PEI介导siRNA分子体内外基因沉默VEGFR2表达的研究--《南方医科大学》2010年硕士论文
PEI介导siRNA分子体内外基因沉默VEGFR2表达的研究
【摘要】：
RNA干扰(RNA interference,RNAi)又称基因沉默,是生物体内的一种自然现象,其机理为：外源性或内源性的长双链RNA被核苷酶Dicer切割降解为21-23个核苷的小分子干扰RNA (siRNA)双链,该siRNA分子被嵌合进含有核苷酶的多蛋白复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)中,被其中的RNA解螺旋酶解开双链后的正义链随后降解,由此激活的RISC复合体由该siRNA的反义链介导,靶向与该反义链序列互补的mRNA,并形成新的长双链RNA,然后又被Dicer酶降解为新的siRNA片段,靶mRNA即被降解或沉默,得到的siRNA进入新一轮基因沉默循环。siRNA分子的基因沉默功能相对于同为核酸类分子的反义核酸和核酶(ribozymes),特异性及沉默效应更强且无免疫原性。因此,国内外许多研究机构迅速采用了siRNA分子技术来进行疾病治疗的研究,任何与疾病有关的表达基因都是潜在的靶标。
血管内皮细胞生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor-2, VEGFR2)是一种酪氨酸激酶受体,由一个胞外结构域,一个跨膜结构域和一个胞内酪氨酸激酶结构域组成,其与VEGF的信号通路在血管的形成过程中起重要作用。因此设计针对VEGFR2基因的siRNA分子来沉默其表达以阻断VEGF/VEGFR2信号通路能够抑制肿瘤新生血管的形成,从而具有治疗肿瘤的应用前景。但是作为RNAi效应分子的siRNA分子具有核酸和小分子化合物的双重特性,当其作为基因类药物在生物体内应用发挥疾病治疗作用时,容易被核酸酶降解,具有稳定性差、半衰期短、细胞内转染效率低和靶向性差等缺点,因此,应用siRNA分子的关键是如何有效地使其到达靶细胞并穿过细胞膜,进入细胞质中的RNAi通路。目前siRNA分子给药多借助载体,但存在靶向性差,安全性不明确和体内细胞转染效率低等问题：病毒载体基因转染率高,但具有潜在的致癌性和免疫原性；阳离子脂质体具有较大的细胞毒性和不稳定性；阳离子聚合物由于具有较低的免疫原性和细胞毒性,而备受研究者的青睐。目前常用的是阳离子聚合物聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine, PEI),其带正电荷的氨基基团与核酸带负电荷的磷酸基团通过静电吸附作用而发生电性中和,形成稳定的纳米-核酸复合物,表面电荷呈中性或弱阳性,与表面带负电荷的细胞膜相互作用而进入细胞内,具有较高的靶向性和转染效率。
为了探索siRNA分子经组织靶向性结构修饰后给药的可行性,本文以未修饰的PEI为载体包裹抗小鼠VEGFR2表达的siRNA分子(siVEGFR2),研究了其细胞特异性靶基因沉默效应,并在生物体内比较了瘤内和静脉注射两种不同给药途径对其介导的基因沉默效应以及抗肿瘤生长作用的影响,为下一步siVEGFR2分子经组织靶向性结构修饰的优化给药系统应用于临床治疗肿瘤提供了理论和实验基础。
1.研究PEI作为siRNA分子体内外给药载体的可行性。
2.比较瘤内和系统两种给药途径对PEI介导siVEGFR2抑制肿瘤生长作用的影响。
1.制备siRNA/PEI以及siRNA/Lipofectamine2000复合物分别转染MS1细胞,同时以单纯只加空载体PEI作对照。用共聚焦显微镜观察PEI/Lipofectamine2000介导的siRNA在细胞内的亚分布。
2.制备siVEGFR2/PEI以及siVEGFR2/Lipofectamine2000复合物分别转染MS1细胞,同时以单纯只加空载体PEI作为空白对照组和PEI转染不针对任何靶基因的对照siRNA作为阴性对照转染组。分别通过半定量RT-PCR(semi-quantitative RT-PCR)和Western blot方法考察siVEGFR2分子转染MS1细胞后对VEGFR2基因的RNAi效应。采用one-way ANOVA统计方法比较转染各组细胞VEGFR2 mRNA和蛋白表达水平是否有显著性差异。
3.皮下接种一定数量的A549肺癌细胞建立裸鼠皮下肿瘤模型,等到肿瘤可触摸时用游标卡尺定期测量肿瘤体积。肿瘤体积的计算公式为1／2×a×b2,其中a代表长直径,b代表短直径。当肿瘤体积达到60-70mm3时,分别肿瘤内局部给予saline,随即对照siRNA/PEI, siVEGFR2/Lipofectamine2000和siVEGFR2/PEI,以及静脉内给予siVEGFR2/PEI。每3天给药1次,连续给药5次,每次给药前测得肿瘤体积以及荷瘤鼠的体重。应用单因素重复测量方差分析比较给药各组肿瘤体积和荷瘤鼠体重是否有显著性差异。
4.给药结束后处死动物取出肿瘤组织,分别通过半定量RT-PCR (semi-quantitative RT-PCR)和Western blot方法检测给药各组裸鼠肿瘤组织中VEGFR2 mRNA和蛋白的表达水平考察siVEGFR2分子的体内基因沉默效应。采用one-way ANOVA统计方法比较给药各组裸鼠肿瘤组织中VEGFR2 mRNA和蛋白表达水平是否有显著性差异。
5.用抗CD31抗体进行免疫组织化学染色肿瘤组织切片,观察各组肿瘤组织中的血管分布。
6.用Bio-Plex悬浮芯片系统检测各组裸鼠血清中细胞因子含量。采用one-way ANOVA统计方法比较给药各组裸鼠血清中细胞因子的含量是否有显著性差异。结果：
1.通过共聚焦显微镜观察,PEI转染的siRNA分子主要分布到细胞质；Lipofectamine2000能同时将siRNA分子转导进入细胞质和细胞核内。
2.PEI和Lipofectamine2000/siVEGFR2复合物体外转染的MS1细胞,进行RT-PCR实验。灰度扫描各组条带,以β-actin为内参,以VEGFR2/β-actin条带灰度比值作为VEGFR2 mRNA的相对表达量。采用单向方差分析(one-way ANOVA)方法比较转染各组VEGFR2 mRNA表达水平具有显著性差异(F=58.345,P=0.000)。再用LSD法进行多重比较,统计结果表明,与空白转染组相比,Lipofectamine2000转染组和PEI转染组细胞中VEGFR2 mRNA表达水平均显著下降(P=0.000),而空白转染组和对照转染组两组之间比较无显著性差异(P=0.579),说明靶向VEGFR2基因的siRNA分子能够有效沉默目的基因的表达。Lipofectamine2000转染组与PEI转染组VEGFR2 mRNA表达无统计学差异(P=0.368),说明PEI与Lipofectamine2000有相近的siRNA分子细胞转染效率
3.PEI和Lipofectamine2000/siVEGFR2复合物体外转染的MS1细胞,进行Western blot实验。灰度扫描各组条带,以GAPDH为内参,以VEGFR2/GAPDH条带灰度比值作为VEGFR2蛋白的相对表达量。采用单向方差分析(one-way ANOVA)方法比较转染各组VEGFR2蛋白表达水平具有显著性差异(F1=22.191,P=0.000)。再用LSD法进行多重比较,统计结果表明,与空白转染组相比,Lipofectamine2000转染组和PEI转染组细胞中VEGFR2蛋白表达水平均显著下降(P=0.000),而空白转染组和对照转染组两组之间比较无显著性差异(P=0.476),说明靶向VEGFR2基因的siRNA分子能够有效沉默目的基因的表达。Lipofectamine2000转染组与PEI转染组VEGFR2蛋白表达无统计学差异(P=0.763),进一步从蛋白水平说明PEI与Lipofectamine2000有相近的siRNA分子细胞转染效率。
4.皮下接种A549细胞建立裸鼠皮下肿瘤模型,定期测量各给药组裸鼠皮下肿瘤体积和荷瘤鼠体重,采用重复测量方差分析方法比较各组肿瘤体积和荷瘤鼠体重变化(见表2-1和表2-2),不同给药组间荷瘤鼠体重没有显著性差异(F=0.801,P=0.539)；不同给药组间肿瘤体积有显著性差异(F=23.559,P=0.000)。多重比较分析：与saline组相比,siRNA/PEI组和siVEGFR2/PEI(v)组肿瘤体积无统计学意义(P值分别为0.202和0.055),siVEGFR2/Lipofectamine2000组和siVEGFR2/PEI瘤内给药组均有统计学差异(P=0.000),而它们两组之间也无统计学差异(P=0.907)。
5.最后一次给药后两天,处死动物取出肿瘤组织,提取总RNA,进行RT-PCR实验。灰度扫描各组条带,采用单向方差分析(one-way ANOVA)方法比较给药各组裸鼠肿瘤组织之间VEGFR2 mRNA表达水平具有显著性差异(F=40.090,P=0.000)。再用LSD法进行多重比较,统计结果表明：与saline相比,siVEGFR2/Lipofectamine2000和siVEGFR2/PEI组肿瘤组织中VEGFR2 mRNA表达水平均显著下降(P=0.000),而与scrambled siRNA/PEI组或siVEGFR2/PEI(v)组比较无显著性差异(P=0.185,P=0.171),说明瘤内给予的PEI能介导siVEGFR2进入肿瘤细胞产生基因沉默作用,而siVEGFR2/Lipofectamine2000与siVEGFR2/PEI组间VEGFR2 mRNA表达无统计学差异(P=0.731)。
6.最后一次给药后两天,处死动物取出肿瘤组织,提取总蛋白,进行Western blot实验。灰度扫描各组条带,采用单向方差分析(one-way ANOVA)方法比较给药各组裸鼠肿瘤组织之间VEGFR2蛋白表达水平具有显著性差异(F=23.572,P=0.000)。用LSD方法进行组间多重比较：与saline相比,siVEGFR2/Lipofectamine2000和siVEGFR2/PEI组肿瘤组织中VEGFR2蛋白表达水平均显著下降(P=0.000),而与scrambled siRNA/PEI组或siVEGFR2/PEI(v)组比较无显著性差异(P=0.323,P=0.260),说明瘤内给予的PEI能介导siVEGFR2进入肿瘤细胞产生基因沉默作用。siVEGFR2/Lipofectamine2000与siVEGFR2/PEI组间VEGFR2 mRNA表达无统计学差异(P=0.907)
7.切片肿瘤组织,CD31抗体染色肿瘤微血管进行免疫组织化学实验。结果瘤内给予siVEGFR2/Lipofectamine2000和siVEGFR2/PEI的肿瘤组织中微血管数量明显少于其他各给药组。
8.最后一次给药后2天处死动物,采取给药各组裸鼠血清,采用Bio-Plex悬浮芯片系统检测裸鼠血清中细胞因子的含量。结果各组裸鼠的IL-10,1I-4和IL-1β三种细胞因子含量有统计学差异。多重比较分析,其中saline组与siVEGFR2/PEI(v)的IL-10含量有显著性差异(P=0.021),saline组与siRNA/PEI组的IL-4含量有显著性差异(P=0.024),saline组与siVEGFR2/PEI组间IL-1β细胞因子的含量有统计学差异(P=0.015)。而其他各给药组的各细胞因子含量比较的P值均大于0.05。
1.PEI和Lipofectamine2000都能将siRNA分子转染进入细胞胞浆的核周区域,从而使siRNA分子进入RNAi通路产生RNAi作用。
2.体外转染siVEGFR2至MS1细胞,能特异性沉默VEGFR2 mRNA和蛋白的表达。
3.肿瘤内给予siVEGFR2/PEI的抗肿瘤生长作用、特异性基因沉默作用以及抑制微血管生长的作用均优于静脉给药途径,说明未经组织靶向性修饰的PEI不具有肿瘤靶向性,为进一步研究优化该给药系统提供了基础。
4.给药各组裸鼠血清中细胞因子的含量检测结果和给药各组荷瘤鼠体重变化没有显著差异说明siVEGFR2/PEI的抗肿瘤效应基本上是由RNAi作用介导的,与siRNA分子的免疫刺激作用关系不大。
5.肿瘤内给予的siVEGFR2分子通过沉默VEGFR2基因的表达,阻断VEGF/VEGFR2信号通路传导,进而阻断VEGF的血管营养作用来抑制肿瘤新生血管生成从而达到抑制肿瘤生长的作用。
6.本实验制备的PEI作为siRNA分子体内外给药载体是可行的。
【关键词】：
【学位授予单位】：南方医科大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2010【分类号】：R73-3【目录】：
ABSTRACT9-17
第一章 体外研究PEI介导的siVEGFR2基因沉默效应21-40
1、引言21-22
2、材料与方法22-33
3、结果33-38
4、讨论38-39
5、小结39-40
第二章 体内研究PEI介导的siVEGFR2抗肿瘤生长效应40-61
1、引言40-41
2、材料和方法41-46
3、结果46-58
4、讨论58-60
5、小结60-61
全文总结61-62
参考文献62-66
攻读学位期间成果78-79
附录 中英文缩略词表79-80
统计学证明82-83
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FU Yingjie
YANG Zhenyu
作者单位：
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