TaqMan荧光探针-学术百科-知网空间
TaqMan荧光探针
TaqMan荧光探针
一、概 述乙型病毒性肝炎(viral hepatitis type B,简称乙肝)系由乙肝病毒(hepatitis ...之后TaqMan探针技术的发展，实现封闭鉴定的实时荧光定量PCR技术产品开始在国内生产并推广。此前曾有终点荧光PCR
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目的建立特异、敏感、快速检测CAR菌的TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法。方法针对CAR菌16S rRNA基因序列设计特异性引物和探针,建立MGB探针荧光定量PCR方法,
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<font color="#0-基于核酸分子探针荧光传感蛋白检测新方法研究--《青岛科技大学》2015年硕士论文
基于核酸分子探针荧光传感蛋白检测新方法研究
【摘要】：DNA容易受到来自细胞内外的刺激而造成各种损伤,这些损伤会通过增加基因突变的概率、加剧DNA错误复制而威胁基因完整性。T4多核苷酸激酶(PNK)和人类8-oxoG DNA糖基化酶1(hOGG1)能够分别通过修复DNA 5’-羟基末端和基于碱基切除修复(BER)过程修复DNA损伤来维护基因的完整性。核酸分子探针荧光传感器由于其设计简便、实验操作简单、灵敏度高、选择性好,近年来也获得了快速持久的发展。本论文通过巧妙设计荧光分子探针构筑了简便、新奇的DNA生物传感器实现对酶的研究。本论文分三个部分：1、基于有效的酶反应即PNK催化的发卡探针(HP)的磷酸化和λexo的裂解反应,使得触发DNA片段(tDNA)从HP上释放,进而能够催化双分子信标(bi-MBs)的组装,导致荧光信号的放大,实现PNK活性的灵敏检测。PNK的检测限为1mU mL-1,优于或相当于已报道的检测方法。而且,这种方便灵敏的方法同样能够从常见的几种抑制剂中筛选抑制剂的活性。对于多核苷酸激酶活性的灵敏检测和抑制剂的筛选,提供了一个有前景的平台,也在生物过程研究、药物释放和临床诊断中显示出巨大的潜力。2、结合外切酶反应和切口酶辅助的荧光信号放大,构筑了一个新型的传感平台用于灵敏检测T4多核苷酸激酶的活性和抑制作用。通过循环切割DNA荧光探针信号放大,实现灵敏检测PNK活性,检测限为0.05 mU mL-1。本方法实现在均相溶液中采用简单、无分离方法检测。此外,也成功分析了几种已知激酶抑制剂对PNK的抑制作用。3、基于Exo Ⅲ辅助自发信号扩增技术实现了荧光法检测hOGG1活性。本方法巧妙设计了两个发卡探针(HP1和HP2),当加入hOGG1时,HP1在8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG)位点被hOGG1识别切断,随后Exo Ⅲ将HP茎一条链水解,释放触发DNA片段(tDNA1)。 tDNA1与HP2部分杂交,HP2的3'-末端形成双链引发Exo Ⅲ辅助的循环裂解并释放出另一端触发DNA片段(tDNA2),tDNA2又能引发DNA荧光探针(FP)循环水解。导致大量标记荧光的寡核苷酸释放,荧光信号大大增强。所获得的直接测量检测限低至0.001 UmL-1,远低于先前文献中报道的方法。此外,我们提出的ExoⅢ辅助的自主循环裂解方法是个通用的传感策略,在许多其他的生物检测中有巨大的潜力。
【关键词】：
【学位授予单位】：青岛科技大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2015【分类号】：O657.3;TP212【目录】：
摘要3-5ABSTRACT5-101 绪论10-39 1.1 传感器概述10-13
1.1.1 传感器的工作原理10-11
1.1.2 传感器的分类11
1.1.3 传感器的地位和作用11-12
1.1.4 传感器的应用及发展动向12-13 1.2 DNA生物传感器研究进展13-17
1.2.1 DNA生物传感器设计原理及分类13-14
1.2.2 电化学DNA生物传感器14-16
1.2.2.1 修饰电极的形成14-15
1.2.2.2 杂交指示剂15
1.2.2.3 电化学DNA传感器的发展15-16
1.2.3 压电DNA生物传感器16
1.2.4 光学DNA生物传感器16-17 1.3 分子探针荧光DNA生物传感器17-26
1.3.1 基于荧光共振能量转移(FRET)作用的发光机理17-18
1.3.2 分子探针基于发光物质不同分类18-21
1.3.2.1 有机染料荧光探针18-19
1.3.2.2 稀土元素荧光探针19-20
1.3.2.3 过渡金属配合荧光探针20
1.3.2.4 纳米荧光探针20-21
1.3.3 分子探针基于探针结构不同分类21-26
1.3.3.1 TaqMan探针21
1.3.3.2 QUAL(Quench auto-ligation)探针21-22
1.3.3.3 相邻探针22-23
1.3.3.4 蝎形引物探针23
1.3.3.5 阴阳探针23-24
1.3.3.6 核酶探针24-25
1.3.3.7 核酸荧光适体探针25
1.3.3.8 分子信标荧光探针25-26 1.4 分子探针荧光传感器在生物分析中的应用26-31
1.4.1 在核酸检测中的应用26-28
1.4.1.1 DNA的检测27
1.4.1.2 RNA的检测27-28
1.4.2 在蛋白质检测中的应用28-29
1.4.3 在生物小分子检测中的应用29-30
1.4.4 在金属离子检测中的应用30-31 1.5 立题依据31-33 参考文献33-392 基于λ酸外切酶切割反应和双分子信标催化组装信号放大检测T4多核苷酸激酶活性39-52 2.1 引言39-40 2.2 实验部分40-41
2.2.1 试剂40-41
2.2.2 仪器与设备41
2.2.3 制备DNA储备液41
2.2.4 PNK催化的磷酸化和条件优化41
2.2.5 激酶抑制剂的评估41 2.3 结果与讨论41-48
2.3.1 实验设计原理41-42
2.3.2 实验可行性42-44
2.3.3 实验条件优化44-46
2.3.4 PNK活性检测46-47
2.3.5 PNK活性抑制作用评估47-48 2.4 本章小结48-49 参考文献49-523 基于多种酶辅助信号放大机制高灵敏荧光检测T4多核苷酸激酶活性52-64 3.1 引言52-53 3.2 实验部分53-54
3.2.1 材料与仪器设备53-54
3.2.2 荧光放大分析PNK催化磷酸化和条件优化54
3.2.3 激酶抑制剂的评估54 3.3 结果与讨论54-60
3.3.1 灵敏检测PNK活性的实验方法设计原理54-55
3.3.2 可行性研究55-56
3.3.3 实验条件优化56-58
3.3.4 灵敏、可重复利用的PNK活性检测生物传感器58
3.3.5 PNK活性的抑制作用58-60 3.4 本章小结60-61 参考文献61-644 基于核酸外切酶Ⅲ辅助自发等温循环信号放大策略高灵敏荧光检测DNA糖基化酶活性64-76 4.1 引言64-65 4.2 实验部分65-67
4.2.1 试剂65-66
4.2.2 仪器与设备66
4.2.3 DNA储备液的制备66
4.2.4 ExoⅢ辅助的hOGG1活性分析66-67 4.3 结果与讨论67-72
4.3.1 hOGG1荧光检测原理67-68
4.3.2 hOGG1活性检测可行性研究68-69
4.3.3 优化实验条件69-70
4.3.4 hOGG1活性检测70-72
4.3.5 hOGG1活性检测选择性72 4.4 本章小结72-73 参考文献73-76结论76-77致谢77-78攻读硕士学位期间发表的学术论文78-79
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京公网安备75号&&& 分子诊断学是以分子生物学理论为基础，利用分子生物学的技术和方法来研究人体内源性或外源性生物大分子的结构或表达调控的变化，为疾病的预防、诊断、治疗提供信息和依据。分子诊断是预测诊断的主要方法，既可以进行个体遗传病的诊断，也可以进行产前诊断。分子诊断的材料包括DNA、RNA和蛋白质，其中DNA和蛋白质是分子诊断研究的主要方向。与传统诊断方法相比，分子诊断技术具有以下特点：1）提高了准确性、精确性、灵敏度和特异性。2）与传统方法相比诊断时间早，可以做到早期诊断。3）所需样本量少。4）产前诊断和个体化治疗。1. 分子诊断的主要技术分子诊断技术从监测对象来分主要分为DNA诊断技术、RNA诊断技术和蛋白质诊断技术。11.1 DNA分子诊断技术&&& DNA分子诊断技术从发展的历程上来分主要分为：基于核酸分子杂交的分子诊断技术、基于PCR的分子诊断技术、基于基因测序的分子诊断技术以及其他技术。1.1.1 基于核酸分子杂交的技术&&& 核酸分子杂交的基本原理是：互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交。这种结合是特异的，即严格按照碱基互补的原则进行，它不仅能在DNA和DNA之间进行，也能在DNA和RNA之间进行。因此，当用一段已知基因的核酸序列作出探针，与变性后的单链基因组DNA接触时，如果两者的碱基完全配对，它们即互补地结合成双链，从而表明被测基因组DNA中含有已知的基因序列。由此可见，进行基因检测有两个必要条件，一是必需的特异的DNA探针；二是必需的基因组DNA。当两者都变性呈单链状态时，就能进行分子杂交。核酸分子杂交的技术主要有以下几种：（一）DNA印迹技术（Southern blot）&&& DNA印迹技术通过限制性内切酶将DNA片段化，再以凝胶电泳将长度不等的DNA片段进行分离，通过虹吸或电压转印至醋酸纤维膜上，再使膜上的DNA变性与核素标记的寡核苷酸探针进行分子杂交，经洗脱后以放射自显影鉴别待测的DNA片段探针间的同源序列。这一方法由于同时具备DNA片段酶切与分子探针杂交，保证了检测的特异性。因此，一经推出后便成为探针杂交领域最为经典的分子检测方法，广为运用于各种基因突变，如缺失、插入、易位等，及与限制性酶切片段长度多态性的鉴定中。（二）ASO反向斑点杂交（Allelic specific oligonucleotide reversed dot blot，ASO-RDB)&&& 使用核酸印迹技术进行核酸序列的杂交检测具有极高的特异性，但存在操作极为繁琐，检测时间长的缺点。通过在质粒载体导入单碱基突变的方法，构建等位基因特异性寡核苷酸探针（ASO），可以对核酸序列点突变进行检测。1986年，Saiki首次将PCR的高灵敏度与ASO斑点杂交的高特异性结合起来，实现了利用ASO探针对特定基因多态性进行分型。其后为了完成对同一样本的多个分子标记进行高通量检测，Saiki又发明了ASO-RDB，通过将生物素标记的特异性PCR扩增产物与固定于膜上的探针杂交显色，进行基因分型、基因突变的检测。该法可将多种寡核苷酸探针固定于同一膜条上，只需通过1次杂交反应，即可筛查待检样本DNA的数十乃至数百种等位基因，具有操作简单、快速的特点，一度成为基因突变检测、基因分型与病原体筛选最为常用的技术。（三）荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）&&& FISH是在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法，探针首先与某种介导分子结合，杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料。FISH的基本原理是将DNA探针用特殊的核苷酸分子标记，然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析。FISH具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点，不但能显示中期分裂相，还能显示于间期核。（四）多重连接探针扩增技术（Multiplex ligatiort-dependent probe amplification，MLPA）&&& 每个MLPA探针包括2个荧光标记的寡核苷酸片段，1个由化学合成，1个由M13噬菌体衍生法制备；每个探针都包括1段引物序列和1段特异性序列。在MLPA反应中，2个寡核苷酸片段都与靶序列进行杂交，再使用连接酶连接2部分探针。连接反应高度特异，只有当2个探针与靶序列完全杂交，连接酶才能将2段探针连接成1条完整的核酸单链；反之，如果靶序列与探针序列不完全互补，即使只有1个碱基的差别，就会导致杂交不完全，使连接反应无法进行。连接反应完成后，用1对荧光标记的通用引物扩增连接好的探针，每个探针扩增产物的长度都是唯一的。最后，通过毛细管电泳分离扩增产物，便可对把核酸序列进行检测。该技术具备探针连接反应的特异性与多重扩增探针杂交的高通量特性。MLPA技术已成为涵盖各种遗传性疾病诊断、药物基因学多遗传位点鉴定、肿瘤相关基因突变谱筛查、DNA甲基化程度定量等综合分子诊断体系，是目前临床最为常用的高通量对已知序列变异、基因拷贝数变异进行检测的方法。（五）DNA芯片&&& DNA芯片技术就是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可获得样品的遗传信息。基因芯片可分为两种主要类型：1）合成点样的DNA芯片。即先合成DNA探针，再点样固定在聚合物基片（玻璃、尼龙膜、硝酸纤维膜等）表面上，通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。这种方法的优点是所需检测设备与目前分子生物学所用的放射显影技术相一致，相对比较成熟。2）原位合成的DNA芯片。即在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。该方法把微电子光刻技术与DNA化学合成技术相结合，可以使基因芯片的探针密度大大提高，减少试剂的用量，实现标准化和批量化大规模生产，有着十分重要的发展潜力。1.1.2 基于PCR的DNA诊断技术&&& 聚合酶链式反应（PCR）技术已经成为核酸扩增最常用的方法。该反应体系中包括热稳定性DNA聚合酶、待测基因组DNA模板、与模板DNA链互补的1对寡核苷酸引物，经过20～40次扩增循环后，将模板DNA的特异性区段扩增数十亿倍以上。每一个PCR扩增循环包括1个热变性阶段将双链DNA解链为单链DNA，随后是1个复性阶段将引物与单链目的序列连接在一起，最后是1个延伸阶段，借助于DNA聚合酶以合成1条与模板DNA互补的新链。目前常规PCR方法已经衍生出许多新的PCR检测技术。（一）多重PCR（Multiplex PCR）&&& 多重PCR检测方法由于在1个反应体系中包含多组PCR引物，可以同时完成多个靶基因的同时检测，因而可以很好地实现高通量检测这一目标。多重PCR检测技术的关键步骤是引物的设计，所有设计引物的退火温度必须非常相近，扩增产物大小的差别足够大，以能够在琼脂糖凝胶电泳中有效区分开来。此外，多重PCR引物也不能造成各扩增之间有干扰，这种干扰会使得多重PCR的扩增反应体系难以得到优化，特别是在引物对数量较多的反应体系中尤为关键。（二）巢式PCR（Nested PCR）&&& 检测灵敏度和特异性是评价一个检测方法的重要参数，为了优化这两个参数应运而生了巢式PCR。巢式PCR检测体系中需要按照顺序加入两对引物，第一对引物扩增出目的片段之后，作为第二对引物扩增的模板。第二对引物位于第一对引物扩增产物上，如果第一对引物是非特异性扩增，第二对引物就不会发生扩增反应，这样就增加了检测的特异性。目前根据该技术设计出的食源性致病菌检测和鉴定方法已经有不少报道。巢式PCR检测技术的一个显著缺点是在反应过程中，反应管需要中途被打开以加入第二对引物，这样就增加了反应体系被污染的可能性。（三）反转录PCR（Reverse-transcription PCR）&&& 反转录PCR是用RNA代替DNA作为反应模板的一种核酸扩增方法，与以基因组DNA为模板的PCR方法相比，反转录PCR以从致病菌RNA反转录来的cDNA为扩增模板，只有活性细胞才能够被检出，能防止假阳性结果的出现。反转录PCR检测方法是在反转录酶的作用下，RNA模板首先被反转录成互补的cDNA单链，以用来作为随后普通PCR扩增的模板。目前，反转录PCR方法不仅可以完成对靶基因的检测还可以对靶基因的表达量进行检测。反转录PCR检测方法的缺点是由于RNA极为不稳定，需要检测人员的操作极为熟练，才能保证检测结果的稳定性和重复性。（四）实时荧光定量PCR（Real-time PCR）&&& 实时荧光定量PCR技术基本原理是在PCR扩增时在加入引物的同时加入特异性的荧光探针，该探针一般情况下不会发出荧光，只有与模板链发生特异性结合时才会发出荧光，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，在核酸扩增过程中可以随时监测结果。与常规PCR方法相比，实时荧光定量PCR不需要后续的分析过程，缩短了检测的时间，也减少了检测环境对扩增反应所带来污染的可能性。此外，实时荧光PCR是一种定量检测方法。荧光探针是这一检测技术中的重要元件，实时荧光PCR所用的荧光探针主要有4种：TaqMan荧光探针、分子信标探针、FRET杂交探针和SYBRGreen染料探针，其中TaqMan荧光探针使用最为广泛。以下为几种探针的基本原理：A：TaqMan探针&&& TaqMan探针基本原理是在PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时, 探针结合在DNA任意一条单链上;PCR扩增时，Taq酶的5&#39;端－3&#39;端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。B：分子信标探针&&& 分子信标探针是可形成发夹结构的寡核苷酸探针，5′末端标记荧光素（EDANS)，3′末端标记淬灭剂(DABCYL) ，探针噜扑环与目的DNA 碱基互补，噜扑环两侧为与目的DNA 无关的碱基互补的臂。当探针与靶序列相连，淬灭基团与报告基团逐渐远离，遂发出荧光。C：FRET杂交探针&&& FRET杂交探针基本原理是：一套FRET探针包括2条探针：一条为锚定探针，通常为长探针，结合于模板的保守区域；另一条为感受探针，通常为短探针，包含了特异性序列。两个荧光基团，一个为供体基团，另一个是受体基团，其中一个标记于上有探针的3&#39;端，另一个位于下游探针的5&#39;端。当两条探针都能与模板结合时，则由于荧光能量共振转移的原理使得受体基团发光。D：SYBRGreen探针&&& SYBRGreen探针是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。（五）PCR-ELISA&&& PCR－ELISA是PCR与酶联免疫吸附（ELISA）技术相结合的检测方法。PCR－ELISA首先通过生物素-亲和素的交联作用，将3&#39;端标记有生物素的捕获探针固定在链霉素亲和包被的微孔板上。然后通过生物素、地高辛、荧光素酶等标记的引物给PCR产物加上抗原标记。将扩增产物与捕获探针杂交，靶序列被捕获，再向微孔中加入酶标抗体，抗体与靶序列上的抗原结合，最后加入底物显色，测定相应波长的吸光度值。加入内标，作出标准曲线后，PCR－ELISA技术也可实现定量检测。PCR－ELISA法简便经济，只要具备PCR仪和酶标仪即可实施，特异性和灵敏度均较高，特别适宜大量样品的筛检。（六）数字式PCR（Digital PCR）数字PCR是最新的绝对定量技术，他基于单分子PCR方法来采用计数的方法对DNA进行定量，因此是一种绝对定量的工具。主要采用当前分析化学热门研究领域-微流控的方法，将大量的稀释后的DNA溶液分散至芯片的微反应器中，每个反应器的DNA模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个DNA模板的反应器就会亮，没有DNA模板的反应器就是暗的。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的DNA浓度。1.1.3 基于基因测序的分子诊断技术&&& 测序反应是直接获得核酸序列信息的唯一技术手段，是分子诊断技术的一项重要分支。虽然分子杂交、分子构象变异或定量PCR技术在近几年已得到了长足的发展，但其对于核酸的鉴定都仅仅停留在间接推断的假设上，因此对基于特定基因序列检测的分子诊断，核酸测序仍是技术上的金标准。21世纪初人类基因组计划完成，6国科学家合作完成了人类基因组图谱，对基因测序分子诊断有着重要的指导意义。严格的说，目前人类基因组图谱主要是结构图谱（碱基构成），目前科学家正在解析各个序列的作用，相信将来人类基因组的功能图谱也会绘制成功。基因测序主要经过了3代技术上的改革：（一）第1代测序&&& Sanger等提出的末端终止法利用不含羟基的双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）进行测序引物延伸反应，ddNTP在DNA合成反应中不能形成磷酸二酯键，DNA合成反应便会终止。如果分别在４个独立的DNA合成反应体系中加入经核素标记的特定ddNTP，则可在合成反应后对产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射自显影，根据电泳条带确定待测分子的核苷酸序列。（二）第2代测序&&& 1．焦磷酸测序不同于Sanger测序法所使用的合成后测序理念。焦磷酸测序基本原理是利用引物链延伸时所释放的焦磷酸基团激发荧光，通过峰值高低判断与其相匹配的碱基数量。由于使用了实时荧光监测的概念，焦磷酸测序实现了对特定位点碱基负荷比例的定量，因此在SNP位点检测、等位基因（突变）频率测定、细菌和病毒分型检测方面应用广泛。&&& 2．高通量第2代测序通过DNA片段化构建DNA文库、文库与载体交联进行扩增、在载体面上进行边合成边测序反应，使得第1代测序中最高基于96孔板的平行通量扩大至载体上百万级的平行反应，完成对海量数据的高通量检测。该技术可以对基因组、转录组等进行真正的组学检测，在指导疾病分子靶向治疗、绘制药物基因组图谱指导个体化用药、感染性疾病的病原微生物宏基因组鉴定及通过母体中胎儿DNA信息进行产前诊断等方面已经取得了喜人的成绩。（三）第3代测序&&& 第3代测序技术的核心理念是以单分子为目标的边合成边测序。该技术进一步降低了成本，可对混杂的基因物质进行单分子检测，故对SNP、CNV的鉴定更具功效。但是目前其进入产品商业化，并最终投入临床应用仍有很长的距离。1.1.4 其他技术（一）环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）环介导等温扩增技术是一种新型的核酸扩增技术，2000年由日本荣研化学株式会社开发。LAMP基本原理是针对靶基因上的六个区域设计四条引物，利用链置换型DNA聚合酶在恒温条件下进行扩增反应。与常规PCR相比，LAMP技术具有如下明显的优点：首先，LAMP能够在恒温（60～65℃）条件下进行，30～60min内将只有几个拷贝的靶核酸底物扩增到109水平；其次，多个引物识别靶点的不同区域，大大增强了检测的特异性；再次，该方法的一大特色是可以通过反应副产物-白色焦磷酸镁沉淀的产生与否判断靶基因的存在，肉眼就可以观察到检测的结果。因此，LAMP技术具有不需要昂贵的检测设备，以及特异性强、快速、易操作等特点。此外，由于反应混合物的浊度随着扩增产物DNA量的增加而相应升高，该方法也可以用于定量和实时检测。（二）支链DNA技术(bDNA)&&& 支链DNA是一种与PCR不同的核酸探针杂交标记信号放大技术。其基本原理为：合成3个探针和bDNA分子，3个探针分别称为捕获探针、靶探针1和靶探针2。将捕获探针固相化在微孔板上，靶探针1可分别与待测核酸及固相化的探针杂交，而靶探针2可分别与待测核酸及bDNA杂交，在杂交反应完成后，就形成了固相捕获探针一靶探针1一待测序列一靶探针2-bDNA复合物。因bDNA的分支序列又可与3个酶标探针杂交，借助酶的催化反应就能定量检测待测核酸的含量。bDNA技术的最大特点是不经过呈指数增长的扩增过程，放大倍数确定，不利因素少，因此稳定性、重复性高，结果准确。该方法相对PCR更易操作，得到广泛应用。bDNA技术的缺点是放大倍数少、敏感性低、检测范围窄，不适合低水平检测。目前国内仅有数家医院引进bDNA试剂盒和配套的荧光分析检测仪，用于研究和满足特殊患者的需要。由于成本过高，bDNA技术在现阶段尚难以在国内成为常规检测手段。（三）连接酶链式反应（Ligase chain reaction，LCR）&&& LCR是Backman 1997年为检出靶基因序列中的点突变而设计发明，并申报了专利。其基本原理是：合成一对引物A、B，它们完成覆盖了靶序列。经退火与靶序列结合后，A、B间留下一个缺口，加入连接酶封闭缺口，两引物成靶序列完整的互补链。如果靶序列中有点突变，引物不能与靶序列精确结合，缺口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接反应不能进行，变性后引物仍是两个。1.2 RNA 分子诊断技术分子诊断技术与DNA分子诊断技术的原理大致相同：主要方法有Northernblot、RT-PCR、RNA芯片等。其需要注意的有以下几点。（一）不论直接以mRNA作为探针还是以mRNA反转录成cDNA再进行后续的检测，检测结果都不会受到非编码区的影响。（二）RNA病毒（如HIV、SARS、禽流感等）其遗传物质是RNA，因此RNA分子诊断对于诊断病毒有很重要的作用。（三）MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20~25个核苷酸。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。最近的研究表明miRNA参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等，因此可以以miRNA为标记进行分子诊断。2008年Lawrie等发现在弥漫性大B淋巴细胞瘤（DLBCL）病人血清中发现了miR-21，说明其可以作为诊断标记物；同时大量的研究表明miRNA对肺癌、食道癌、乳腺癌等肿瘤具有指示作用。最后，由于miRNA的高度保守性，可以作为真核病毒、细菌和真菌感染的阴性排除；其基本原理就是寻找属间或者种间特异性miRNA为标记物，用来做排除性诊断。（四）长链非编码RNA（lncRNA）是一类长度大于200个核苷酸、不具有蛋白质编码功能的转录本。许多研究已经证实，lncRNA在多种类型的肿瘤中存在异常表达，在肿瘤发生、发展中起着致癌或抑癌作用，是肿瘤发生的一类重要因素。分析lncRNA的方法有表达芯片技术、实时定量逆转录。聚合酶链反应技术、原位杂交技术和RNA深度测序技术等。目前已在组织、血液、尿液和唾液等检材中检测到肿瘤相关lncRNA。因此，lncRNA有望成为新型肿瘤标志物应用于肿瘤诊断和预后判定。（五）基于核酸序列的扩增技术（Nucleicacid sequence-based amplification，NASBA）与常规PCR方法相比，基于核酸序列的扩增技术不需要热循环装备，采用等温扩增的方法扩增目标RNA以达到检测病原微生物的目的。该过程包括3个步骤，首先，一侧引物与靶RNA序列结合并在反转录酶的作用下产生cDNA单链；其次，用RNA酶H消化模板RNA，用另一侧引物与生成的cDNA链结合并在反转录酶的作用下生成双链cDNA；最后，用T7RNA聚合酶经过扩增程序生成RNA转录产物。NASBA方法特别适合致病菌RNA的检测，因为RNA聚合酶可直接用于扩增RNA而不需要先转录为cDNA。NASBA方法现在已经用于多种食源性致病菌的检测，结果表明，NASBA是一种灵敏、特异、快速的致病微生物检测方法。1.3 蛋白质分子诊断技术（一）蛋白质印迹法（Western blot）&&& 与Southern Blot或Northern Blot杂交方法类似，但Western blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。（二）免疫组化（IHC）&&& IHC是应用免疫学基本原理-抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术。抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。用于病理诊断的主要有免疫荧光法和免疫酶法。免疫荧光法是现代生物学和医学中广泛应用的方法之一，包括荧光抗体和荧光抗原技术，具有抗原抗体反应的特异性，染色技术的快速性，在细胞或组织上定位的准确性，以及荧光效应的灵敏性等优势。但是，由于免疫荧光法必须具有荧光显微镜，荧光强度随时间的延长而逐渐消退，结果不易长期保存等缺点，在普及应用上受到一定限制，而逐渐被免疫酶法所取代。（三）酶联免疫吸附（ELISA）&&& ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型：A：双抗体夹心法&&& 双抗夹心法是检测抗原最常用的方法，其原理是将特异性抗体结合到固相载体上形成固相抗体，然后和待检抗原结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记抗体，与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体-抗原-固相抗体复合物，加底物显色，判断抗原含量。操作步骤如下：1)将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。2)加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。3)加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。4)加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg，HBeAg，AFP，hCG等。&&& 此外双抗原夹心法也可用来检测抗体测抗体，反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。B：间接法&&& 间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体(抗人免疫球蛋白抗体)以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：1)将特异性抗
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