木薯类受体胞质激酶基因MeBIK1的分离鉴定--《海南大学》2016年硕士论文
木薯类受体胞质激酶基因MeBIK1的分离鉴定
【摘要】：木薯是热带地区重要的粮食作物,同时也是一种重要的能源作物。由黄单胞杆菌引起的细菌性枯萎病是世界各木薯主产国的检疫性病害,严重影响木薯产量的提高。先天免疫反应(innate immunity)是植物应答病原物的基础抗性,具有广谱性、持久性,是有效开展植物抗病育种的新选择。对木薯先天免疫相关基因的分离鉴定将有助于完善木薯与病原微生物互作理论知识,同时抗性新基因的获得也将为木薯抗病育种提供新的基因资源。本研究根据拟南芥PTI反应途径关键基因AtBIK1(LOC_ At2g39660)的氨基酸序列,对木薯基因组进行同源搜索,候选了木薯类受体蛋白激酶基因并通过表达分析、功能缺失性突变体遗传互补、转基因等途径对该基因的功能进行研究。取得的主要实验结果如下：1. 利用拟南芥已知研究结果,对木薯释放的基因组数据库(www.cassava.org)进行同源搜索,候选了木薯PTI途径类受体蛋白胞质激酶基因,序列分析结果表明,该基因cDNA全长1230 bp,所扩增的基因与已释放序列同源性100%,编码409个氨基酸,含有保守的激酶结构域,鉴于该基因与拟南芥AtBIK1高度同源,命名为MeBIK1.2. 拟南芥原生质体瞬时表达体系亚细胞定位结果表明,MeBIK1基因定位在细胞膜上。3. qRT-PCR结果表明,MeBIK1基因在未受刺激时表达量低,受到鞭毛蛋白flg22刺激后表达量显著提高,并在刺激后1h表达量最高,之后逐渐降低。4. 构建MeBIK1基因双元荧光素酶报告系统,利用拟南芥atbik1突变体开展遗传互补实验,结果表明,MeBIKl基因能恢复拟南芥atbik1突变体中减弱的PTI反应。5. 构建了MeBIKl基因的植物过量表达载体进行拟南芥转基因,经潮霉素多次筛选获得纯合子后进行抗病性测定,结果表明,过表达植株能提高转基因拟南芥对XamHN04(黄单胞杆菌)的抗性,但对PstDC3000的敏感性。6. 采用2,4-D和picloram不同浓度对木薯华南8号进行体细胞胚诱导实验,发现picloram 12 mg/L时体细胞胚的出胚率最高为83.3%。之后用picloram不同浓度分别诱导TMS60444、SC6、SC8、SC124和Arg7 5个木薯品种的体细胞胚、成熟胚以及愈伤组织,结果表明5个品种中TMS60444的出胚率最高达到89.2%,其次是SC8,为83.3%。7. 采用农杆菌介导的遗传转化法转化木薯FEC,设定了农杆菌菌液浓度和浸染时间两个转化条件,经潮霉素筛选后发现菌液浓度OD600=0.4、浸染时间为30 min时FEC的存活率最高。8. 采用gus染色对转基因植株进行检测结果表明,57株再生植株中有48株植株的的茎和叶都被染上蓝色,将染色阳性的植株进行基因组PCR检查,发现有均能扩增出400bp左右的条带,阳性率为84%.10.利用MeBIK1-gfp引物扩增经抗性筛选后4植株叶片基因组DNA,结果有2株扩增出了目的条带,阳性率率为50%。
【关键词】：
【学位授予单位】：海南大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2016【分类号】：Q943.2;S533【目录】：
摘要4-6Abstract6-11第一章 前言11-22 1 木薯生产现状11-12
1.1 木薯栽培现状11
1.2 木薯的经济价值及用途11-12
1.3 病害是制约木薯产业发展的重要因素之一12 2 植物先天免疫反应12-17
2.1 病原物的PAMPs和植物的PRRs13-14
2.2 PAMPs激活的免疫信号通路14-15
2.3 BIKI在植物先天免疫的激活与调控中必不可少15-17 3 木薯的组织培养及遗传转化的研究进展17-20
3.1 木薯的组织培养17-19
3.1.1 分生组织培养18
3.1.2 成熟器官培养18-19
3.1.3 体细胞胚状体培养19
3.2 木薯的遗传转化19-20
3.2.1 农杆菌介导的木薯遗传转化20
3.2.2 基于FEC的转化体系20 4 本研究的目的和研究内容20-21 5 技术路线21-22第二章 木薯类受体激酶基因MEBIK1的分离及在拟南芥中的功能鉴定22-39 1 材料与方法22-29
1.1 试验材料22-24
1.1.1 植物材料22
1.1.2 菌株及载体22
1.1.3 主要试剂22
1.1.4 仪器设备22
1.1.5 原生质体提取及转化所用试剂22-23
1.1.6 培养基23-24
1.2 实验方法24-29
1.2.1 木薯叶片总RNA的提取及反转录24
1.2.2 RT-PCR扩增MeBIK1基因的全长CDs序列24-25
1.2.3 候选基因的诱导表达分析25
1.2.4 载体构建25-26
1.2.5 氯化铯密度梯度离心法大量提取质粒26-27
1.2.6 拟南芥原生质体制备及亚细胞定位分析27-28
1.2.7 拟南芥同源基因缺失突变体的遗传互补28
1.2.8 转基因拟南芥的获得及鉴定28-29
1.2.9 转基因拟南芥植株的抗病性检测29 2 结果与分析29-37
2.1 木薯叶片总RNA提取29
2.2 候选基因MeBIK1编码一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶29-31
2.3 MeBIK1定位在细胞膜上31-32
2.4 MeBIK1基因受Flg22诱导表达32-33
2.5 MeBIK1能恢复拟南芥突变体的PTI反应33-34
2.6 转MeBIK1基因拟南芥的获得及表达检测34-35
2.7 转基因拟南芥抗病表型鉴定35-37 3 讨论37-39
3.1 MeBIK1是一个类受体胞质激酶37-38
3.2 MeBIK1在抗PstDC300和XamHN004中的表型不一致38-39第三章 木薯遗传转化体系的构建及转MEBIK1基因植株的获得39-53 1 材料与方法39-42
1.1 材料39-40
1.1.1 植物材料39
1.1.2 菌株及载体39
1.1.3 药品试剂39
1.1.4 培养基39-40
1.2 方法40-42
1.2.1 木薯无菌苗的获得40
1.2.2 腋芽的诱导培养40
1.2.3 体细胞胚的诱导以及成熟40
1.2.4 不同浓度picloram诱导不同木薯品种体细胞胚的产生40-41
1.2.5 脆性胚性愈伤组织(FEC)的诱导41
1.2.6 植株再生41
1.2.7 报告基因pCAMBIA1301-gus及目的基因MeBIK的转化41
1.2.8 转化后植株的再生41-42
1.2.9 转基因植株的鉴定42 2 结果与分析42-51
2.1 不同浓度2,4-D和picloram对诱导体细胞胚的影响42-44
2.1.1 2,4-D的不同浓度对诱导体细胞胚的影响42-43
2.1.2 picloram的不同浓度对诱导体细胞胚的影响43-44
2.2 五个木薯品种在picloram不同浓度下体细胞胚的诱导情况44-45
2.3 诱导成熟脆性胚性愈伤FEC的最佳picloram浓度的筛选45-46
2.4 农杆菌菌液浓度和侵染时间对木薯FEC存活率的影响46
2.5 转化植株的再生46-48
2.6 转基因木薯植株的鉴定48-51
2.6.1 报告基因的gus染色及PCR检测48-49
2.6.2 目的基因MeBIK1的荧光检测49-50
2.6.3 目的基因MeBIK1的PCR检测50-51 3 讨论51-53
3.1 生长素浓度对木薯体细胞胚产量差异较大51
3.2 转化时间及菌液浓度对FEC存活率有较大影响51-53第四章 结论53-54参考文献54-59附录59-63 附录一59 附录二59 附录三59-61 附录四61-63发表的文章63致谢63
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京公网安备75号苹果变温压差膨化脆片品质评价体系的建立及应用--《中国农业科学院》2012年硕士论文
苹果变温压差膨化脆片品质评价体系的建立及应用
【摘要】：本研究以国家苹果种质资源圃207个品种的苹果为原料，采用变温压差膨化干燥工艺加工苹果脆片，利用层次分析法对苹果脆片品质评价指标进行数据分析，建立了包含基础数据库、指标测定方法、综合评价模型等在内的苹果脆片品质评价体系，旨在为苹果脆片的品质评价及原料品种的加工适宜性研究提供理论依据和指导。
通过对苹果脆片品质评价体系建立的研究，得到以下结论：
（1）从感官品质、理化与营养品质、加工品质三方面提出了14项苹果脆片品质评价指标，分别为色泽、膨化度、酥脆度、硬度、糖酸比、含水率、可溶性固形物、粗蛋白、粗纤维、粗脂肪、维生素C、产出比、复水比以及制品微观结构。同时，根据高效准确等原则，确定了各品质评价指标的测定方法。
（2）综合主成分分析、相关性分析的分析结果，结合感官品质特性、实际应用需求及成本要求，筛选出7项苹果脆片品质评价核心指标，即L、b、产出比、脆度、硬度、糖酸比及膨化度；采用层次分析法建立了苹果脆片品质评价模型，核心指标的权重分别为0.0、0.6、0.6、0.0471。苹果脆片品质评价体系数学模型为：
Y=0.2140×L+0.2140×b+0.2140×产出比+(-0.1036)×脆度+(-0.1036)×硬度+0.1036×糖酸比+0.0471×膨化度。
（3）对15个有代表性的品种苹果脆片进行了感官评价，并根据感官评价结果对数学模型进行了验证。感官评价结果表明：在外观、质地、风味、气味等综合评价条件下，红富士脆片具备最佳的品质，感官综合得分为3.8484，其次为阳光和红露，感官综合得分分别为3.8；品质排名最后的为五月脆片，感官得分为3.0452。模型验证结果表明：数学评价模型（Y）与感官评价（X）之间的关系可以用Y=0.731X+7×10-7表示（R2=0.884），一次项系数接近于1，截距接近于0，表明层次分析法数学模型能够客观合理地反应苹果脆片品质的优劣。
（4）苹果脆片品质与苹果原料的指标相关关系表明，苹果原料中可溶性固形物含量、钾镁含量、果实硬度、果汁褐变率、果肉褐变度等因素显著地影响苹果脆片的品质，为不同品种苹果脆片品质的预测评价与加工脆片专用品种的育种等研究提供理论依据。
【关键词】：
【学位授予单位】：中国农业科学院【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2012【分类号】：TS255.42【目录】：
摘要5-6Abstract6-10第一章 引言10-19 1.1 国内外果蔬脆片加工技术研究现状10-13
1.1.1 变温压差膨化干燥技术10-12
1.1.2 真空油炸干燥技术12
1.1.3 真空冷冻干燥技术12-13
1.1.4 微波干燥膨化技术13 1.2 国内外苹果脆片品质评价研究现状13-17
1.2.1 苹果脆片品质评价研究概况13-14
1.2.2 苹果脆片品质评价指标的选择14-17 1.3 苹果脆片品质评价研究存在的问题及主要研究内容17-19
1.3.1 苹果脆片品质评价研究存在的问题17-18
1.3.2 研究目的、研究意义和研究内容18-19第二章 苹果脆片品质评价数学模型的建立19-39 2.1 苹果脆片品质评价指标测定方法的确定20-22
2.1.1 苹果脆片品质评价指标的确定20
2.1.2 苹果脆片品质评价指标测定方法的确定20-22 2.2 苹果脆片品质评价指标的测定22-27
2.2.1 实验材料22-23
2.2.2 试验设备23-24
2.2.3 试验及测定方法24-27
2.2.4 苹果脆片品质评价指标测定数据27 2.3 苹果脆片品质评价核心指标的筛选27-33
2.3.1 苹果脆片品质评价指标的主成分分析27-30
2.3.2 苹果脆片品质评价指标相关分析30-33 2.4 苹果脆片品质评价数学模型的建立33-38
2.4.1 材料和方法33
2.4.2 结果与分析33-38 2.5 小结38-39第三章 苹果脆片感官评价及品质评价模型的验证39-57 3.1 苹果脆片感官评价标准表的建立及评价员的筛选39-41
3.1.1 建立感官评价指标体系的原则39
3.1.2 苹果脆片感官评价分析表的建立39-40
3.1.3 苹果脆片感官分析评价员的筛选40-41
3.1.4 苹果脆片感官评价样品的准备41 3.2 苹果脆片的感官评价41-52
3.2.1 苹果脆片的感官评价41-45
3.2.2 苹果脆片的感官评价分析调整45-52
3.2.3 苹果脆片感官评价小结52 3.3 苹果脆片品质评价数学模型验证52-56
3.3.1 模型验证的意义52-54
3.3.2 苹果脆片品质评价数学模型验证54-56 3.4 小结56-57第四章 苹果脆片品质评价体系的应用57-61 4.1 苹果脆片品质评价体系的应用57-58 4.2 苹果脆片品质评价指标与苹果原料特性探讨58-60
4.2.1 试验材料和方法58-59
4.2.2 结果与分析59-60 4.3 小结60-61第五章 结论与讨论61-64 5.1 结论61 5.2 讨论61-62
5.2.1 苹果脆片品质评价数学模型的探讨61-62
5.2.2 影响苹果脆片品质的指标特性探讨62 5.3 展望62-64附件64-84参考文献84-89致谢89-90作者简历90
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粮堆的弹性模量和泊松比的试验与计算方法
【摘要】：粮堆为散粒体，当将粮堆简化为连续介质，并采用理论分析或数值模拟方法研究仓内粮食压力分布、仓内粮食对仓壁的压力和摩擦力时，粮堆的弹性模量和泊松比是不可缺少的主要参数。本文通过试验和理论分析相结合的方法，以如何确定小麦粮堆的弹性模量和泊松比进行了研究，主要结论如下：
1、通过压缩试验得到了试样轴向变形随着轴向压缩时间的变化关系，初始时，试样轴向变形量较大，随着轴向压力的增大轴向变形就趋于稳定，在每一级轴向压力下，轴向压力越小趋于稳定需要的时间越短。2、通过压缩试验得到了粮堆的压缩模量，压缩模量随轴向压力而变化，压缩模量随轴向压力增大而增大，当轴向压力达到一定值后，压缩模量又随着轴向压力的增大而减小。轴向压力在12.5-400kPa范围内变化时，压缩模量的变化范围是80.9kPa。
3、通过三轴压缩试验得到了四种围压情况下的弹性模量，围压一定时，弹性模量随着主应力差的增大而减小。当主应力差一样大时，弹性模量随着围压的增大而增大。即围压为50kPa时，弹性模量的范围为337-1793kPa；围压为100kPa时，弹性模量的范围为418-5574kPa；围压为150kPa时，弹性模量的范围为578-6880kPa；围压为200kPa时，弹性模量的范围为kPa。
4、基于弹性力学理论，推导出了三轴压缩试验试样的解析解，根据压缩试样的受力特点，基于解析解提出了求粮食泊松比的计算公式，然后，根据相应的试验数据，采用本文提出的泊松比公式，计算出了四种围压情况下的小麦堆的泊松比，并绘制了四种围压情况下泊松比随轴向压力的关系曲线。
5、由于围压阻止试样产生侧向变形，所以当围压增大时，在相同的轴向压力下侧向变形减小，泊松比也减小。当围压一定时，泊松比随着轴向压力的增大而减小，在轴向压力增大到围压的约1.20倍以后，泊松比不再变化，可以视为一个约为0.2的常数。
【关键词】：
【学位授予单位】：河南工业大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2013【分类号】：S379【目录】：
摘要5-6ABSTRACT6-8目录8-11第一章 绪论11-15 1.1 论文选题的目的和意义11-12 1.2 国内外研究进展12-13
1.2.1 粮食的弹性模量和泊松比12-13
1.2.2 粮食力学特性的研究概况13 1.3 本文主要研究内容13-15第二章 试验简介15-25 2.1 引言15 2.2 压缩试验15-17
2.2.1 压缩试验的目的15-16
2.2.2 试验仪器16
2.2.3 处理实验数据用到的计算公式16-17
2.2.4 试验过程中应该注意的一些问题17 2.3 三轴试验17-24
2.3.1 三轴试验的发展与现状17-18
2.3.2 三轴试验原理18-20
2.3.3 试验仪器20-21
2.3.4 试验方法21-22
2.3.5 三轴试验过程中应注意的问题22-24 2.4 本章小结24-25第三章 压缩试验测定粮堆的压缩模量25-44 3.1 引言25 3.2 材料与仪器25-26
3.2.1 试验材料25
3.2.2 仪器设备25-26 3.3 试验原理26-28 3.4 试验方法28-31
3.4.1 固结仪测定法28
3.4.2 样品制备28-29
3.4.3 荷载大小的确定29-30
3.4.4 测定小麦的比重30
3.4.5 试验目的与试验试样30
3.4.6 固结实验步骤30-31 3.5 试验数据31-33 3.6 实验结果及分析33-40
3.6.1 粮堆的压缩变形与时间的关系33-37
3.6.2 小麦的压缩曲线37-38
3.6.3 压缩模量与轴向压力的关系38-40 3.7 回弹再压缩试验的结果及分析40-42 3.8 试验结论42 3.9 本章小结42-44第四章 三轴试验测定粮堆的弹性模量44-57 4.1 引言44 4.2 材料与仪器44-45
4.2.1 试验材料44
4.2.2 试验仪器44-45 4.3 试验原理45-46 4.4 试验方法46-48
4.4.1 试样尺寸的选择47
4.4.2 试样剪切步骤47-48 4.5 试验结果48-56 4.6 试验结果分析56 4.7 本章小结56-57第五章 泊松比计算公式与小麦的泊松比57-67 5.1 引言57 5.2 泊松比计算公式57-60
5.2.1 微分方程和边界条件57-58
5.2.2 应力分量58-59
5.2.3 泊松比计算公式59-60 5.4 计算结果与分析60-65 5.5 本章小结65-67第六章 结论与展望67-69 6.1 结论67 6.2 展望67-69参考文献69-72感谢72-73个人简历73攻读硕士期间发表或已录用的论文73参加的科研项目73
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