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即送15丁当
【原创】实战指南——免疫共沉淀篇（进阶）（未完结）
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初步接触COIP，以为自己懂了点，今天看到这个帖子，才明白自己什么都不懂，希望楼主能尽快总结一下完整的COIP流程，非常期待。
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在我们这个小领域三家最强的lab唯有我们敢于通篇基于这种检测手段___________________________楼主，对于“通篇基于这种检测手段”，我十分感兴趣，能否拜读下你们实验室的文章，或者推荐些这样大量基于此手段的文章，谢谢。
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bingxin1988 非常感谢楼主给出的宝贵经验，我也在做Co-IP,因为是第一次涉及，所以买了试剂盒，但还是遇到一些问题，被沉淀下来的蛋白量的趋势不正确；洗脱液的PH值对洗脱效果影响大吗？该如何设定呢？洗脱液可以酸或碱，一般kit给你的，不会有太大问题。
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mayanju 若要去除抗体的非特异性结合，可以preclear。具体怎么做？楼主的是直接加beads混合。好像有人还加入相应的IgG，请问，楼主有什么建议？谢!preclear的目的就是用未结合过蛋白的新beads随机结合蛋白，你加入IgG不是削弱了结合其它的机会。Honestly，preclear的效果非常一般
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楼主你好 麻烦请教一个问题 我最近在做内源性蛋白的互做研究 其中一个蛋白是最新发现的免疫相关蛋白 我们前期通过质谱分析发现该蛋白可能和某个信号通路蛋白存在互做 所以想用co-IP来验证一下 目前实验还算顺利 内源性正向反向co-IP都能得到相应的目的条带 但是我心中一直有疑虑就是 这个新发现的蛋白的抗体是我们实验室自己制备的 验证有IP效价 但是也能IP出来一些杂带 虽然现在正向反向的co-IP结果都拿到了 那我是否还需要从别的角度验证一下么 因为这个互作算是我们实验室第一次发现的 我总担心这个结果的可靠性 谢谢楼主
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楼主，请教您一个问题。我用内源性抗体coip组织研磨后的全蛋白，想用质谱鉴定coip拉下来混合蛋白中的差异性蛋白。coip后，煮沸制样，没有办法除去样品中的重链轻链，跑出来的胶银染后会有丰度很高的重轻链蛋白（超过其他蛋白的总量）。我担心这样打质谱时会掩盖掉其他的蛋白，不知道您有没有好的意见可以解决这一问题。（ps，细胞过表达系统中可以用tag抗体交联beads后洗脱解决，但是组织样本中无力啊……）
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老师你好，看了你的讲解，获益匪浅，现在IP 后 sliver staining background 比之前少太多了。十分感谢你的经验分享。还有一些问题，还望老师能进一步解答：我的目的蛋白用GFP tag, 质粒转染后建立稳定细胞系，目的是IP后做质谱，看目的蛋白的相互作用蛋白。老师之前提过质谱需要更大量的细胞，但是像我这样的外源性蛋白，也需要那么大量的细胞么？老师觉得应该用多少细胞量？裂解这些细胞，还是用1:1体积的裂解液么？我用的是MBL的anti-GFP beads, 针对以上的细胞量，我该用多少的beads?(或者抗体多少ug) 最后Glycine-HCl elute时用量多少？十分感谢老师，麻烦了。
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**版主发 膜蛋白IP方面的帖子！！！
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非常好，学习了！~
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您好，感谢您强大的整理和悉心的回复。拜读了您的帖子，新手一枚，望赐教。。前提：两种细胞，其中一种是稳转表达A-Flag 的细胞株（DDK），另一种是不表达Flag 的细胞株（wt）。IP 拉的是A，然后wb 检测B.C.D 等蛋白，以验证A 和B.C.D 有没有相互作用，因为我们实验室研究的A 蛋白目前没有文献报道它和谁有相互作用，也就是说我没有一个合理的阳性control。beads 用的是sigma M2 Flag Magnetic beads。方法一：用Hypotonic buffer 裂解细胞裂解液配方： Hypotonic buffer:Stock
Final concentration1 M HEPES [pH 7.9]
10 mM5 M NaCl
0.6 ml（高渗）/0.02ml （低渗）
300 mM/10mM1 M MgCl2
3 mM1 M dithiothreitol (15.4 mg/ml) fresh
1 mM1 mg/ml Aprotinin
1:10001 mg/ml Leupeptin
1:10001 mg/ml Pepstatin A
1:10000.1M Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)
9.13 ml/9.71ml
实验步骤：DAY1：1.
收集2个15cm dish 的 WT 及 2个15cm dish 的DDK细胞2.
各加入500ul Hypotonic buffer（0.6M NaCl 高渗），用1ml 针头抽吸10次。3.
冰浴30min，每5min 涡旋一次。离心：12000rpm，10min，4°C。取上清于新的ep 管中。4.
稀释4*，即各加入1500ul 低渗buffer。蛋白定量后（蛋白浓度一般2mg/ml），将wt 及DDK 蛋白调整至一致, 即总蛋白量一致，用（混合buffer-即高渗：低渗=1:3 补足体积）5.
取出30ul 作为input，加入10ul 4*loading buffer 后100°C金属浴煮5min。6.
取出20ul proetinA/G
beads，用PBST 洗3次后，加入20ul 混合buffer（高渗buffer：低渗buffer= 1:3），各取出10ul 于前述的蛋白裂解液中，4°C，旋转混合1h。7.
取出60ul sigma M2 flag beads，用TBS 洗三次后，加入1ml 3% BSA 封闭液，4°C，旋转1h。8.
将6中beads 和蛋白裂解液混合物取出，离心后，置于Rack（beads 均为磁珠，所以可以放在磁力架上），上清吸至另一个新的ep 管中。9.
将8中sigma
beads 取出后，置于Rack，吸走BSA封闭液后，加入300ul 混合buffer（高渗buffer：低渗buffer= 1:3），将beads 充分混匀后，各取出150ul 于8中两管上清液中。 4°C，旋转过夜。DAY2：10.
取出后，离心：4°C，500g，1min。 置于Rack，吸上清于新的ep 管中，加入loading buffer，100°C金属浴，8min，作为unbound。11.
在10中的beads 中进入1ml TBST（0.1%Tween-20），4°C，旋转10min。用TBST 洗3*10min。12.
最后一次吸走TBST后，离心：4°C，500g，1min。将残余的TBST液体吸走，加入20ul 2*loading buffer，100°C，3min，将富集的蛋白洗脱下来。置于Rack，将液体吸至一个新的ep管中，作为output。方法二：用RIPA buffer 裂解细胞。裂解液配方： 1M Tris-HCl pH7.5) 5 ml 50mMNaCl 0.87g 0.15 M0.5M EDTA(pH8.0) 0.8mlNonidet P40 1 ml （1%）Aprotinin10μg/μl 100μl 10μg/ml加水到 100mlwt细胞和ddk 细胞各 2个15cm dish 的cell pellet，分别加入3ml RIPA buffer裂解细胞，蛋白定量后，蛋白浓度分别基本为1-2mg/ml.
和方法一步骤基本相同，只是我所有的wash 步骤都是用的RIPA buffer（没有加入酶抑制剂）。在方法二中，我发现每次蛋白裂解液和beads 一起混合的时候，都能观察到beads 聚集到了一起，而不是均匀分散的，我想这个应该是您问中说的NP40 1%，使得染色质裂解出来的原因，然后裹住了beads。我想根据您上面的一些说法，我的蛋白浓度可能过低了。但是现在最大的问题是：理论上，如果A 和B 有相互作用，则在output 中, DDK 细胞应该有B，而wt 细胞，因为该细胞本身没有flag，应该没有东西被拉出来，所以应该是没有B 条带。而如果A和B 没有相互作用，则在output 中，DDK 和WT 细胞应该都没有B 条带出现。总之就是要么wt 和ddk 一起拉下来了B, 要么一起没有拉下来B。
这回事因为我最后一步没有洗干净吗？可是A 在WT 的output 中没有显示有啊。。重复了很多次了。。恳请赐教。。万分感激。。
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楼主，您好，我的实验也是要研究COIP中最难的，不是有无，而是关于量的多少的问题，我做了几次，前面两次是自己摸索的步骤，看过你的帖子之后 ，就做了些更改，也曝出来一些条带，但我不肯定我的步骤有没有错，也不知道这个结果会不会是假阳性，或者是抗体的重轻链的影响，因为我的B蛋白正好是在50KD左右。
现在把我实验的流程大体说一下，请您帮我分析分析。我的实验目的是验证蛋白A和B是结合在一起的，研究分别在两个处理因素的影响下，A和B之间结合量的变化，我一般分三组 C（未处理）H（处理因素1）R(处理因素2)，我培养的是原代心肌细胞，因为细胞的每一次消化都存在一定的误差，所以我每次都是将细胞均匀接种三个组培养后处理，因处理因素1和2会使一些细胞脱落。
关于细胞处理后进行裂解 ，我之前是培养一个100mm的皿后加入400ul的裂解液，脱落细胞明显比较多的话我会收集起来离心后用裂解液重悬后加入皿中（开始两次用的是碧云天的WB和coip裂解液，说是比较温和的，后面看了您的帖子之后改用根据您提供的配方自己配的裂解液，裂解液配好放在4度，使用前按照1:100加入酶抑制剂）。后面更改为同时培养2个100mm的皿各加入200u裂解液，我是用预冷的PBS洗一遍后，尽量吸净残余的液体，然后加入裂解液在冰上裂解15min后刮下细胞，在4度13000转下离心5min,取上清，分出大概20ul出来当作input,剩下的加入2ug抗A蛋白抗体（鼠来源）在4度上下摇床上过夜。
第二天先将santa cruz 的Protein G Plus-Agarose 用裂解液（前两次用的是PBS）洗三遍，然后用5%的BSA4度封闭4h(前几次)或者在室温封闭1-2h,然后用PBS或裂解液配成接近50%，按照1:10将珠子加入抗原抗体混合物中在4度摇床过夜（前两次）或者在室温1小时以上。然后离心去掉上清（留取部分跑电泳），留下下面的珠子，加入2*的loading buffer 和input蛋白及前面留取的蛋白一起煮沸5min.然后上样跑电泳，电泳及转膜应该是没有问题的，之前也跑出A和B蛋白。转膜之后我一般将膜剪开，分别用抗A抗体（兔来源）和抗B抗体孵育过夜，第二天暗室曝光。我前后对比出来的结果如下，我都是用抗A去拉下A，然后看A和B的表达量，因专门用来做COIP的抗B抗体还没到，所以我还没做用抗B去拉下B，对于这个结果我也不太肯定，不知道是否存在错误，所以想请楼主帮忙分析下，不胜感激。第一次结果
R 后面改进之后的结果： A蛋白input
IP后上清：C
R B蛋白(分组同上)问题1：我的这个实验过程有没有存在明显的错误?
2:我的实验目的是看组与组之间结合蛋白量的差别，实验过程中尽量控制细胞接种量一致，脱落的细胞回收裂解，然后加入一样的裂解液，加入同样量的抗体和珠子，但在实验过程中可以明显发现在吸去液体的过程中也会存在一定的误差，我这样做能使我最后得到的结果可靠吗（就是组与组之间的差异是否可靠）？我还需要改进哪些过程使得到的结果尽量可靠？
3：以您的经验判断，我得到的这个结果能说明问题吗？我还需要补充哪些内容？不好意思，一口气问了那么问题 ，因为刚接触，确实有很多不懂的，身边也没有人做过COIP的，所以也没有人可以交流，直到看到这个帖子，希望能到楼主或各位高手的指导。只能再次表示感谢！！！
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lynsunny edited on
本来我标注的是分别标注在图片上面相应的位置的，不知怎么回事发帖之后那些分组就连在一起了 ，我还不懂怎么直接在图上标注。只好再作一下说明，上面两个图的三个孔分别代表coip后的C 、H 、R组；下面的两个图一共有九个孔，前面三个代表的是input 的C 、H 、R组，中间有条带的三个孔代表coip的C 、H 、R组，后面三个孔是加入珠子结合抗原抗体复合物之后上清，分别是C 、H 、R组。虽然显得很罗嗦，但希望大家能看得明白，能够给我一些指导，谢谢。
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标记，赞啊
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请教楼主几个问题：①我构建的过表达质粒，检测表达时用sds裂解，能检测到很强的带，但是做IP时input都检测不到带，蛋白是在胞质中表达的，IP时没有超声。是因为裂解的不够充分吗？②楼主有没有用过乙酰化的抗体？我用的CST的抗体，第一次背景很高，第二次正常，再用的时候就没有条带了，新配制了还是不行，蛋白上样量都达到100ug了，还是没有条带。想问一下是不是跟上样量无关，是自己操作的问题吗？
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楼主，楼主，在哪啊 ，求回复。
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看了版主的帖子受益匪浅，我在做IP时有个疑问，想请教一下版主！我的目的条带在52左右，和重链的位置很接近，难以区分开，请问这个问题该如何解决？有没有办法可以去掉重链？盼回复！！！！！！！！！！！！
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非常感谢楼主愿意分享自己的宝贵经验，我还有问题需要请教， 洗脱液的PH值怎么确定，为什么有些人说低了洗不下来呢，我一直搞不懂CO-IP的洗脱原理是什么，最近做CO-IP的结果重现性很不好，一直在找原因，期望楼主不吝赐教！多谢了。
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请教下各位大神啊，我把一个带Flag标签的质粒转染进Hela细胞中，然后用anti-Flag的beads进行IP，但是拉不下来，这是怎么回事啊？求指教啊求指教！！！
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大神！！！！！
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你好，我想问下我现在做的是两种激酶的pulldown实验（体外纯化蛋白）。1.敢问这种瞬时反应，4度incubate的时间是不是不能太久了，否则结合后又分开了就看不到信号了，那多少时间合适呢？2.我用的IP buffer是500mM NaCl，我是应该调到200mM才可以哦3.质谱数据显示，截断C端底物的磷酸化信号强，所以老师让我用无C端的蛋白。我现在想是否会影响二者结合所以看不到信号。由于快毕业了所以最好不敢蛋白自身，用截断的蛋白做下去
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请问把使用过的已交联好抗体的beads洗干净重复用的具体步骤是啥？谢谢
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感谢分享经验。
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非常感谢楼主的无私奉献。万分感谢！！！
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斑竹您好，谢谢您的经验分享。目前，我们做coip遇到一个问题，就是ip的蛋白所有条带都会比input下移大约10kd,原先以为仅仅是目的蛋白条带下移有可能不是我们想要的结果，但是在曝了重轻链之后也发现比input下移，后来洗膜重新结合tubulin之后，tubulin也下移，连续做了很多次都是这样，而且都是几次独立实验。所以想请教斑竹，这个现象是怎么回事儿呀，还有该怎么改进才能去除这样的现象？
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楼主您好，谢谢您的IP分享！我现在想进行IP实验，但我的抗体的ISOTYPE 是IgG1K,如果用protein A/G-beads 可不可行，就是我的一抗可不可用，谢谢！
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你好，我用GST的标签融合表达一个目的蛋白，可是挂不上GST-AGROSE，于是我又用HIS融合表达了蛋白，用的载体是共表达载体pETDuet-1，在两个MCS中各插了一个ORF,共表达两个蛋白。随后我用Ni-NTA agrose做了蛋白纯化，很遗憾，有杂带，我考虑会影响接下来的IP。我是用外源蛋白去拉内源蛋白，外源蛋白就是从细菌表达系统中纯化的蛋白，我也考虑过你之前说的HIS做可能假阳性太多，可是我只能用anti-HIS来做桥梁，看能不能做出Co-IP,内源蛋白是昆虫细胞裂解液上清。我的目的是看纯化的蛋白和细胞裂解液会不会有相互作用。这涉及到毒素蛋白受体的钓取，这方面的研究论文有很多，大多是做验证。不巧的是，我用protein A/G没有拉下蛋白，连重链和轻链也没有。如果你有时间，请帮我看看，我不知道接下来要怎么做了。
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seasonin 你好，我用GST的标签融合表达一个目的蛋白，可是挂不上GST-AGROSE，于是我又用HIS融合表达了蛋白，用的载体是共表达载体pETDuet-1，在两个MCS中各插了一个ORF,共表达两个蛋白。随后我用Ni-NTA agrose做了蛋白纯化，很遗憾，有杂带，我考虑会影响接下来的IP。我是用外源蛋白去拉内源蛋白，外源蛋白就是从细菌表达系统中纯化的蛋白，我也考虑过你之前说的HIS做可能假阳性太多，可是我只能用anti-HIS来做桥梁，看能不能做出Co-IP,内源蛋白是昆虫细胞裂解液上清。我的目的是看纯化的蛋白和细胞裂解液会不会有相互作用。这涉及到毒素蛋白受体的钓取，这方面的研究论文有很多，大多是做验证。不巧的是，我用protein A/G没有拉下蛋白，连重链和轻链也没有。如果你有时间，请帮我看看，我不知道接下来要怎么做了。看上去楼主很忙，暂时无暇答疑了，理想复合体：昆虫细胞裂解液上清—Ni柱纯化蛋白—anti-His抗体—protein A/G。先要确认每个组件都是正常的，上图看看：1）昆虫细胞裂解液上清 WB结果，内源蛋白有较好表达；2）Ni柱纯化蛋白 SDS-PAGE图片，看蛋白大概纯度，不要太低；3）anti-His 和Ni柱纯化蛋白 WB，有强信号，验证抗体和蛋白结合良好。4）anti-His
IP Ni柱纯化蛋白后挂protein A/G，验证IP系统正常工作；如果1）~4）中间有问题，就先解决中间问题，再进行真正的Co-IP。
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xuzilin 看上去楼主很忙，暂时无暇答疑了，理想复合体：昆虫细胞裂解液上清—Ni柱纯化蛋白—anti-His抗体—protein A/G。先要确认每个组件都是正常的，上图看看：1）昆虫细胞裂解液上清 WB结果，内源蛋白有较好表达；2）Ni柱纯化蛋白 SDS-PAGE图片，看蛋白大概纯度，不要太低；3）anti-His 和Ni柱纯化蛋白 WB，有强信号，验证抗体和蛋白结合良好。4）anti-His
IP Ni柱纯化蛋白后挂protein A/G，验证IP系统正常工作；如果1）~4）中间有问题，就先解决中间问题，再进行真正的Co-IP。感谢你的关注！！1.我用的昆虫细胞并没有做转化，裂解液上清应该是细胞内的可溶胞浆蛋白，不知道裂解液中是否有膜蛋白，因为膜蛋白一般都难溶，我想探究目的蛋白的作用靶点，根据这一类保守蛋白估计受体会在膜上，以前用试剂盒提过细胞膜蛋白，因为缺乏评估，做了一次His pulldown，结果阳性和阴性条带一致，因此我觉得膜蛋白（如果操作正确）与His-agrose有非特异结合。而且提膜过程中有可能使膜蛋白变性了，因此我考虑还是用温和的细胞裂解液处理细胞，可能会好些。2.NI柱纯化共表达蛋白，在两条目的带之间有一条浓度和目的带相差不大的带，因此我又怕这条杂带会带来co-IP的假阳性，可惜实验结果连阳性都没有。3.anti-His与纯化蛋白暂时没做过WB4.anti-His IP Ni柱纯化蛋白后挂protein A/G，这个建议应该要尝试
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qingyunsongjun 斑竹您好，谢谢您的经验分享。目前，我们做coip遇到一个问题，就是ip的蛋白所有条带都会比input下移大约10kd,原先以为仅仅是目的蛋白条带下移有可能不是我们想要的结果，但是在曝了重轻链之后也发现比input下移，后来洗膜重新结合tubulin之后，tubulin也下移，连续做了很多次都是这样，而且都是几次独立实验。所以想请教斑竹，这个现象是怎么回事儿呀，还有该怎么改进才能去除这样的现象？ 可能由于input和IP产物盐离子浓度不一致造成input一般用5xloading稀释成1x 这误差不会很大用flag肽洗脱后的产物 pH值和盐离子浓度可能与lysis不一致另外很多人IP boiling的话 是直接用1xloading 其实管底可能还有一些lysis 这样加1x后 loading实际也会低于1x我一般用2xloading boilingpH值和盐离子浓度不一致 可能导致input和IP产物跑胶不齐
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shylook edited on
magicbunny 请教下各位大神啊，我把一个带Flag标签的质粒转染进Hela细胞中，然后用anti-Flag的beads进行IP，但是拉不下来，这是怎么回事啊？求指教啊求指教！！！ 信息太少了
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jacqueslm2001 1. 我不知道可不可以，有的蛋白可能行。总之，我起始的IP量大概是你的20-40倍。2. 我没用过脱氧胆酸钠。3. 很长时间了。重链显影有时候当内参。 lz很重视IP起始量 当然对MS 起始量大是很有帮助的但co-IP的话 我觉着起始量太多也不好这样做很容易夸大很弱的相互作用 尤其是通过DNA介导的间接相互作用（所以Co-IP最好先酶解DNA）很多蛋白相互作用很弱 一个10 cm dish也许检测不到但很多强的相互作用一个10cm dish 或者60cm dish或者6 pore板也是能检测到的一个同行告诉我 用半个10cm dish 做的MS 检测到了很强的（银染跟诱饵蛋白丰都相近）相互作用蛋白文章已经投了cancer cell修回我跟他做的一个基因
因为我发现过表达这个基因其实会有跟这个基因功能相反的结果所以做MS想找导致这个现象的相互作用蛋白其实是我先做MS 但死活没有发现能解释这个现象的蛋白（也就2个10cm dish）于是放弃了 最近碰到他 说半盘细胞做了MS就发现了 文章早已投出这个故事告诉大家 不要以为追求MS检出率我们要找的是强相互作用蛋白 就不需要太多起始量当然 也要靠运气！
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楼主你好，非常佩服你对技术掌握的娴熟。我做了一段时间泛素化，总也出不来，想讨教一下这方面有什么经验吗，比如，裂解蛋白的方法，上样量等，另外弱弱的求教一下，理论上泛素化带是不是都应该在目的蛋白分子量以上的位置。非常感谢！
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关于丁香园western blot图中,IP IB Flag 左边那些VEGFR-3-Flag,p85α-HA IB:Flag IB:HA我稍微有点明白了，但还是有几点不明白：（1）“从最右边看，表示细胞再转染了这三种质粒后，能够在细胞中表达”怎么看出来表达了?为什么要做lysate的westernblot图呢？（2）你说的看最右边、中间、左边的图是指最右边、中间、左边上下两个图对着比较吗？（3）你说的“研究片段”指的是SH2?(4 ) 还有拉不拉不出来怎么看？互相之间能被拉就是说有相互作用？比如说最左边的图是不是应该看左下图左右之间的条带粗细对比，中间的图是看中上图左右之间的条带粗细对比（5）‘相互作用的位点不在其SH2上“ 这个结论不懂，既然是缺失SH2的P85不能被VEGFR拉出，但正常的P85能被VEGFR拉出,不正说明了作用位点在SH2上吗？还望大神不吝赐教！菜鸟跪谢啦
IB是免疫印记、IP是免疫共沉淀、Flag和HA都是一种蛋白标签从最右边看,表示细胞再转染了这三种质粒后,能够在细胞中表达,最左边的图是用带有Flag标签的VEGFR拉p85及其研究片段,从图中可以看出,p85被拉出,而其研究片段没有被拉出,中间的图是反过来用p85及其研究片段拉VEGFR,同样可以看出p85可以把VEGFR拉出,而其研究片段没有被拉出,结论是VEGFR与P85存在相互作用,但是相互作用的位点不在其SH2上
这些概念我百度到了，主要是我不明白这图应该怎么看啊？
后边我说的很详细了，希望能帮到你
大神，能再帮我解答一下吧，问题有点多没法追问，我添加到问题里啦！谢谢！
能不能拉出来都需要对比着条带的位置去看，如果那个地方有条带，代表能拉的出来。做lysate的westernblot图是为了证明质粒是可以正常表达的，也就是说质粒是没有问题的，这是前提。
由于毕业太久了，对一些表示方法有些淡忘，这里更正一下，非常抱歉，结论应该是VEGFR与P85存在相互作用，相互作用的位点在其SH2上。非常抱歉
真的很感谢你耐心的解答！谢谢！
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