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【原创】qRT-PCR引物
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这个帖子发布于2年零80天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
primer-balst验证引物特异性时：1. 是不是必须有目的基因出现才行啊？ 如果没有，是不是说明primer的特异性不行啊？2. 出现非目的基因，但是大小跟目的基因相差很大，是不是对qRT-PCR没关系啊？
不知道邀请谁？试试他们
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我一般的做法1. 设计引物的时候去blast比对，基本第一个就是，如果不是，那就是你设计的方法不对。2. 很多情况下，比对结果中，除了目的模板，还有其它模板的非特异性产物结果，一般情况下不影响扩增。当然，理论最好的结果是只有目的模板目的产物。但无论如何，去机器上扩了才知道。
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我一般的做法1. 设计引物的时候去blast比对，基本第一个就是，如果不是，那就是你设计的方法不对。blast时没有出现目的模板，是不是该引物不行啊
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7栋302 primer-balst验证引物特异性时：1. 是不是必须有目的基因出现才行啊？ 如果没有，是不是说 ...1. 没有出现目的基因，可能有两个原因，第一，引物有问题，或者是引物上面人为添加了突变，导致和目的基因无法比对。第二，可能是BLAST时数据库选择不对数据库中压根就没有包含目的基因。请核查你的问题是那个原因。2. 因为长度相差较大，在电泳上不会造成区分影响，但会影响扩增效果，毕竟有竞争效应。
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鸡传染性法氏囊病毒实时qRT-PCR检测方法的建立及初步应用什么是realtime PCR，什么是q-pcr，所用反应物质与普通PCR有何不同_百度知道
什么是realtime PCR，什么是q-pcr，所用反应物质与普通PCR有何不同
另外RealTime-q-pcr 是不是就是q-pcr稍微详细点。查查百度百科什么的，我也会，最好附加点做的注意事项
提问者采纳
标曲反应扩增效率，自己查百度百科和文库，不太好解释，如果只有特异的单一融解峰，不然只能用2 delta delta t法了，这样比较准确点，都是一个意思，特别是同一物种不同组织中某基因的表达情况，很难反映原来模板的浓度，原理什么的我就不说了，q-pcr。2 最好有标准曲线，如果有可能可以双内参，它起飞时间的Ct值可以精确反映模板的浓度，别人肯定会argue你的，有些杂志扣的话。定义，一定要别人报道过在你检测的组织中变化不大。1 选好内参基因，而当PCR经过多伦循环到平台期后，我就从实战给你点注意事项吧，q-RT-PCR等等，操作；而实时定量PCR 反映的是PCR的过程，再去分析数据,简称real-time
PCR实时定量PCR (real-time quantitative PCR)，如果你只是拿一个别的物种中的同源基因，还可以直接有已知模板来制（可以搜一下网上的标曲制备方法）3 结果先看融解曲线，不然没有意义。普通PCR结果反映的其实是PCR的结果。标曲可以用cDNA来制备
其他类似问题
谓real-time Q-PCR技术。利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，是指在PCR反应体系中加入荧光基团,通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法
采纳率100%
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其他1条回答
由于PCR敏感性高，扩增产物总量变异系数大，定量不准确。90年代末期出现了Q-PCR， 利用荧光检测PCR仪绘制DNA扩增过程中的累积速率动态变化图，基本消除在测定终端产物丰度时变异系数较大的问题。混合在PCR反应液中的荧光探针只有与双链DNA结合后，才能够被激发出荧光。随着新合成DNA片段的增加，由于结合到DNA上的荧光探针增加，被激发产生的荧光相应增加。
为确保荧光检测的确实是靶DNA，又设计了仅能与目的DNA特异结合的荧光探针。TaqMan探针是一段与靶DNA序列中间部位结合的单链DNA，长50bp-150bp，该DNA的5’和3’端带有短波长和长波长两个不同荧光基团，由于彼此距离靠近，在荧光共振能量转移（FRET）作用下发生荧光淬灭，因而检测不到荧光。随着PCR反应的进行，TaqMan 探针结合到目的DNA序列上，并且...
pcr的相关知识
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出门在外也不愁QRT-PCR数据的取舍 - PCR实验 - 生物秀
标题: QRT-PCR数据的取舍
摘要: [QRT-PCR数据的取舍] 大家好，我想问一下，CT值相差多少是可信的，如果我扩增了十组样本，每组做两个复孔，9个组的两个CT值相差小于1，有一个组相差很大，超过3 ，我能以相同的条件，再扩增一下这个组么？直至二者CT值接近。此时，我能把这组后来得到的CT值和之前的9组CT值放在一起分析么？ 关键词:[]……
大家好，我想问一下，CT值相差多少是可信的，如果我扩增了十组样本，每组做两个复孔，9个组的两个CT值相差小于1，有一个组相差很大，超过3 ，我能以相同的条件，再扩增一下这个组么？直至二者CT值接近。此时，我能把这组后来得到的CT值和之前的9组CT值放在一起分析么？
回复Ct值小于1才算是平行性较好，相差大的组的Ct值是不是比较大，超过30个循环啊，如果CT值大的话平行性不好正常的。回复Ct值小于1才算是平行性较好，相差大的组的Ct值是不是比较大，超过30个循环啊，如果CT值大的话平行性不好正常的。嗯，我是扩40个循环，有的组CT值相差3-4，我想再单独把这些组做一下，然后和之前的结果一起分析？请问您遇到过这种问题么？回复我是CT值超过35个循环才会出现这种情况的。回复这样没有可比性呀 条件不一致 最好是在同一次试验统计数据回复这样没有可比性呀 条件不一致 最好是在同一次试验统计数据加大样都是一样的，循环次数也是一样的。如果不能比的话，我做了一板，因为一两组数据平行性不好，所有的数据都应该重新做么？回复在不同一板上机时 有不一样的因素：相同试剂、扩增的条件等都一样时，也有人为操作与问题导致结果不一致，要是你的试验要求不是那么严格话 也可以这么统计数的回复加大样都是一样的，循环次数也是一样的。如果不能比的话，我做了一板，因为一两组数据平行性不好，所有的数据都应该重新做么？ 如果是操作者，，体系，条件都相同的话，可以将不好的重新做，而不用做其它好的了。回复 如果是操作者，，体系，条件都相同的话，可以将不好的重新做，而不用做其它好的了。哦，请问这样的结果能发文章么？还想问一下，文章中都说来自三个独立的结果，是不是说我每相同处理需要提三次RNA,然后分别反转，再每一组做三个复孔，取平均值进行统计么？这样算来一中处理就是9个孔，是不是太多了？回复哦，请问这样的结果能发文章么？还想问一下，文章中都说来自三个独立的结果，是不是说我每相同处理需要提三次RNA,然后分别反转，再每一组做三个复孔，取平均值进行统计么？这样算来一中处理就是9个孔，是不是太多了？这就要看你的实验设计了，原则上最好是这么做的，不过这么做很难做到平行，但是应该能保证趋势是一样的。回复这就要看你的实验设计了，原则上最好是这么做的，不过这么做很难做到平行，但是应该能保证趋势是一样的。我现在就是趋势都不一样，不知道哪边出问题了？回复我现在就是趋势都不一样，不知道哪边出问题了？你说趋势不一样是什么意思呢？我也在做荧光，我现在最大的问题就是样本间内参Cp值相差比较大，但是要将样本间内参调齐是件非常难的事情。所以我不知道你说趋势不一样是指什么呢？回复你说趋势不一样是什么意思呢？我也在做荧光，我现在最大的问题就是样本间内参Cp值相差比较大，但是要将样本间内参调齐是件非常难的事情。所以我不知道你说趋势不一样是指什么呢？就是第一次和第二次做结果不同，重复性不好，有时两个复孔的CT值也相差很大。我做的是细胞，种板时相同浓度种的，一样的提法，所以内参一批的话，差的不太多。但是我的内参一直污染，合成好，刚溶解，再做，就是污染，我在检验科做，不知和我们科里天天处理很多的血样，形成气溶胶有没有关系。回复哦，原来是这样。不过我的实验重复性也不好，而且荧光PCR这个东西非常耗钱，每天实验也都是担心吊胆的。回复就是第一次和第二次做结果不同，重复性不好，有时两个复孔的CT值也相差很大。我做的是细胞，种板时相同浓度种的，一样的提法，所以内参一批的话，差的不太多。但是我的内参一直污染，合成好，刚溶解，再做，就是污染，我在检验科做，不知和我们科里天天处理很多的血样，形成气溶胶有没有关系。肯定是有些关系的，将配制混合液和加模板的区域分开吧。回复肯定是有些关系的，将配制混合液和加模板的区域分开吧。只有一个屋子，呵呵，资源紧张，只好将就了回复只有一个屋子，呵呵，资源紧张，只好将就了屋子不用分开，就是实验台和枪分开。回复屋子不用分开，就是实验台和枪分开。您好，请问real-time PCR做相对定量时，拿control组作为对照，用2-ΔΔCT法计算后得到的contro组数据应该都为1，标准差应为0，那文献中的标准差（error bar）是用什么方法计算得到的呢？是拿control的三个值除还是减均值啊？
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