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微生物数量的测定
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&* 快速检测试剂系列 *&(&BB202)&&
&菌落总数快速测试片
产品描述&:
本品可用于各类食品及饮用水中菌落总数的测定，由细菌营养培养基、吸水凝胶和酶显色剂等组成。与传统方法相比，省去了配制培养基、消毒和培养器皿的清洗处理等大量辅助性工作，随时可以开始进行抽样检测，而且操作简便，通过酶显色剂的放大作用，使菌落提前清晰地显现出来，培养十几小时就开始出现红色菌斑，非常适合于食品卫生检验部门和食品生产企业使用。经试验验证，本产品已达到倒平板法及国外同类产品的效果，具有外型美观，计数方便，灵敏度高，准确性好等特点。本品使用的微生物检测板已获专利，专利号为：ZL。
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1、原理及适用范围
&&&&&&菌落总数是指样品经过处理，在一定条件下培养后所得1mL(g)检样或单位面积样品中所含菌落的总数，是最常用的微生物检测项目。菌落总数测试片（FilmplateTM Aerobic BB202）是一种预先制备好的一次性培养基产品，含有标准的营养培养基，冷水可溶性的吸水凝胶和脱氢酶指示剂氯化三苯基四氮唑（TTC），菌落在测试片上呈红色，这样可缩短计数时间和增强计数效果。本产品适合于各类食品及食品原料中菌落总数的测定，也可用于检测食品加工容器、操作台和其他设备表面的菌落总数。执行标准：食品安全国家标准 食品微生物学检验菌落总数测定（GB/T 0）。
2、使用方法&&&&&&&&&
&&&&&&2.1、样品处理：取样品25mL（g）放入含有225mL灭菌磷酸缓冲液稀释液（或生理盐水）的取样罐或均质杯内，制成1:10的样品匀液，必要时用1mol/LNaOH或1mol/L HCl溶液调节样品匀液pH至6.6～7.2。用1mL灭菌吸管吸取1:10样品匀液1mL，注入含有9mL稀释液的试管内，振摇后成为1:100的样品匀液，以此类推，做出1:1000等稀释度的样品匀液，每次换一支吸管。
&&&&&&2.2、接种：一般食品选2～3个稀释度进行检测，含菌量少的液体样品（如饮用纯水和矿泉水等）可直接吸取原液进行检测。将菌落总数测试片（BB202）置于平坦实验台面，揭开上层膜，用无菌吸管吸取1mL样品匀液慢慢均匀地滴加到纸片上，然后再将上层膜缓慢盖下，静置10s左右使培养基凝固，每个稀释度接种两片。同时做一片空白阴性对照。
&&&&&&2.3、培养：将测试片叠在一起放回原自封袋中并封口，透明面朝上水平置于恒温培养箱内，堆叠片数不超过12片。一般食品培养温度为36℃±1℃，培养15～24h；水产品培养温度为30℃±1℃，培养48h。&&&&&&&&&
三、结果判读
&&&&&&&细菌在测试片上生长后会显示红色斑点，选择菌落数适中（30～300个）的测试片进行计数，乘以稀释倍数后即为每毫升（或每克）样品中所含的细菌菌落总数。
计数原则及报告方式
4.1、若只有一个稀释度纸片上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个纸片菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每毫升(或克)样品中菌落总数结果。
&&&&&& 4.2、若有两个连续稀释度的纸片菌落数在适宜计数范围内时，按式(1)计算:
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&&&&&& 4.3、若所有的稀释度菌落总数均大于300CFU，则对稀释度最高的测试片进行计数，其他测试片可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
4.4、若所有的稀释度菌落总数均小于30CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
4.5、若所有的稀释度（包括液体样品原液）均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。
4.6、若所有稀释度的平均菌落数均不在30CFU～300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于300CFU，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
&&&&&&&4.7、菌落总数的报告
4.7.1、菌落总数在100CFU以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告。
4.7.2、大于或等于100CFU时，第三位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前两位数字，后面的0代替位数，也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。
&&&&&&&&&4.7.3、若测试片上一片红色无法计数时，则报告多不可计。
4.7.4、若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。
4.7.5、称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。
5、表面取样方法
&&&&&&&& 加1mL灭菌磷酸缓冲液（或生理盐水）在测试片上，至少静置10S，使培养基凝固；提起上层膜，使中央滤纸部分贴到待测物表面，用手在外侧轻压；然后将上盖膜合上，置培养箱内培养。
6、附加说明
&&&&&&&6.1、菌落总数测试片检测结果与传统平板计数琼脂平板法符合率可达80％以上，山东省疾病预防控制中心进行的验证试验表明，24h计数测试片上菌落数为平板菌落数的87％。
6.2、磷酸缓冲液稀释液的配制与灭菌：贮存液：称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中，用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2，用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。稀释液：取贮存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL，分装于适宜容器中，121℃高压灭菌15分钟，或者放入消毒碗柜中消毒。
6.3、生理盐水的配制与灭菌：取8.5g分析纯氯化钠（NaCl）溶解到1000mL蒸馏水或纯净水中，先煮开后进行分装，取9mL加入到10mL洁净试管中，盖上硅橡胶塞或棉纱塞，放入红外线消毒柜中消毒。
7、保存条件
&本产品需存放在4℃～10℃冰箱中，保质期为一年，铝箔袋打开后,未用完的纸片要放回铝箔袋中封好，放到冰箱中，一个月内用完。在高湿度的环境中可能出现冷凝水，最好在拆封前将整包回温至室温。
微生物快速检测系列产品:
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垃圾渗滤液中细菌菌落总数的确定
【来源/作者】北纳创联 【更新日期】
一．实验的目的
(1)了解细菌菌落总数的含义。
(2)掌握细菌菌落总数测定的原理和方法。
(3)了解测定细菌菌落总数的意义。
二、实验原理
细菌菌落总数(CFO)是指1 mL ，水样的营养琼脂培养基中，于37℃中培养24 h后所生长的腐生性细菌菌落总数。它是有机物污染程度的指标，也是卫生指标。细菌菌落总数测定水中需氧菌、兼性厌养菌和异养菌密度的方法。细菌种类很多，有各自的生理特性，必须用适合它们生长的培养基才能将它们培养出来。然而，在实际工作中不易做到，通常用一种适合大多数细菌生长的培养基培养腐生性细菌，以它的菌落总数表明有机物污染程度。因此，由此法所得的菌落可能低于真正存在的活细菌的总数。
三、实验仪器
(1)恒温培养箱、冰箱；
(2)高压蒸汽灭菌器：
(3)生物显微镜、载玻片；
(4)无菌培养皿(直径90 mm)，无菌移液管(1 mL、10 mL)、采样品等。
四．实验步骤
1．制备营养琼脂培养基
(1)配方：蛋白胨10 g、牛肉浸膏3 g、NaCl 5 g、琼脂15~20 g、蒸馏水1 000 mL。
(2)制备：将上述成分混合后，调节pH值为7．4～7．6，过滤除去沉淀，分装于玻璃容器中，经121℃高压蒸汽灭菌15 min，储存于暗处备用。
2．水样的稀释
在无菌操作条件下，以1 0倍稀释法稀释水样，视水体污染程度以定稀释倍数。一般取平板上能长出30~300个菌落的作为该种水样的稀释倍数。
(1)将水样用力振荡20~25次，使可能存在的细菌凝团成分散状。
(2)将1瓶90 mL和5管9 mL的稀释水排列好，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6依次编号。
(3)在无菌操作条件下，用无菌移液管吸取10 mL水样(或其他样品10 g)置于第一瓶90mL无菌水(内含玻璃珠)中，将移液管吹洗3次，用手摇10min将颗粒状样品打散。即为10-1浓度的菌液。
(4)用无菌移液管吸取1 mL水样10一1浓度的菌液置于一管9 mL无菌水中，将移液管吹洗3次，摇匀，即为10一2浓度的菌液。同样方法，依次稀释到10一6
(1)以无菌操作方法，用无菌移液管吸取3个适宜浓度的稀释水样1 mL，注入无菌培养皿内，再倾注约15 mL已融化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。每个水样应倾注两个平皿，每次检验时，另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基做空白对照。
(2)待琼脂培养基冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于37℃恒温箱中培养24h，进行菌落计数。
4．菌落计数
培养之后，立即进行平皿菌落计数。如果计数不能立即进行，需将平皿存放5～10℃冰箱内，且不得超过24 h。做平皿菌落计数时，可用菌落计数器或放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数。如果由于稀释等过程中有杂菌污染，或者对照平皿显示出培养基或其他材料有杂菌，以致平皿无法计数，则应报告“实验事故”。
对那些看来相似，距离相近但却不相触的菌落，只要它们之间的距离不小于最小菌落的直径，便应一一予以计数。
五、计算和报告计数方法
细菌菌落总数是以每个平皿菌落的总数或平均数(如同一稀释度3个重复平皿的平均数乘以稀释倍数)。各种不同情况的计算方法如下。
(1)首先选择平均菌落数在30～300者进行计算，当只有一个稀释度平均菌落符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数报告(表8-7例1)。
(2)若有两个稀释度平均菌落数在30～300，则按两者菌落总数之比值来决定，若其比值小于2应报告两者的平均数，若大于2则报告其中较小的菌落总数(表8-7例2、例3)。
(3)若有两个稀释度平均菌落数大于300，则应按稀释度最大的平均菌落数乘以稀释倍数报告(表8—7例4)。
(4)若有两个稀释度平均菌落数小于300，则应按稀释度最小的平均菌落数乘以稀释倍数报告(表8．7例5)。
(5)若有两个稀释度平均菌落数均不在30～300，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告(表8—7例6)。
(6)在求同稀释度平均数时，若其中一个平板上有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度平均菌落数。若片状菌落约为平板的一半，而另一半平板上菌落数分布很均匀，则可按半平板上的菌落计数，然后乘以2作为整个平板的菌落数。
(7)菌落计数的报告：菌落数在100以内时按实有数报告，大于100时，采用二位有效数字，在两位有效数字后面的位数，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数，可用lO的指数来表示(表8-7报告方式)。在报告菌落数为“无法计数”时，应注明水样的稀释度。
(1)简述垃圾渗滤液中细菌菌落总数测定的意义。
(2)干扰本实验结果的因素有哪些?
【关键词】菌落 营养琼脂 &
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请选出正确操作顺序
①吸取0.1ml菌液涂布&&&&&&&&&&
②依次稀释不同倍数
③ 土壤取样&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
④称取10克土壤加入90ml无菌水的锥形瓶中
A. ③④②①&&&&&&&&
B. ③④①②
C. ④③②①&&&&&&&&
D. ③①②④
试题分析：稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布在琼脂固体培养基的表面，进行培养，在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。其操作顺序是土壤取样、称取10克土壤加入90ml无菌水的锥形瓶中、依次稀释不同倍数、吸取0.1ml菌液涂布。
考点：考查稀释涂布平板法的操作过程。
考点分析：
考点1：微生物的利用
考点2：微生物的分离和培养
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