;;[A];走向21世纪的中国昆虫学——中国昆虫学会2000年学术年会论文集[C];2000年
李国勋;郭巍;李长友;宋福平;王平;RobertR;G;[A];走向21世纪的中国昆虫学——中国昆虫学会2000年学术年会论文集[C];2000年
肖履中;徐健;白志庆;程勇平;刘水峰;潘建宁;;[A];中国畜牧兽医学会禽病学会分会第十次学术研讨会论文集[C];2000年
李肇增;闫红霞;金山;乌尼;郝永清;其不格;焦团梅;;[A];中国畜牧兽医学会禽病学会分会第十次学术研讨会论文集[C];2000年
吴秀玲;王群姬;朱启建;方周溪;;[A];2000全国肿瘤学术大会论文集[C];2000年
中国重要报纸全文数据库
晓荷;[N];中国建材报;2000年
;[N];中国质量报;2000年
嵇晓雄;[N];消费日报;2001年
首都医科大学宣武医院神经内科
北京老年病医疗研究中心
陈彪;[N];中国医学论坛报;2001年
连云港出入境检验检疫局
朱其太;[N];中国畜牧报;2002年
;[N];河北科技报;2002年
凌霄;[N];中国医学论坛报;2002年
;[N];健康报;2003年
;[N];中华工商时报;2003年
张景宇;[N];中国高新技术产业导报;2004年
中国博士学位论文全文数据库
顾申;[D];第二军医大学;2001年
江红;[D];第四军医大学;2001年
刘伯华;[D];中国人民解放军军需大学;2002年
王勇;[D];南京医科大学;2002年
高永贵;[D];浙江大学;2002年
潘韵;[D];浙江大学;2003年
王凤龙;[D];内蒙古农业大学;2003年
徐进平;[D];华中农业大学;2003年
张平;[D];四川大学;2003年
麻莉;[D];第三军医大学;2003年
中国硕士学位论文全文数据库
屈延;[D];第四军医大学;2000年
赵满达;[D];内蒙古农业大学;2001年
应琦华;[D];南京农业大学;2001年
胡细连;[D];广西医科大学;2001年
苏建新;[D];第一军医大学;2001年
刘真喜;[D];第一军医大学;2001年
秦卫松;[D];第二军医大学;2001年
应智伟;[D];第一军医大学;2001年
李翔;[D];西北大学;2002年
范京惠;[D];河北农业大学;2002年
&快捷付款方式
&订购知网充值卡
400-819-9993
《中国学术期刊（光盘版）》电子杂志社有限公司
同方知网数字出版技术股份有限公司
地址：北京清华大学 84-48信箱 知识超市公司
出版物经营许可证 新出发京批字第直0595号
订购热线：400-819-82499
服务热线：010--
在线咨询：
传真：010-
京公网安备75号如果知道蛋白序列，可以设计标签，变复性有难度，我就没成功过
也可以做，我之前包涵体复性达到百分之100，不带标签的
也可以做，我之前包涵体复性达到百分之100，不带标签的
无标签的难纯化，而且同是包涵体的话结合分子筛离子柱，都无标签了无法亲和纯化，不过即使是得到蛋白活性也没有保证，可以用&a href=&///?target=http%3A///protein-service-mammalian-cell.html& class=& wrap external& target=&_blank& rel=&nofollow noreferrer&&真核表达&i class=&icon-external&&&/i&&/a&得到一点蛋白在纯化
无标签的难纯化，而且同是包涵体的话结合分子筛离子柱，都无标签了无法亲和纯化，不过即使是得到蛋白活性也没有保证，可以用得到一点蛋白在纯化
已有帐号？
无法登录？
社交帐号登录
protein crystal}