鉴定病毒中提取的核酸成分？
病毒中提取的核酸，如何最简单的方法来确定是DNA，还是RNA，是单链还是双链，请详细分析。
09-12-23 &
您好遗传与变异，是生物界不断地普遍发生的现象，也是物种形成和生物进化的基础。 微生物遗传学作为一门独立的学科诞生于40年代，病毒遗传学作为微生物遗传学的重 要组成部分，对于生物遗传和变异的研究起到了重要的促进作用，也为分子遗传学的 发展奠定了基础。病毒的许多生物学特性，包括结构简单、无性增殖方式、可经细胞 培养、增殖迅速、便于纯化等，使其具有作为遗传学研究材料的独特优势。? 众所周知，包括病毒在内的各种生物遗传的物质基础是核酸。事实上，这一结论 最初的直接证据正是来自于对病毒的研究。为了说明这一点，首先让我们回顾两个经 典的实验：①噬菌体感染试验：T2是感染大肠杆菌的一种噬菌体，它由蛋白质外壳( 约60%)和DNA核芯(约40%)构成，蛋白质中含有硫，DNA中含有磷。把?3?2P和?3?5S 标记T2， 并用标记的噬菌体进行感染试验，就可以分别测定DNA和蛋白质的功用。Hershey和 Chase(1952)在含有?3?2P或?3?5S的培养液中将T2感染大肠杆菌，得到标记的噬菌体， 然 后用标记的噬菌体感染常规培养的大肠杆菌，再测定宿主细胞的同位素标记，结果用 ?3?5S标记的噬菌体感染时，宿主细胞中很少有同位素标记，大多数的?3?5S标记噬菌 体蛋 白附着在宿主细胞的外面，用?3?2P标记的噬菌体感染时，大多数的放射性标记在宿主细 胞内。显然感染过程中进入细胞的主要是DNA。②病毒重建实验：烟草花叶病病毒 (tobacco mosaic virus，TMV)由蛋白质外壳和RNA核芯组成。可以从TMV分别抽提得 到它的蛋白质部分和RNA部分。Fraenkel?Courat(1956)实验证明，用这两种成分分 别接种烟草，只有病毒RNA可引起感染。虽然感染效率较低，但足以说明遗传物质为 RNA。Fraenkel?Courat利用分离后再聚合的方法，先取得TMV的蛋白质外壳和车前病 毒(Holmes Rib Grass Virus，HRV)的RNA，然后把它们结合起来形成杂合病毒，这种 杂合病毒有着普通TMV的外壳，可被抗TMV抗体所灭活，但不受抗HRV抗体的影响。当 用杂合病毒感染烟草时，却产生HRV感染的特有病斑，从中分离的病毒可被抗HRV抗体 灭活。反过来将HRV的蛋白质和TMV的RNA结合起来也得到类似的结果。目前已经能够由 许多小型RNA病毒和某些DNA病毒提取感染性核酸。如第四章所述，这些感染性核酸在 感染细胞以后，可以产生具有蛋白质衣壳和脂质囊膜的完整子代病毒。由脊髓灰质炎 病毒的RNA与柯萨奇病毒的衣壳构成的杂合病毒，在感染细胞后产生的子代病毒将是完 全的脊髓灰质炎病毒。以上事实说明，核酸是病毒遗传的决定机构，而蛋白质衣壳和 脂质囊膜不过是在病毒核酸遗传信息控制下合成或由细胞“抢来”的成分。这些成分 虽然决定着病毒的抗原特性，而且与病毒对细胞的吸附有关，在一定程度上影响着病 毒与宿主细胞或机体的相互关系，例如感染与免疫，但从病毒生物学的本质来看，它 们只是病毒粒子中附属的或辅助的结构。核酸传递遗传信息的基础在于其碱基的排列 顺序，病毒核酸复制时能够产生完全同于原核酸的新的核酸分子，从而保持遗传的稳 定性。但是，病毒没有细胞结构，缺乏独立的酶系统，故其遗传机构所受周围环境的 影响，尤其是宿主细胞内环境的影响特别深刻；加之病毒增殖迅速，突变的机率相应 增高，这又决定了病毒遗传的较大的动摇性——变异性。采用适当的选育手段，常可 较快获得许多变异株。应用各种理化学和生物学因子进行诱变，也能较快看到结果。 而病毒粒子之间以及病毒核酸之间的杂交或重组，又为病毒遗传变异的研究，开辟了 广阔前景。这些便利条件使病毒遗传变异的研究远远超出了病毒学本身的范围，成为 人类认识生命本质和规律的一个重要的模型和侧面。? 遗传和变异是对立的统一体，遗传使物种得以延续，变异则使物种不断进化。本 章主要论述病毒的变异现象、变异机理以及研究变异的方法和诱变因素等，关于病毒 的遗传学理论请参阅有关的专业书籍。? 病毒的遗传变异常常是“群体”，也就是无数病毒粒子的共同表现。而病毒成分， 特别是病毒编码的酶和蛋白质，又常与细胞的正常酶类和蛋白质混杂在一起。这显然 增加了病毒遗传变异特性鉴定上的复杂性。? 变异是生物的一般特性。甚至在人类尚未发现病毒以前，就已开始运用变异现象 制造疫苗。例如1884年，巴斯德利用兔脑内连续传代的方法，将狂犬病的街毒(强毒) 转变为固定毒。这种固定毒保留了原有的免疫原性，但毒力发生了变异——非脑内接 种时，对人和犬等的毒力明显降低，因而成功地用作狂犬病的预防制剂。此后，在许 多动物病毒方面，应用相同或类似的方法获得了弱毒株，创制了许多优质的疫苗。选 育自然弱毒变异株的工作，也取得了巨大成就。但是有关病毒遗传变异机理的认识， 则只在最近几十年来才有显著的进展。这不仅是病毒学本身的跃进，也是其它学科， 特别是生物化学、分子生物学、免疫学以及电子显微镜、同位素标记等新技术飞速发 展的结果。? 变异主要是指基因突变、基因重组与染色体变异。其中基因突变是产生新生物基因的根本来源，也就是产生生物多样性的根本来源。人类可以通过人工诱变的方法创造利用更多的生物资源，比如说辐射、激光、病毒、一些化学物质（常用的是秋水仙素）都可以产生变异。 而遗传则是变异后新物种繁育的必经方法，变异只有通过遗传才能使变异在下一代表现。 生物体亲代与子代之间以及子代的个体之间总存在着或多或少的差异,着就是生物的变异现象。生物的变异有些是可遗传的，有些是不可遗传的。可遗传的变异是指生物体能遗传给后代的变异。这种变异是由遗传物质发生变化而引起的。
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　　由许多核苷酸聚合而成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。最早由米歇尔于1868年在脓细胞中发现和分离出来。核酸广泛存在于所有动物、植物细胞、微生物内、生物体内核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸，简称RNA和脱氧核糖核酸，简称DNA。DNA是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础，RNA在蛋白质合成过程中起着重要作用，其中转移核糖核酸，简称tRNA，起着携带和转移活化氨基酸的作用；信使核糖核酸，简称mRNA，是合成蛋白质的模板；核糖体的核糖核酸，简称rRNA，是细胞合成蛋白质的主要场所。核酸不仅是基本的遗传物质，而且在蛋白质的生物合成上也占重要位置，因而在生长、遗传、变异等一系列重大生命现象中起决定性的作用。 　　核酸在实践应用方面有极重要的作用，现已发现近2000种遗传性疾病都和DNA结构有关。如人类镰刀形红血细胞贫血症是由于患者的血红蛋白分子中一个氨基酸的遗传密码发生了改变，白化病患者则是DNA分子上缺乏产生促黑色素生成的酷氨酸酶的基因所致。肿瘤的发生、病毒的感染、射线对机体的作用等都与核酸有关。70年代以来兴起的遗传工程，使人们可用人工方法改组DNA，从而有可能创造出新型的生物品种。如应用遗传工程方法已能使大肠杆菌产生胰岛素、干扰素等珍贵的生化药物。[编辑本段]核酸研究的历史　　核酸是怎么发现的？　　1869年，F.Miescher从脓细胞中提取到一种富含磷元素的酸性 化合物,因存在于细胞核中而将它命名为&核质&(nuclein)。核酸 (nucleic acids)，但这一名词于Miescher的发现20年后才被正式启 用,当时已能提取不含蛋白质的核酸制品。早期的研究仅将核酸看成 是细胞中的一般化学成分，没有人注意到它在生物体内有什么功能 这样的重要问题。　　核酸为什么是遗传物质？　　1944年，Avery等为了寻找导致细菌转化的原因，他们发现从S 型肺炎球菌中提取的DNA与R型肺炎球菌混合后，能使某些R型菌转化 为S型菌，且转化率与DNA纯度呈正相关，若将DNA预先用DNA酶降 解，转化就不发生。结论是:S型菌的DNA将其遗传特性传给了R型 菌，DNA就是遗传物质。从此核酸是遗传物质的重要地位才被确立， 人们把对遗传物质的注意力从蛋白质移到了核酸上。 　　双螺旋的发现　　核酸研究中划时代的工作是Watson和Crick于1953年创立的DNA 双螺旋结构模型。模型的提出建立在对DNA下列三方面认识的基础上：　　1.核酸化学研究中所获得的DNA化学组成及结构单元的知识，特 别是Chargaff于年发现的DNA化学组成的新事实；DNA中四 种碱基的比例关系为A/T=G/C=1；　　2.Ｘ线衍射技术对DNA结晶的研究 中所获得的一些原子结构的最新参数；　　3.遗传学研究所积累的有关 遗传信息的生物学属性的知识。综合这三方面的知识所创立的DNA双 螺旋结构模型，不仅阐明了DNA分子的结构特征，而且提出了DNA作 为执行生物遗传功能的分子，从亲代到子代的DNA复制 (replication)过程中，遗传信息的传递方式及高度保真性。其正确 性于1958年被Meselson和Stahl的著名实验所证实。DNA双螺旋结构 模型的确立为遗传学进入分子水平奠定了基础，是现代分子生物学 的里程碑。从此核酸研究受到了前所未有的重视。 　　对核酸研究有突出贡献的科学家　　沃森 　　Watson, James Dewey 　　美国生物学家 　　克里克 　　Crick, Francis Harry Compton 　　英国生物物理学家 　　日新月异的研究进展　　三十多年来，核酸研究的进展日新月异，所积累的知识几年就 要更新。其影响面之大，几乎涉及生命科学的各个领域，现代分子 生物学的发展使人类对生命本质的认识进入了一个崭新的天地。双 螺旋结构创始人之一的Crick于1958年提出的分子遗传中心法则 (centraldogma)揭示了核酸与蛋白质间的内在关系，以及RNA作为遗 传信息传递者的生物学功能。并指出了信息在复制、传递及表达过 程中的一般规律，即DNA→RNA→蛋白质。遗传信息以核苷酸顺序的 形式贮存在DNA分子中，它们以功能单位在染色体上占据一定的位置 构成基因(gene)。因此，搞清DNA顺序无疑是非常重要的。1975年 Sanger发明的DNA测序（DNAsequencing)加减法为实现这一企图起了 关键性的作用。由此而发展起来的大片段DNA顺序快速测定技术──Maxam 和Gilbert的化学降解法(1977年)和Sanger的末端终止法(1977年)， 已是核酸结构与功能研究中不可缺少的分析手段。我国学者洪国藩 于1982年提出了非随机的有序DNA测序新策略，对DNA测序技术的发 展作出了重要贡献。目前，DNA测序的部分工作已经实现了仪器的自 动化操作。凭借先进的DNA测序技术及其它基因分析手段，人类正在 进行一项以探明自身基因组(genome)全部核苷酸顺序（单倍基因组 含3×109碱基对)为目标的宏伟计划──人类基因组图谱制作计划 (human genome mapping project)。据称，此项计划的实现，将对 全人类的健康产生无止境的影响。 Watson-Crick模型创立36年后的1989年，一项新技术──扫描隧道 显微镜(scanning tummeling microscopy, STM)使人类首次能直接 观测到近似自然环境中的单个DNA分子的结构细节，观测数据的计算 机处理图像能在原子级水平上精确度量出DNA分子的构型、旋转周 期、大沟(major groove)及小沟(minor groove)。这一成果是对DNA 双螺旋结构模型真实性的最直接而可信的证明。此项技术无疑会对 人类最终完全解开遗传之谜提供有力的帮助。可喜的是，我国科学 家在这项世界领先的研究中也占有一席之地。[编辑本段]核酸的化学成分　　核酸是由什么组成的？　　核酸是生物体内的高分子化合物。它包括脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid,DNA）和核糖核酸（ribonucleicacid,RNA）两大类。DNA和RNA都是由一个一个核苷酸(nucleotide)头尾相连而形成的，由C、H、O、N、P5种元素组成。RNA平均长度大约为2000个核苷酸，而人的DNA却是很长的，约有3X109个核苷酸。　　核苷酸的组成有什么规律？　　单个核苷酸是由含氮有机碱(称碱基)、戊糖(即五碳糖)和磷酸三部分构成的。　　碱基(base)：构成核苷酸的碱基分为嘌呤（purine)和嘧啶 &（pyrimi-dine)二类。前者主要指腺嘌呤（adenine，A）和鸟嘌呤（guanine,G），DNA和RNA中均含有这二种碱基。后者主要指胞嘧啶（cytosine,C）胸腺嘧啶（thymine，T）和尿嘧啶（uracil,U），胞嘧啶存在于DNA和RNA中，胸腺嘧啶只存在于DNA中，尿嘧啶则只存在于RNA中。这五种碱基的结构如图。　　嘌呤环上的N-9或嘧啶环上的N-1是构成核苷酸时与核糖（或脱氧核糖）形成糖苷键的位置。　　此外，核酸分子中还发现数十种修饰碱基（themodifiedcomponent),又称稀有碱基，(unusualcomponent)。它是指上述五种碱基环上的某一位置被一些化学基团（如甲基化、甲硫基化等）修饰后的衍生物。一般这些碱基在核酸中的含量稀少，在各种类型核酸中的分布也不均一。如DNA中的修饰碱基主要见于噬菌体DNA，RNA中以tRNA含修饰碱基最多。　　戊糖(五碳糖):RNA中的戊糖是D－核糖(即在2号位上连接的是一个羟基)，DNA中的戊糖是D－2－脱氧核糖(即在2号位上只连一个H)。D－核糖的Ｃ－2所连的羟基脱去氧就是D－2脱氧核糖。　　戊糖Ｃ－1所连的羟基是与碱基形成糖苷键的基团，糖苷键的连接都是β－构型。　　核苷（nucleoside)：由D－核糖或D－2脱氧核糖与嘌呤或嘧啶通过糖苷键连接组成的化合物。核酸中的主要核苷有八种。　　核苷酸(nucleotide)：核苷酸与磷酸残基构成的化合物，即核苷的磷酸酯。核苷酸是核酸分子的结构单元。核酸分子中的磷酸酯键是在戊糖C-3’和C-5’所连的羟基上形成的，故构成核酸的核苷酸可视为3’－核苷酸或5’－核苷酸。DNA分子中是含有A,G,C,T四种碱基的脱氧核苷酸；RNA分子中则是含A,G,C,U四种碱基的核苷酸。　　当然核酸分子中的核苷酸都以形式存在，但在细胞内有多种游离的核苷酸，其中包括一磷酸核苷、二磷核苷和三磷酸核苷。　　类别 DNA RNA 基本单位 脱氧核糖核苷酸 核糖核苷酸 核苷酸 腺嘌呤脱氧核苷酸　　鸟嘌呤脱氧核苷酸　　胞嘧啶脱氧核苷酸　　胸腺嘧啶脱氧核苷酸 　　 腺嘌呤核苷酸　　鸟嘌呤核苷酸　　胞嘧啶核苷酸　　尿嘧啶核苷酸　　 碱基 腺嘌呤（A)　　鸟嘌呤（G)　　胞嘧啶（C)　　胸腺嘧啶（T) 　　 腺嘌呤（A)　　鸟嘌呤（G)　　胞嘧啶（C)　　尿嘧啶（U） 　　 五碳糖 脱氧核糖  核糖 酸 磷酸  磷酸  　　　核苷酸是怎么连接的？　　3’，5’－磷酸二酯键：核酸是由众多核苷酸聚合而成的多聚核苷酸（polynucleotide），相邻二个核苷酸之间的连接键即：3’，5’－磷酸二酯键。这种连接可理解为核苷酸糖基上的3＇位羟基与相邻5＇核苷酸的磷酸残基之间，以及核苷酸糖基上的5＇位羟基与相邻3＇核苷酸的磷酸残基之间形成的两个酯键。多个核苷酸残基以这种方式连接而成的链式分子就是核酸。无论是DNA还是ＲＮＡ，其基本结构都是如此，故又称DNA链或RNA链。DNA链的结构如下示意图。　　寡核苷酸（oligonucleotide)：这是与核酸有关的文献中经常出现的一个术语，一般是指二至十个核苷酸残基以磷酸二酯键连接而成的线性多核苷酸片段。但在使用这一术语时，对核苷酸残基的数目并无严格规定，在不少文献中，把含有三十甚至更多个核苷酸残基的多核苷酸分子也称作寡核苷酸。寡核苷酸目前已可由仪器自动合成，它可作为DNA合成的引物（primer)、基因探针（probe)等，在现代分子生物学研究中具有广泛的用途。　　核酸链的简写式：核酸分子的简写式是为了更简单明了的叙述高度复杂的核酸分子而使用的一些简单表示式。它所要表示的主要内容是核酸链中的核苷酸（或碱基）。下面介绍二种常用的简写式。　　字符式：书写一条多核苷酸链时，用英文大写字母缩写符号代表碱基（DNA和RNA中所含主要碱基及缩写符号见表１－１），用小写英文字母P代表磷酸残基。核酸分子中的糖基、糖苷键和酯键等均省略不写，将碱基和磷酸相间排列即可。因省略了糖基，故不再注解“脱氧”与否，凡简写式中出现Ｔ就视为DNA链，出现Ｕ则视为RNA链。以5＇和3＇表示链的末端及方向，分别置于简写式的左右二端。下面是分别代表DNA链和RNA链片段的二个简写式：　　5＇pＡpＣpＴpＴpＧpＡpＡpＣpＧ3＇DNA　　5＇pＡpＣpＵpＵpＧpＡpＡpＣpＧ3＇RNA　　此式可进一步简化为：　　5＇pＡＣＴＴＧＡＡＣＧ3＇　　5＇pＡＣＵＵＧＡＡＣＧ3＇　　上述简写式的5＇－末端均含有一个磷酸残基（与糖基的Ｃ－5＇位上的羟基相连）,3＇－末端含有一个自由羟基（与糖基的Ｃ－3＇位相连）,若5＇端不写Ｐ，则表示5＇－末端为自由羟基。双链DNA分子的简写式多采用省略了磷酸残基的写法，在上述简式的基础上再增加一条互补链（complentarystrand)即可，链间的配对碱基用短纵线相连或省略，错配（mismatch)碱基对错行书写在互补链的上下两边，如下所示：　　5＇ＧＧＡＡＴＣＴＣＡＴ3＇　　3＇ＣＣＴＴＡＧＡＧＴＡ5＇　　5＇ＧＧＡＡＴＣ错配）　　线条式：在字符书写基础上，以垂线（位于碱基之下）和斜线（位于垂线与Ｐ之间）分别表示糖基和磷酸酯键。如下图所示　　上式中，斜线与垂线部的交点为糖基的Ｃ－3＇位，斜线与垂线下端的交点为糖基的Ｃ－5＇位。这一书写式也可用于表示短链片段。不难看出，简写式表示的中心含义就是核酸分子的一级结构，即核酸分子中的核苷酸（或碱基）排列顺序。[编辑本段]核酸的相关分类　　核酸（nucleic acid）是重要的生物大分子，它的构件分子是核苷酸（nucleotide）。　　天然存在的核酸可分为：　　╭ 脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）　　╰ 核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）　　DNA贮存细胞所有的遗传信息，是物种保持进化和世代繁衍的物质基础。　　RNA中参与蛋白质合成的有三类：　　╭ 转移RNA（transfer RNA，tRNA）　　∣ 核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）　　╰ 信使RNA（messenger RNA，mRNA）　　20世纪末，发现许多新的具有特殊功能的RNA，几乎涉及细胞功能的各个方面。　　核苷酸可分为：　　╭ 核糖核苷酸：是RNA的构件分子　　╰ 脱氧核糖核苷酸：是DNA构件分子。　　细胞内还有各种游离的核苷酸和核苷酸衍生物，它们具有重要的生理功能。　　核苷酸由： 　　╭ 核苷（nucleoside）　　╰ 磷酸（Phosphonic.acid）　　核苷由： 　　╭ 碱基（base）　　╰ 戊糖（Pentose）　　碱基（base）：　　构成核苷酸中的碱基是含氮杂环化合物，由嘧啶（pyrimidine）和嘌呤（purine）构成。　　核酸：　　╭ 嘌呤碱 ：　　╭ 腺嘌呤
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应用聚合酶链反应（PCR）技术测定临床标本中的病原体核酸成分，是一种高度敏感，且最为直接的检测手段。由于临床标本中含有蛋白质、脂类等物质，可干扰PCR反应，故在做PCR反应前必须进行核酸提取。经典的核酸提取方法通常是加去污剂（SDS等）裂解细胞，经蛋白酶处理、有机溶剂提取及乙醇沉淀等步骤。由于样本的处理及保存对DNA和RNA（尤其是RNA）的影响较大，因此在核酸测定时标本的处理及适当保存对测定结果的准确有效非常重要。临床常见的标本有血清（浆）、全血、分泌物、棉拭子、脓液、体液、新鲜组织、石蜡切片等，这些临床标本的处理和保存方法各有不同。一、临床标本的处理1、血清（浆）标本  一些病原体，如乙肝病毒（HBV）、丙肝病毒（HCV）、人类免疫缺陷病毒（HIV）等的PCR检测常采用血清或血浆标本。HBV：标本通常由医护人员采集，应注意避免溶血，如为血浆标本注意抗凝剂的选 择，一般用EDTA-Na2或枸橼酸纳，不可使用肝素。标本为全血时，及时分离出血浆，提取病毒DNA进行检测。HCV：检测RNA病毒。由于RNA极易降解，标本的制备和保存方式往往可以影响测定结果。若用血浆标本，应使用EDTA抗凝。严禁使用肝素，因其对PCR扩增有抑制作用, 且无法在核酸提取过程中去除。抗凝后6小时内分离血浆。如用血清标本，则应尽快（2小时内）分离血清 进行检测，或-20oC保存。2、全血标本通常用来提取外周血单个核细胞核酸：如基因组DNA、线粒体DNA、总RNA等。抗凝剂：一般使用EDTA-Na2、枸橼酸纳，不使用肝素。前处理：1）加适量的红细胞裂解液（破膜液），裂解全血中的红细胞。2）再加适量的细胞核裂液（破核液），裂解白细胞中的细胞核，使核内DNA 释放出来。3）然后再加SDS（十二烷基硫酸钠）等去污剂，溶解脂蛋白，解聚核蛋白。     SDS可与蛋白 质结成复合物，使蛋白质变性沉淀，但SDS在以后的核酸提取过 程中必须除去。3、痰标本痰属于分泌物，临床上常用作结核杆菌DNA测定样本，由于痰标本中含大量粘蛋白和杂质，故在核酸提取时，一定要对标本进行前处理，即用4%NaOH液化，去除粘蛋白，然后用煮沸或蛋白酶、酚/氯仿等经典法提取DNA。具体方法：用无菌平皿取患者肺深部咳出的痰液1-3ml，↓加入4倍体积4%NaOH，摇匀，室温下放置30分钟左右液化↓取1.5ml EP管，加0.5ml 液化痰液，再加0.5ml 4%NaOH室温放10分钟↓12000 rpm，离心15分钟↓弃上清，加无菌生理盐水1 ml ，混匀，12000rpm离心5分钟↓弃上清，沉淀物用于 DNA提取。4、棉拭子 用PCR方法检测性病病原体时（衣原体、支原体、淋球菌、梅毒螺旋体、人乳头状瘤病毒等），临床标本一般为棉拭子。标本取材是关键，衣原体等病原体感染上皮细胞，因此取材一定要取到细胞。具体方法：加1ml无菌生理盐水，充分震荡混匀，12000rpm ，离心5分钟用棉拭子取尿道分泌物或宫颈分泌物（由医护人员采集），置无菌试管或EP管内弃上清，沉淀加无菌生理盐水1ml，打匀，12000rpm，离心5分钟具体方法：加1ml无菌生理盐水，充分震荡混匀，12000rpm ，离心5分钟↓用棉拭子取尿道分泌物或宫颈分泌物（由医护人员采集），置无菌试管或EP管内↓弃上清，沉淀加无菌生理盐水1ml，打匀，12000rpm，离心5分钟↓同上，重复洗涤一次↓弃上清，沉淀即可用于DNA提取。5．体液体液标本，包括胸水、腹水、脑脊液、尿液等，可直接离心，取沉淀物提取核酸。血性胸腹水，可使用红细胞裂解液处理：加等体积红细胞裂解液，震荡混匀，置5-10分钟↓10000rpm，离心5分钟，弃上清↓可根据情况重复2-3次，沉淀物用于DNA提取。6．脓液粘稠脓液：同痰标本处理，先用4%NaOH液化，再离心取沉淀提取DNA。 水样脓液：直接离心，沉淀用生理盐水洗2-3次后用于DNA提取。7．组织组织有新鲜组织和石蜡切片。新鲜组织的处理步骤：先用生理盐水洗二次，然后将其捣碎或剪碎（用眼科剪），加蛋白酶K消化后提取核酸。石蜡切片用于核酸提取，需先用二甲苯脱蜡，再用蛋白酶K消化后进行DNA提取。二、标本的保存1、血清（浆）HBV：分离出的血清（浆）如不立即提取核酸，保存于-20℃待检。HCV：尽快分离血清(浆), 如不立即提取RNA， 保存于-20℃待检。长期保存：吸取200μl血清，加20u RNasin（RNA酶抑制剂），保存于-70℃。已发出结果报告的标本应及时转移至冰箱保存，并由专人负责管理，保存1-2周（时间长短根据报告单上的承诺而定）。2、全血标本全血标本如用于DNA提取，可4℃下短期保存（数天），时间长易降解，如用于RNA检测，应在取血后尽快提取RNA。最好将DNA或RNA提取后，置-70℃保存。3、痰 液化的痰标本如不立即用于核酸提取，可保存于-20℃。处理后的棉拭子、体液、脓液如不立即用于核酸提取，可保存于-20℃。4、组织新鲜组织最好保存于50%乙醇中，具体方法：先用生理盐水将组织洗一次，切成小块，加入适量生理盐水，然后边摇边加入无水乙醇至终浓度为50%，这样固定的组织标本室温下可保存数日，4℃可保存6年。 总而言之，标本的保存及适当的预处理对核酸模板的成功提取具有决定性作用。要强调的是，所有用于上述处理的容器如试管或离心管，均应在使用前压灭菌。三、核酸的提取核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在，核酸提取的主要步骤为：裂解细胞去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。沉淀核酸纯化核酸，去除盐类，有机剂等杂质(一)DNA提取的经典方法  DNA提取的经典方法，即所谓的酚-氯仿提取法。因为使用两种不同的有机溶剂交替抽提更容易将蛋白除去，提取次序为酚、酚/氯仿（1：1）、氯仿，这种方法提取的DNA纯度高、片段大、效果好，缺点是较为繁琐。说明：回收上层水相时，一定不要接触两相的界面，以免将蛋白质等物质吸入新离心管。沉淀DNA，无水乙醇是首选的有机溶剂。另：异丙醇、醋酸钠等。70%乙醇漂洗DNA，是为了去除残余的盐类，去除过量SDS和酚等杂物，因为SDS在70%的乙醇中保持溶解状态，不与DNA共沉淀，从而通过弃上清液去除这种去污剂,避免对以后PCR反应的影响。TE缓冲液：10mmol/L Tris-Hcl         1mmol/L EDTA pH 8.5或 8（二）RNA的提取 RNA提取条件较DNA要求严格，主要是因为临床标本及实验室环境中，存在大量对RNA有强烈降解作用RNase。RNase是一类生物活性非常稳定的酶类。这种酶耐酸、耐碱、耐高温，如煮沸也不能使之完全失活。蛋白质变性剂可使之暂时失活，但变性剂去除后，又可恢复活性。除细胞内RNase以外，环境中灰尘、各种实验器皿和试剂、人体的汗液及唾液中均存在RNase，因此在提取RNA时，关键要避免RNase对标本的污染及防止RNase对提取的RNA的降解。1．提取RNA所用器皿的处理及溶液的准备塑料制品：如试管、EP管、Tip头，使用灭菌的一次性用品。玻璃用品：如烧杯、试管和其他用品，常被RNase污染，使用前必须于180oC干燥8小时以上，或用0.1%DEPC水(焦碳酸二乙酯)浸泡处理。DEPC是RNase的强抑制剂，作用机制是通过与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白质变性。37℃浸泡2小时，然后用灭菌水漂洗数次，于100℃干烤15分钟，去除器皿上残余DEPC。 所需溶液的配制：必须用高压灭菌的水和RNA提取专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，把溶液装入无RNase的玻璃器皿。严格来说，所有溶液均应用0.1%DEPC于37℃处理12小时以上，然后于100℃加热15分钟或高压灭菌15分钟，去除残余DEPC。2．RNA提取中RNase污染的控制最主要的潜在污染源是操作人员的手，手直接触摸之处毫无疑问会留下RNase，另外，说话带出的唾液也富含RNase，故在涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套和口罩。RN A提取方法下面以异硫氰酸胍结合氯仿-酚提取法介绍RNA的提取。异硫氰酸胍是一种强用力的蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离。RNase虽可耐受多种处理，（如煮沸）而不失活，但却会被4mol/L异硫氰酸胍和-β巯基乙醇（破坏RNase蛋白质中的二硫键）等还原剂所灭活，因而可从组织中分离出完整RNA分子。因此上述试剂是制备RNA的常规试剂。200μl血清（浆）↓加入200μl 20%PEG6000↓4oC，3小时，12000rpm，4℃离心15分钟↓弃上清，加500μl裂解液（含异硫氰酸胍、-β巯基乙醇等），混匀↓加50μl NaAc，500μl饱和酚：氯仿：异戊醇（50：49：1），充分混匀，冰浴10分钟↓4℃12000rpm，离心5分钟↓小心吸取上层水相移至一新离心管中，避免吸取两相之间的蛋白质，用氯仿-异戊醇再抽提一次↓加2.5倍体积无水乙醇，冰浴30-60分钟↓4℃12000rpm，离心10分钟↓弃上清，沉淀用70%乙醇洗二次，65℃烘干↓用10μl DEPC水溶解RNA，并加2u RNasin↓-20℃保存备用。（三）核酸提取的其他方法(简单介绍):胍盐提取结合二氧化硅吸附法二氧化硅具有特异吸附核酸的特性，异硫氰酸胍可使细胞裂解,因此在高浓度异硫氰酸胍存在下，从细胞(包括细菌)或病毒颗粒中释放出来的核酸成分可以结合在二氧化硅上，利用此特性可提取血液和尿液中DNA和RNA。2.TRIzol试剂提取RNA方法：TRIzol试剂盒是由GIBCO BRI公司推出的产品，其操作方法简单方便，一小时内即可完成。用TRIzol试剂裂解细胞，再加入氯仿，离心后可见三层，上层为透明的水相含有RNA，中间层含DNA，下层为红色的有机相，含蛋白质。3.旋转离心柱提取旋转离心柱技术是用于微量核酸分离纯化的较为简单的方法，属于硅吸附方法的一种，市场上的离心柱虽各有特色，但在原理上通常可分为三个部分：利用裂解液促使细胞破碎，使细胞中的核酸释放出来。把释放出的核酸特异地吸附在特定的硅载体上，这种载体只对核酸有较强的亲和力和吸附力，对其他生化成分如蛋白质、多糖、脂类则基本不吸附，因而在离心时被甩出柱子。把吸附在特异载体上的核酸用洗脱液洗脱下来，分离得到纯化的核酸。此法也可用于DNA测序前核酸的纯化，又叫过柱纯化。  旋转离心柱技术具有广泛的发展前景，该产品可应用于生物学、遗传学、免疫学、考古学、法医学等各方面的基因分析。实验中，如接触了“脏的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能污染RNase，因此RNA提取实验中，应勤换手套。
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