重度寻常型银屑病患者外周血CD8~+T淋巴细胞CCR6及上清液中IL-22、IL-17的表达 - 中国期刊全文数据库
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重度寻常型银屑病患者外周血CD8~+T淋巴细胞CCR6及上清液中IL-22、IL-17的表达
【Author】
BAI MLUAN Li;ZHAO Ye;Shenyang No.7 People’s HZhongshan Hospital Affiliated to Dalian UThe second Hospital of Dalian Medical U
【摘要】 目的研究重度寻常型银屑病患者外周血CD8+T细胞表面趋化因子受体CCR6表达及上清液中白细胞介素(IL)-22、IL-17的水平。方法流式细胞仪检测25例重度寻常型银屑病患者外周血中CD8+T淋巴细胞表面趋化因子受体CCR6的表达率,ELISA检测CD8+T细胞培养后上清液中IL-22、IL-17的水平,分别与30例健康对照者进行比较。结果银屑病患者外周血中CD8+T细胞表面CCR6的表达率为(94.76±2.38)%,健康对照组为(72.56±8.33)%,差异有统计学意义(P&0.05);经过anti-CD3单克隆抗体和anti-CD28单克隆抗体刺激后,10例银屑病患者外周血CD8+T细胞上清夜中IL-17、IL-22水平分别为(7.17±1.51)pg/m L、(102.42±15.34)pg/m L,健康对照组分别为为(2.68±1.12)pg/m L、(47.39±5.47)pg/m L,2组比较差异有统计学意义(均P&0.01)。结论银屑病中CCR6可能促进外周血CD8+T细胞趋化至皮损中;银屑病患者外周血CD8+T细胞在活化的状态下可促进炎症细胞因子的表达增加,加重银屑病的炎症反应。
【关键词】 ；
【所属期刊栏目】
（2015年04期）
【分类号】R758.63
【被引频次】2
【下载频次】32
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T淋巴细胞疫苗诱导大鼠移植心&存活时间延长的机制探讨
来源：青年人()&更新时间： 16:41:01 &【字体： 】
【摘要】　目的　探讨T淋巴细胞疫苗(TCV)对大鼠移植心脏存活时间的影响及其机理。方法　取经供者抗原致敏的受者脾细胞（1/3脾切除）制备TCV，然后将其回注于自身腹腔，观察大鼠异位移植心脏的存活时间。结果　接种TCV可明显延长大鼠同种移植心的存活时间；注射TCV后，T淋巴细胞增殖反应增强，B淋巴细胞增殖反应未受影响；混合淋巴细胞反应(MLR)降低；脾细胞及TCV表型分析显示CD8+细胞增多；抗体介导的补体依赖性细胞毒作用无明显变化。结论　TCV接种是一个免疫刺激过程，其所介导的免疫低反应具有抗原特异性，可能与抗独特型反应增强有关；T淋巴细胞疫苗延长移植物存活时间的机制可能与体液因素无关。　　【关键词】　T淋巴细胞；免疫疗法，主动；移植物存活；大鼠；心脏移植
Study on the mechanisms of T cell vaccination-induced survival prolongation of cardiac allograft in rats
YANG Shangqi, XIA Suisheng. （Institute of Organ Transplantation, Tongji Medical University, Wuhan 430030, China）
　　【Abstract】　Objective　To investigate the effect of T cell vaccination (TCV) on the survival time of cardiac allograft in rat. Methods　Rat heterotopic cardiac transplantation was performed. Donor antigen-primed recipients' spleen cells were obtained by 1/3 splenectomy for the preparation of TCV. TCV was then intraperitoneally into the abdominal cavity again. The survival time of cardiac allograft was observed. Results　TCV could markedly prolonged rat cardiac allograft survival. T cell proliferation was increased and B cell proliferation was not affected in the vaccinated rats. The mixed lymphocyte reaction (MLR) was inhibited. The analysis of phenotypes on T cells showed that the number of CD8+ clones in vaccine cells and vaccinated rat spleen cells were increased. The antibody-mediated cytotoxicity was not affected by TCV. Conclusions　TCV enhances the recipients' T cell-mediated immune response. The TCV-induced hyporeactivity to specific donor antigen is related to the induction of anti-idiotypic response and is not associated with humoral mechanisms.　　【Key words】　T-lymphocytes；Immunotherapy，active；Graft survival；Rats；Heart transplantation
　　用灭活的自身反应性T淋巴细胞作为疫苗接种，是近十多年来出现的一种新的自身免疫性疾病防治方法。T淋巴细胞疫苗(TCV)在组织器官移植中的实验研究起步较晚，近几年已有报道，TCV可延长大鼠、小鼠同种移植物的存活期［1-4］。我们以同一个体为疫苗的提供者和接受者，诱导了大鼠同种心脏移植物存活期延长，并证明TCV介导的免疫低反应具有抗原特异性。现就我们的实验结果结合文献探讨如下。
材料与方法
　　一、动物　　Wistar大鼠为心脏移植受者，SD大鼠为供者，均为雄性，体重200～300?g。由同济医科大学实验动物中心供应。　　二、供者抗原对受者的致敏　　采用腹腔注射供鼠脾细胞的方法。SD大鼠行1/3脾切除术，用切取的脾脏制成脾细胞悬液，将5×106个脾细胞注射于Wistar大鼠腹腔，剩余脾细胞用丝裂霉素C（40?mg/L）于37?℃水浴处理30?min，洗3次后置4?℃储存。7?d后再加强免疫1次。供鼠和受鼠对应编号标记。　　三、TCV的制备及接种　　受鼠于首次腹腔注射供者脾细胞后14～16?d，在无菌条件下行1/3脾切除术，将切取的脾脏制成脾细胞悬液，用含10?％小牛血清的RPMI 1640培养液调整细胞浓度为5×109/L，加刀豆蛋白A(Con A)2.5?μg/ml(终浓度)，置含体积分数为5?％ CO2的孵育箱中37?℃培养72?h，收集细胞。以丝裂霉素C处理细胞，用培养液调整细胞数至所需浓度即为TCV 。分别在心脏移植术前14、7?d和术后5?d按每次2×107个细胞给受鼠腹腔注射取材于自身的TCV，若移植心继续存活，则于术后12、19及26?d加强注射。根据处理方法的不同，将受鼠分为4组：第1组不经供者抗原致敏，1/3脾切除后16～18?d行心脏移植，在上述接种时间腹腔注射RPMI 1640培养液；第2组未经供者抗原致敏，1/3脾切除，脾细胞悬液经Con A活化72?h制成疫苗，于上述时间注射；第3组以供者抗原致敏，1/3脾切除，疫苗制备及注射同前述；第4组处理同第3组，其心脏移植供者为无关SD大鼠。　　四、大鼠心脏移植　　采用文献［5］介绍的术式施行大鼠异位（腹腔）心脏移植。手术当天记为0?d，术后每天触诊心脏2次。术后72?h内动物死亡或移植心停搏判为手术失败，其后移植心停搏为排斥反应终点。　　五、脾细胞增殖反应　　Wistar大鼠8只，供者抗原的致敏及TCV的制备方法同前述，疫苗注射3次后，于第7?d切取脾脏，制备脾细胞悬液，用含10?％小牛血清的RPMI 1640培养液调整细胞浓度为5×109/L。未被供者致敏及未接受疫苗注射的大鼠（8只）作为对照组。实验用96孔培养板，每孔细胞数为5×105，Con A和脂多糖(LPS)的终浓度分别为7.5?mg/L和5?mg/L，每组设3复孔。培养72?h，用四唑盐(MTT)比色分析法测定，结果用吸光度（A）及增殖率表示。　　六、混合淋巴细胞反应（MLR）　　Wistar大鼠8只，供者抗原的致敏、疫苗的制备及注射方法同前，制备脾细胞悬液，细胞浓度为1×109/L。同法制备特异性供鼠及无关SD大鼠脾细胞悬液。按文献［6］的方法作混合淋巴细胞培养。检测采用MTT比色分析法，结果用吸光度（A）及刺激指数（SI）表示。　　七、补体依赖性细胞毒试验　　参照文献［6］。细胞毒为试验管死细胞百分率与对照管死细胞百分率之差。　　八、T淋巴细胞表面标记测定　　采用碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶法。　　九、统计学处理：　　各组数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验。
　　一、TCV延长大鼠同种移植心的存活时间　　各组受者移植心的存活时间及比较见表1。
表1　TCV对大鼠移植心脏存活期的影响
移植心存活时间（d）
每只受者的存活时间
9,9,10,11,12,13,15,16
　12.22±2.68
9,9,14,16,18,19
14.43±4.04
14,17,19,33,34,66,67,76
40.75±25.15
12,12,19,20,27,29,32
21.57±8.02
注：第2组与第1组比较，P＞0.05；第3、4组与第1组比较，P＜0.01；第4组与第3组比较，P＜0.05
　　二、注射TCV后脾细胞增殖反应的变化（表2）　　注射TCV 3次后，Con A诱导的T淋巴细胞增殖反应明显增强，LPS诱导的B淋巴细胞增殖反应无明显变化，而脾细胞自身增殖反应明显降低。
表2　注射TCV后脾细胞增殖反应的变化
0.143±0.046
0.204±0.046*
0.159±0.052
0.145±0.046**
0.163±0.055
0.123±0.033△
注：与未注射TCV者比较，*P＜0.01，**P＞0.05，△P＜0.05　　三、MLR结果（表3）　　注射TCV后，Wistar大鼠脾细胞对特异性供者及无关SD大鼠的MLR均降低。在单向MLR中，对特异性供者的反应降低更为明显。自身MLR的结果也降低，但与未注射TCV的结果相比，差异无显著性。
表3　注射TCV后MLR的变化
0.272±0.008
0.191±0.034
　对特异性供者
0.173±0.022*
0.136±0.023*
　对非特异供者
0.166±0.067*
0.159±0.020**△
注：与未注射TCV组比较，*P＜0.01，**P＜0.05；△与对特异性供者组比较，P＜0.05
　　四、补体依赖性细胞毒　　注射和未注射TCV的Wistar大鼠血清在各稀释度对特异性供者及无关SD大鼠脾细胞的毒性作用的差异无显著性。　　五、T淋巴细胞表面标记　　Con A诱导的脾细胞、注射TCV大鼠的脾细胞及TCV本身的CD8+细胞数均明显增多。
　　本实验结果证实，TCV接种后，受鼠对特异性供者和非特异性供者移植心的排斥反应均降低，表现为移植物存活期延长，而特异性供者移植心存活期的延长更为显著，表明TCV诱导的低免疫反应具有抗原特异性和一定的抗原非特异性。　　在自身免疫性疾病的研究中发现，机体免疫系统可通过独特型-抗独特型网络对自身反应性T淋巴细胞进行调控。TCV通过其独特型表位触发独特型调节网络，活化两类T淋巴细胞。第一类T淋巴细胞称为抗独特型T淋巴细胞，识别靶细胞TCR（T淋巴细胞受体）上的独特型表位，对靶细胞的杀伤作用受主要组织相容性复合物(MHC)的限制。第二类T淋巴细胞称为抗活化型T淋巴细胞，对靶细胞的杀伤不受MHC限制［7］。因此，TCV的特异性作用与它诱导抗TCR独特型的免疫应答有关。　　TCV接种后，受者对供者的混合淋巴细胞反应下降，对特异性供者的反应降低更为明显。接种TCV鼠的脾脏活化T淋巴细胞表面标记的测定显示，其CD4+/CD8+值较正常鼠及非接种鼠活化脾细胞明显降低，主要表现为CD8+阳性率的升高。T淋巴细胞表面标记的测定结果还显示，Con A诱导下CD8+细胞克隆数增多，故被抗原致敏的T淋巴细胞经Con A活化后，其CD8+细胞克隆可能参与诱导体内抗独特型反应。　　我们的实验结果还显示，Con A活化的自身脾细胞作为疫苗接种于自体，未能使移植心的存活时间明显延长。自身免疫性疾病的研究结果表明，抗活化型T淋巴细胞介导的对自身免疫病的抵抗作用较弱，持续时间短，不受MHC限制。另外，存在于特异性供者、第三品系或无关非特异性供者间的某些组织相容性抗原决定簇所致的交叉反应，也可引起非特异性低应答状态。这一机制在本实验结果中可能起重要作用，因为作为供者的SD大鼠间肯定存在相同的移植抗原成分。　　本实验结果显示，注射TCV后，Wistar大鼠脾细胞对Con A的增殖反应较未注射组明显增强，机制可能是：⑴TCV注射是一个免疫刺激过程；⑵注射TCV虽使CD8+细胞数增多，提示有抑制性T淋巴细胞的增加，但抑制性T淋巴细胞只抑制独特型T淋巴细胞对特异性靶抗原的反应，独特型T淋巴细胞对非特异性刺激物如Con A的反应不应受到抑制；⑶CD8+细胞本身亦可对Con A的刺激产生增殖反应。实验结果还显示，注射和未注射TCV的受鼠血清对供者及无关大鼠脾细胞的毒性作用无明显差异，LPS诱导的B淋巴细胞增殖反应在TCV注射前后亦无明显改变，提示体液因素在诱导移植物耐受中的作用不明显。对Lewis大鼠的研究结果表明，TCV可诱生与几种同基因型T淋巴细胞起反应的自身抗体，其反应并不局限于针对单一独特型，抗体的成分主要是IgG，认为此乃TCV免疫后体内自然存在的体液网络的反应得到加强［8］。因此，TCV诱导移植物存活延长的机制，仍有待进一步的深入研究。　　在以往的研究中，TCV的制备和接种是在同系动物间进行的，疫苗的提供者和接受者不是同一个体，与临床应用的距离较远。本研究将供者抗原致敏的受者T淋巴细胞进行处理，然后作为疫苗再接种于同一受者，使大鼠移植心脏的存活期明显延长，证明使疫苗的提供者和接受者成为同一个体是可行的。该结果为TCV应用于临床器官移植防治排斥反应提供了实验依据。
作者单位：杨尚琪（430030　武汉，同济医科大学器官移植研究所　现在上海市第一人民医院泌尿外科，邮政编码200080）夏穗生（430030　武汉，同济医科大学器官移植研究所）
1，Shapira OM, Mor E, Reshef T, et al. Prolongation of survival of rat cardiac allografts by T cell vaccination. J Clin Invest,-390.2，Papalois B, Wahoff D, Asheim T, et al. T-cell vaccination prolongs heart but not islet allograft survival in rats. Transplant Proc, 9.3，陈永良，何球藻. T细胞疫苗诱导同种移植物存活延长. 中国免疫学杂志，-44.4，张力，王晶，王小宁. T细胞疫苗抗同种移植排斥反应的研究. 免疫学杂志，-87.5，陈忠华，何藕聪，钟妙英. 改进的大鼠同种异位心脏移植术. 中华器官移植杂志，-40.6，夏穗生主编. 器官移植学. 第1版. 上海:上海科学技术出版社，.7，Zhang J, Raus J. T cell vaccination in autoimmune disease: from laboratory to clinic. Human Immunol,-96.8，Herkel J, Brunner S, Meyer zum Buschenfeld KH, et al. Humoral mechanisms in T cell vaccination: induction and functional charac-terization of anti-lymphocytic autoantibodies. J Autoimmun, -146.
（收稿日期：）
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