菌液菌落pcr用自己的引物老是没有目的条带.但是通用引物有条带p出来,这说明我的片段插入了么?
Kyoya迪ZQ0
可能是你设计的引物质量不高,建议做个阳性对照通用引物扩的区域包括你的插入片段么?如果包括,看大小是否符合.提的质粒做下酶切反应也能知道是否成功插入.祝实验顺利
通用引物的pcr大小基本上是符合的，在抗性平板上能长菌，但质粒提不出来。十分感谢~！实验老是停驻不前，真焦急啊~anyway，谢谢你的回答。
建议用通用PCR的时候做个阴性对照，用自连的空载体做为模板。
另外提质粒做酶切，选择插入片段上的uniqu酶切位点（即载体上没有的）做酶切也可以。
记得设置对照
如果还是怀疑，就把经过这2步验证后的潜在的阳性菌送去测序。反正现在测序也不贵
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p出来片段多大呀？ 通用引物可以把空载体也p出来呀。要是片段大小不对，说明还是没有插入片段如果产物大小对了，就送测看看
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普通PCR产物琼脂糖凝胶电泳，出现一堆模糊条带，是引物的问题吗？
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简介：上图是1%的胶，100V,跑了25分钟，下图是同一块胶，又继续跑了10分钟。图中，中间为100bp DNA ladder,上6下6分别为一个基因的2对引物。备注：cDNA模板应该没有问题，跑了其他基因的，有单一清晰明亮的条带出现。退火温度目前用的是公司推荐的，还没有进行梯度摸索。疑问: 跑到最前面的模糊的是引物二聚体吗？那上6中最后面几条比较亮的的是什么？下6中就没有明亮条带，是不是可以认为引物特异性不行？我还需要调整退火温度再试试吗？
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把引物在NCBI上做一个primer-blast。你的这个看上去像是非特异性扩增，感觉没必要去摸索退火温度什么的
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非特异性条带太多了
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这是我根据公司设计的2个引物经过 NCBI Blast出来的结果 ，目的基因是我的基因，退火温度比公司引物报告单上的高，引物2产物长度有两种，其他内容如何解释呢？烦请高人指点，谢谢！
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我觉得是引物的特异性不好，出现了很多非特异性扩增的条带，此外引物之间可能形成了二聚体
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NCBI blast出来的结果只是个理论上的参考，还要根据最终的结果来判断，如果一直不好p，建议别再用反转录的cDNA作为模板了，管其他实验室要一下质粒
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好的，现在初步打算换引物再试试，谢谢各位指点
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引物二聚体的条带太明显，可以考虑换引物
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大神们，这次是新的引物，左边的是产物是127bp，右边的是300的，仍然是100bp 的 ladder，100V 30min。从上至下温度从49至61℃,12个温度的梯度。左边的又跪了，右边的貌似可以调整试试看，是模板浓度太高了吗？还请大家多多指教，感激不尽！
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【原创】PCR时，不加样本只加引物和mix就能扩增出来目的条带，原因何在
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最近鉴定一批突变子小鼠，引物根据neo-site位点设计，扩增目的条带660bp,试验中发现：只要加引物和mix就能扩增出目的条带，无需样本DNA,因此对我鉴定工作带来极大困扰，已经更换mix,从新从不同公司合成了引物，结果仍无济于事，敢问高人，原因何在？污染源何在？如何解决？望高人指点。
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实验室污染了。就是PCR产物到了空气中。理论上PCR加样的地方与扩增及跑电泳的地方越远越好。处理办法是：停止在本实验室做此PCR扩增一周；实验室通风，最好用紫外光照一照；重新合成引物，到别的实验室做实验，所有的东西都借别的，包括枪、枪头、水、mix等。一周回本实验室做实验，以前的东西都丢了。
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好的，可以先试试，不过我们也是刚换的实验室，还有就是就是空气污染，也不至于这样啊。现在太纠结了，，，
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正常，在公安系统中，两个区是有正压和负压区分的。在Illumina公司的相关系统中，进过扩增室的人当天是不许进提取纯化室的。防不胜防的！
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楼上的回复讲的很正确污染是实验室操作不规范导致的，扩增管打开后，扩增产物会形成气溶胶，导致实验室污染临床基因检测实验室都是严格分区，控制气压，各区的加样枪等都不可混用科研实验室根本无法做到这样，所有假阳性很正常实验室污染了只能换实验室彻底消除污染当然你可以换引物，重新设计的引物必须要位于原来引物的两侧才可以
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实验室做到这点太难了，，现在问题还未解决，正在想办法
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楼主您好，我也出现了相同问题，请问现在解决了吗？
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【求助】RT-PCR结果电泳条带不在我的引物位置？
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这个帖子发布于2年零325天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
问题已解决悬赏丁当:2
七月份在生工设计的（让他们设计的）引物gcc ctg ttt tct tgg tgt att c (5' to 3')
agt gtc ttt tgg gaa ggt gag a (5' to 3')现在终于看待亮的条带了，，，结果不在205bp的位置？？？求解啊，，，，2.5
1ul分别是加引物的量。。marker是100-600的
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赤脚草医 edited on
条带位置很小，像引物二聚体。可以做一个不加模板的pcr反应来确认。基本可以认为产物没有扩增出来。是人的MSX2？序列本身没问题，可能循环数不够，或者你的模板丰度低，所以没扩出来
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看到的条带应该是引物二聚体，另外在100bp略朝上的区域注意到有非特异的产物。原因应该是模板量过低或引物设计有问题，我比对过该对引物在人基因组中的匹配情况，如果是扩增人的基因话，应该是针对MSX2的，但是第一条引物的倒数第3个碱基不正确，应该是A而不是T。另外第二条引物的设计本身也导致容易产生hairpin、dimer（self）和cross dimer。建议重新设计引物。
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reyesa 条带位置很小，像引物二聚体。可以做一个不加模板的pcr反应来确认。基本可以认为产物没有扩增出来。是人的MSX2？序列本身没问题，可能循环数不够，或者你的模板丰度低，所以没扩出来版主
帮我看看吧，，，谢谢了，，，1是没加引物的，2 是2ul引物2ulcDNA，，3是2ul引物4ul cDNA，，，，哎结果还是在小于100的地方
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赤脚草医 456是RNA这不是很明显吗，不加引物这条带就没有。其实更严谨的是不加模板，只加引物而不是不加引物只加模板。你的RNA有些许降解，但应该也能用。其他意见见2楼。
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reyesa 这不是很明显吗，不加引物这条带就没有。其实更严谨的是不加模板，只加引物而不是不加引物只加模板。你的RNA有些许降解，但应该也能用。其他意见见2楼。有道理 谢谢版主
谢谢丁香园。。。。正在验证，，，不过3楼战友的意见说引物有一个碱基错了，，其实BLAST结果的确是，，，，，，之前问生工的技术他们也说有点问题，后来又来了一句让我做做看。。。。。哎 ，现在放假，希望不是引物问题，是的话也换不了了，，只能等到节后
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reyesa 这不是很明显吗，不加引物这条带就没有。其实更严谨的是不加模板，只加引物而不是不加引物只加模板。你的RNA有些许降解，但应该也能用。其他意见见2楼。版主 我又来了，，，跑来只加引物不加模板，，结果什么都没有呢？这证明引物有问题吗？》还是？
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reyesa 条带位置很小，像引物二聚体。可以做一个不加模板的pcr反应来确认。基本可以认为产物没有扩增出来。是人的MSX2？序列本身没问题，可能循环数不够，或者你的模板丰度低，所以没扩出来版主 能否给我个发站内信息的权限，为什么我每天只能发3个信息
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赤脚草医 版主 能否给我个发站内信息的权限，为什么我每天只能发3个信息这个好像无力帮你。。
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关于丁香园PCR跑出非特异条带?怎么办?1楼做PCR的时候加了水为模板,做为阴性对照.可是居然跑出了跟目的条带大小一样的条带,只是淡了一些.目的片段大小就100bp左右.可能是什么原因呢?做PCR的水要求高吗?需要每次重灭吗?
DFGHHS3959
可能是水污染了,另外还有你操作及操作环境的原因.建议ddH2O灭菌后分装到2ml离心管放入-20°备用,每次用一管如果容易污染的话,建议你到超净台中操作PCR过程
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其实很简单，把你一切怀疑的因素再做一对照就行了，比如把你怀疑污染的水和你认为绝对干净的水做两个对照管，在下次pcr时放进去，结论就有了还有，低浓度的胶很难区分100bp以下的条带，那带也有可能是因物二聚体。反正多做几次对照就什么都知道了...
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